Hodowle komórkowe

Są wykorzystywane w biologii, inżynierii, medycynie.

1 Zastosowanie hodowli komórek i tkanek:

• system modelowy do badań podstawowych procesów biologicznych i biochemicznych, interakcji pomiędzy komórkami, do badań nad czynnikami wywołującymi choroby, efektów wywoływanych przez leki, do badań procesów starzenia

• badania nad nowotworami

• wirusologia – do diagnostyki wirusologicznej, do detekcji i izolacji wirusów itp.

• Testowanie cytotoksyczne do badań efektów wywoływanych przez nowe leki, kosmetyki, związki chemiczne na przeżywalnośc i wzrost różnych typów komórek, do ustalania optymalnych dawek leków

• Produkcja szczepionek

• Inżynieria genetyczna

• Genetyka prenatalna

• Terapia genowa

• Poszukiwanie oraz opracowywanie nowych leków

• Rozród wspomagany

2 In vivo – w organizmie

In situ – w naturalnej lokalizacji, miejscu występowania

In vitro – poza organizmem (łac. w szkle)

Ex vivo – materiał biologiczny jest pozyskiwany z żywego organizmu w celu jego modyfikacji in vitro i ponownego podania z powrotem do organizmu, z którego go pozyskano

Ex mortus – pozyskiwanie materiału ze zwłok

3 Hodowla komórek – utrzymanie przy życiu komórek poza ich naturalnym środowiskiem (in vitro) przez umieszczenie ich w odpowiednich pożywkach. (czasem nie da się zmusić do proliferacji)

4 Hodowle tkanek:

• hodowla komórek – bez wytworzenia wyżej zorganizowanych struktur

• hodowla tkanek – hodowla określonej tkanki

• hodowla organotypowa – embrionalne zawiązki narządów jak i całe narządy pobrane z dojrzałego organizmu

5 Hodowla pierwotna – zapoczątkowana pobraniem komórek lub tkanek bezpośrednio z organizmu.

Linia komórkowa – hodowla uzyskana po przeniesieniu hodowli pierwotnej do odrębnego naczynia.

Ustalona linia komórkowa – komórki wielokrotnie pasażowane.

6 Linie ciągłe (continous cell lines) – linie o nieograniczonym czasie życia:

• komórek nowotworowych

• komórek immortalizowanych (unieśmiertelnianych) poprzez transfekcję np. małpim wirusem SV40

Linie półciągłe – wywodzą się z tkanki płodowej ludzkiej i zwierzęcej.

Linie komórek prawidłowych:

• tylko komórki diploidalne

• prawidłowe chromosomy

7Linia komórkowa diploidalna – 75% lub więcej komórek ma diploidalną liczbę chromosomów.

Linie heteroploidalne – o zróżnicowanej ploidii (np. linie nowotworowe o nieograniczonym czasie wzrostu) – mniej niż 75% komórek ma diploidalną liczbę chromosomów

Klon komórkowy – populacja komórek wywodząca się z jednej komórki macierzystej i powstała na drodze jej wielokrotnych podziałów.

Szczep komórkowy – wyprowadzony z hodowli pierwotnej lub linii komórkowej poprzez wyodrębnienie komórek o określonej, utrzymującej się charakterystyce.

8 Kokultury – hodowla mieszana: hodowla dwóch lub więcej rodzajów komórek oddziaływujących na siebie (korzystniejsze do badań, w jednym naczyniu kilka rodzajów komórek, interakcje między komórkam)

9 Zalety hodowli tkanek:

• kontrola środowiska (pH, temperatura, ciśnienie osmotyczne, ciśnienie O₂ i CO₂)

• możliwość utrzymania warunków fizjologicznych na stałym poziomie

• możliwość bezpośredniego eksperymentowania na komórkach

• możliwość badania funkcji i reaktywności poszczególnych typów komórek budujących tkanki

• możliwość bezpośredniego badania interakcji poszczególnych typów komórek wchodzących w skład tkanek i narządów

• powtarzalność wyników badań

• koszt przeprowadzenia badań in vitro znacznie niższy niż na zwierzetach

10 Ograniczenia hodowli tkanek:

• konieczność utrzymania stałej aseptyki

• hodowla tkanek – system znacznie upraszczający naturalne środowisko

• masowe namnażanie komórek (biotechnologia) pociąga za sobą duże koszty

• niestabilność wielu linii ciągłych

• zakładanie hodowli jest często żmudne i czasochłonne, a komórki maja krótki okres przeżycia

Klasy laboratoriów mikrobiologicznych

1 Poziomy bezpieczeństwa biologicznego (BSL – BioSafety Level)

• BSL – 1 low risk microbes

• BSL – 2

• BSL – 3

• BSL – 4 high risk microbes

2 BSL – 1

Laboratoria pracujące z czynnikami:

• dobrze zdefiniowanymi

• nie wywołującymi chorób u zdrowych, dorosłych osób

• stanowiącymi minimalne zagrożenie dla pracowników i środowiska

np. Bacillus subtilis, Naegleria gruberi, psi wirus zapalenia wątroby, E. coli

3 Nie wolno:

• pić, jeść, żuć gumy

• używać kosmetyków

• kłaść płytek, preparatów na zeszyty, książki lub inne rzeczy, które zabiera się do domu

Należy:

Myć ręce, nosić fartuch i jednorazowe rękawiczki i okulary (w razie potrzeby)

