Metody hodowli drobnoustrojów:
Pożywki- płynne, pół płynne lub stałe mieszaniny związków chemicznych, w których lub na których rozwijają się drobnoustroje.
Warunki jakie powinny spełniać pożywki:
- odpowiednia ilość składników pokarmowych ( źr. C, N, soli mineralnych)
- odpow. ciśnienie osmotyczne i pH
* acidofilne (pH ≤5,4) np. Lactobacillus spp., grzyby
* neutrofilne (pH 5,4-8,4) np. większość bakterii, optimum=7
*alkaloifile (pH 7-11,5) np. Vibriocholerae
- klarowność
- jałowość
- odpowiednio dobrana temperatura inkubacji
* psychrofile (15-20 °C)
* mezofile (30-37 °C)
* termofile (52 °C)
- odpowiednio dobrana atmosfera
* bezwzględne beztlenowce -Clostridium haemoliticum
* względne beztlenowce -E. coli
* mikroaerofile - Helicobacter pylori
* bezwzględne tlenowce - Micrococcus spp., Pseudomonas spp.
Czynniki zestalające:
AGAR:
- otrzym. z glonów morskich-w handlu dostępny w postaci włókien lub proszku
- upłynnia się w temp. 90-100 °C, a zestala w 45-48 °C
- chemicznie jest polisacharydem- galaktonem, zaw. m. in. Galaktozę
-nie jest środkiem odżywczym, a jedynie czynnikiem zestalającym
ŻELATYNA:
- otrzym z odpadków rzeźnych
- subst białkowa bogata w kolagen
- upłynnia się w temp 25-27 °C, a krzepnie powoli w 18-10 °C
- wykorzystywana przez drobnoustroje o właściwościach proteolitycznych
INNE:
Żel krzemionkowy, surowica krwi, jaja:
-rzadko stosowane
RODZAJE POŻYWEK
I ze względu na skład:
- naturalna -skład ilościowy i jakościowy znany w przybliżeniu i przygotowane z surowców roślinnych lub zwierzęcych
-półsyntetyczne - znamy tylko skład zw. nieorganicznych
-syntetyczne- dokładnie znamy skład jakościowy i ilościowy
II z względu na konsystencje:
- płynne: bulion mózgowo-rdzeniowy (BHI), bulion trypozowo-sojowy (TSB)
- półpłynne - dodatek 0,1-0,8% agaru
- stałe - dodatek 1,5-3% agaru lub 12-15% żelatyny
III ze względu na jakość i ilość składników odżywczych:
- proste - bulion zwykły i woda peptonowa
- wzbogacone-z dodatkiem krwi, surowicy lub innych składników zaw. dodatkowe czynniki wzrostu, np. bulion cukrowy, bulion z krwią, Muller-Hintar agar
- wybiórcze- zaw składniki hamujące jedną bakterie a tworzące korzystne warunki dla innej, np. bulion z żółcią dla Salmonelli, pożywka SF Wg Leifsona dla Salmonelli i Shigelli
- różnicujące-często wybiórczo-róznicujące- umożliwia określenie swoistych cech biochemicznych gat drobnoustrojów. Składa się z podłoża odżywczego, substratu dla bakterii, wskaźnika np. agar SS, pożywka Chapmana, pożywka McLonkeya
-specjalne- z dodatkiem cukrów lub innych specyficznych substratów, np. pożywka Loewensteina-Jensena, Lofflera, Sabouranda, agar czekoladowy
- transportowe stałe lub półpłynne, stos przy przesyłaniu materiału klinicznego do laboratorium. Zawierają sole min i bufory, które zabezpieczają żywotność drobnoustrojów obecnych w materiale, bez wpływania na ich skuteczność
- transportowo-wzrostowe- służą do bezpiecznego transportu materiału oraz namnażania bakterii
- do hodowli balerii beztlenowych- są wzbogacone i maja zdolność redukcji tlenu cząsteczkowego, np. podłoże z trioglikolanem sodu
CHARAKTERYSTYKA WYBRANYCH PODŁOŻY:
podłoża krwawe (np. krew barania)
alfa - hemoliza - powodująca lizę ale nie rozpuszczająca błony krwinek co daje, że hemoglobina przechodzi w metahemoglobinę, zazielenienie podłoża do koła koloni
Streptococcus Pneumoniae
beta - hemoliza - powoduje lizę i rozpuszczenie błony komórkowej (erytrocytu) co daje odbarwienie do okoła koloni
Streptococcus pyogenes
Streptococcus aureus
E. colli
gamma - hemoliza - brak hemolizy
Micrococcus luteus, Streptococcus mutans
Podłoże MacConkey'a
Bakterie dla których podłoże jest przewidziane: Pałeczki jelitowe należące do rodziny Enterobacteriaceae (E. Colli, Klebsiella Pneumoniae,)
Czynnik wybiórczy: fiolet krystaliczny i sok z żółci
Czynnik różnicujący: laktoza
Pałeczki rozkładające laktozę tworzą kolonie o barwie ciemnoróżowej (indykatorem jest czerwień obojętna). E.colli, Klebsilla pneumoniae
Pałeczki nie fermentujące laktozy tworzą kolonie o barwie białawo - przezroczystej Shigella spp, Pseudomonas spp. Hamuje G(+) i te G(-), które maja duże wymagania odżywcze
Podłoże Chapmana
Bakterie dla których podłoże jest przewidziane: służy do izolacji i różnicowania szczepów gronkowcowych. Staphylococcus
Czynnik wybiórczy: 7,5 - 10% stężenie NaCl
Czynnik różnicujący: mannitol
Szczepy rozkładające mannitol wytwarzają żółte kolonie, przy czym ulega również zmianie zabarwienia podłoża z różowego na żółty (indykatorem jest czerwień fenolowa). S. aureus
Szczepy nie mające zdolności do rozkładu mannitolu nie zmieniają barwy kolonii.