4 Materiał biologiczny zawsze traktujemy jako potencjalne źródło zakażenia, dlatego:

• zużyte szkło laboratoryjne zatapiamy w detergencie

• dezynfekujemy stoły laboratoryjne

• niczego co miało kontakt z drobnoustrojami nie wrzucamy do śmietnika

• zużyte, ostre przedmioty lab wrzucamy do specjalnego pojemnika

spinamy długie włosy

5 BSl – 2

Laboratoria przeznaczone do pracy z czynnikami o umiarkowanym ryzyku dla personelu i środowiska:

• wywierającymi wpływ na organizm człowieka

• sporadycznie wywołującymi poważne skutki

• dla których istnieją zabezpieczenia profilaktyczne i metody terapii w przypadku zaistnienia oddziaływania

Ryzyko zakażenia:

• droga pokarmowa

• poprzez błony sluzowe

• poprzez uszkodzoną skórę

np. wirus odry, salmonella, toxoplazmoza, wirus żółtaczki typu B

w rękawiczkach nie wolno odbierac Tel ani dotykac innych przedmiotów, które mogłyby ulec skażeniu

6BSL – 1 +

Laboratorium oddzielone od głównego szlaku komunikacyjnego w budynku, niedostępne dla osób trzecich i opatrzone charakterystycznym symbolem.

7 Wymagania:

• jednorazowe rękawiczki oraz okulary ochronne w razie potrzeby

• fartuchy laboratoryjne, które zostają w laboratorium

• wyposażenie: komora laminarna klasy II, autoklaw

8 BSL – 3

Laboratoria przeznaczone do pracy z czynnikami:

• infekcyjnymi, mogącymi wywołać poważne schorzenia lub zgon po ekspozycji na drogi oddechowe

• oddziaływującymi w sposób poważny lub śmiertelny

• praca z mało poznanymi czynnikami zakaźnymi dla których nie zawsze istnieją zabezpieczenia profilaktyczne lub metody terapii w przypadku wystąpienia oddziaływania

9 Czynności prowadzące do powstania zakażonego aerozolu:

• namnażanie większych ilości wirusów, bakterii

• przygotowywanie szczepionek

10 BSL – 2 + ściśle kontrolowany dostęp do laboratorium + osobne wejście + podwójne drzwi (śluza przejściowa) + komora laminarna klasy III

11 BSL – 4

Laboratoria przeznaczone do pracy z czynnikami:

• zakaźnymi, które wywołują śmiertelne choroby

• wysoce zakaźnymi

• przenoszonymi drogą wziewną

12 BSL – 3 + laboratorium w osobnym budynku, otoczone strefą ochronną + własne generatory prądu + własna oczyszczalnia ścieków

13 Laboratorium hodowli komórek in vitro (BSL -2):

• czystość

• autentyczność

• stabilność

14 Czystość

Największe zagrożenie dla kultur komórkowych:

Mikroorganizmy:

• śmierć komórek

• ryzyko dla innych hodowli komórkowych

15 Autentyczność

• przypadkowe zmienne hodowli komórkowej

• kontaminacja pomiędzy hodowlami komórkowymi

błędne wyniki badań,

utrata wyników badań

Przed przystąpieniem do pracy z kolejną linią komórkową powierzchnia stołu laminarnego musi być dokładnie wyczyszczona i zdezynfekowana. Tylko jedna linia komórkowa może znajdować się pod stałem laminarnym w danym czsie.

16 Stabilność

Starzenie się komórek

zmiany genetyczne i/lub zmiany fenotypu

w celu zminimalizowania efektów spowodowanych starzeniem się komórek dana linia kom powinna być wymieniona na nową po max 15 pasażu.

17 Organizacja i wyposażenie

Cel: zapewnienie sterylnych warunków hodowanym komórkom i tkankom

1. przestrzeń jałowa

2. przestrzeń „czysta” – przygotowywanie roztworów

3. przestrzeń brudna - zmywalnia

4. przestrzeń cytologiczno – biochemiczna – wykonywanie badań, obróbka cytologiczno - biochemiczna

19 Urządzenia laboratoryjne

Destylarki – czystość wody monitorowana jest przez pomiar………

Lodówki, zamrażarki - -30˚C zamrażarki, głębokiego zamrazania 0d -70 do -90˚C, surowice, enzymy, rozcieńczone roztwory hormonów białkowych w -20˚C, długookresowe przechowywanie hormonów białkowych i linii komórkowych - 70˚C lub ciekły azot

Inkubator CO₂

Zapewnienie kontroli:

• temperatury

• stężenia CO₂

20 sterylizator (autoklaw)

wirówki

mikroskopy – mikroskop odwrócony

21 komora laminarna

Wydajność filtrów HEPA: 99,999% dla cząstek o wielkości 0,3 µm

22 lampy UV 365 mm 254mm

łaźnia wodna

inne urządzenia: mini komory, mini wstrzasarki

23 Sterylizacja i dezynfekcja

Czynniki fizyczne:

• sterylizacja na mokro (autoklaw, 1,2 atm,120˚C, 20 min)

• sterylizacja na sucho (piec, 180˚C, przez 60 min)

Związki chemiczne:

• halogenki

podchloryn sodu (Clorox)

1. wysoce skuteczny

2. silnie żrący

3. powoduje korozję sprzętu (bardzo efektywnie przeżera żeliwne rury kanalizacyjne)

4. środki dez zawierające fenol – nie niszczą kwasów nukleinowych (nie zalecane)

Rozpuszczalniki: 70% etanol skuteczny jedynie w immersji, szybko paruje i kontakt z materiałem dez jest krótki, zaleca się stosowanie 70% izopropanolu

Detergenty:

• skuteczne w dezaktywacji wirusów posiadających otoczki lipidowe

• najefektywniejsze są detergenty zawierające jod np. Betasept