Na tym podłożu mogą rosnąć mikrokoki, enterokoki, laseczki oraz grzyby.
Podłoże Lowensteina-Jensena(w formie skoku): pożywka specjalna do hodowli prądków,zawiera: asparaginę glicerol, mąka ziemniaczana, masa jajowa zieleń malachitowa, która hamuje wzrost bakterii.
Podłoże Loefflera (w formie skosu) do hodowli o dużych wymaganiach - pożywka specjalna. Corynebacterium spp., Neiseria. Zawiera bulion wzbogacony glukozą, surowicą końską
Podłoże z cetrymidem PYA do izolacji pałeczek z rodziny Pseudomonas
Cetrimid hamuje wzrost bakterii G(+) i większości G(-). Pseudomonas na tym podłożu wytwarzają barwnik (od piocyjaniny do piowerdyny) oraz charakterystyczny zapach (jaśmin lub kredki świecowe)
Podłoże agar czekoladowy - podłoże specjalne przeznaczone dla bakterii o dużych wymaganiach pokarmowych. Zawiera krew baranią, która po ogrzaniu do temp. 60-80 C ulega lizie i uwalnia się składnik hemina (czynnik X) i NAD (czynnik V). Dzięki obecności tych czynników umożliwia wzrost pałeczek Heamophilus, Neisseria
Podłoże z żółcią i eskaliną do izolacji i identyfikacji enterokoków. Mogą wzrastać wobec żółci i mają zdolność do hydrolizy eskaliny (powstaje zaczernienie podłoża). Mogą wzrastać też inne ziarniaki (brak zaczernienia podłoża).
Podłoże z tioglikolanem sodu - obniża potencjał oksydoredukcyjny, błękit metylowy - wskaźnik redoks (w formie utlenionej zabarwienie niebieskie, zredukowany odbarwia się)
Podłoże Sabouranda - podłoże wybiórczo-namnażające dla grzybów. Dodatek antybiotyków i kwasowe pH hamują wzrost bakterii.
podłoże chromogenne - kolonie różnych gat. i rodzajów przybierają rożną barwę w zależności od wł. biochem.
Wzrost drobnoustrojów na podłożach stałych:
(na płytkach, skosach i w słupkach)
-na podłożach stałych w hodowlach płytkowych drobnoustroje tworzą kolonie.
KOLONIA- widoczne gołym okiem skupisko kom. Rozwijają się najczęściej z pojedynczej kom bakteryjnej
CFU -colony family unit = TKJ- tworzące kolonie jednostek -jednostka wzrostowa kom bakteryjnej poch z jednej kom. Wyjściowej. Jednostka taka mnożąc się na podłożu stałym utworzy poj kolonie
Cechy koloni bakteryjnej:
Wymiary
Kształt (okrągły, owalny, wydłużony…)
Barwa
Powierzchnia
Wyniosłość
Brzegi
Przezroczystość
Zapach
Zawieszalności w płynach
Wzrost drobnoustrojów na podłożach skośnych:
Na agarze skośnym drobnoustroje nie tworzą koloni
Wzrost:
-wzdłuż linii posiewu
-po całej powierzchni skosu (bakterie ruchliwe lub wydzielające dużo śluzu)
Określa się;
-charakter wzrostu (jednolity, rozlany, postrzępiony)
-intensywności wzrostu (obfity, skąpy)
- niektóre cechy diagnostyczne koloni (barwa, zapach, powierzchnia)
Wzrost drobnoustrojów hodowli kłutej
W hodowlach słupkowych ocenia się niektóre właściwości drobnoustrojów:
-ruchliwość
-upłynnienie żelatyny (wzdłuż nakłucia, całkowicie)
- stosunek drobnoustrojów do tlenu
POSIEW REDUKCYJNY - posiew z izolacją- posiew w celu uzyskania pojedynczej kolonii bakteryjnej
Wzrost drobnoustrojów na podłożach płynnych
-jednolita zawiesina-zmętnienie pożywki-wzrost dyfuzyjny
-skupisko na ściankach -Streptococcus
- kożuszek, błonka
-osad
-w pewnym oddaleniu od podłoża- mikroaerofile