11. Enzymy wykorzystywane w inżynierii genetycznej.
Enzymy są wytwarzane w komórkach żywych organizmów jako katalizatory organiczne (biokatalizatory) przemian biochemicznych. Są nimi przeważnie białka, rzadko cząsteczki RNA tzw. rybozymy lub kompleksy złożone z RNA i białka. W inżynierii genetycznej wykorzystuje się enzymy podzielone na trzy grupy: Enzymy modyfikujące białka- proteazy; Enzymy modyfikujące DNA: enzymy restrykcyjne i metylazy, inne nukleazy, fosfatazy, kinazy i ligazy, topoizomerazy i rekombinazy, polimerazy DNA; oraz enzymy modyfikujące RNA: polimerazy RNA, RNA-zy.
Jeżeli chodzi o enzymy modyfikujące białka wykorzystywane są tzw. proteazy (peptydazy) są to hydrolazy odpowiedzialne za hydrolizę wiązań peptydowych. Wyróżnia się proteazy często przecinające oraz specyficzne. Do wymienionych jako pierwsze zalicza się enzymy takie jak:
- trypsyna (proteinaza serynowa zaangażowana w trawienie)
- proteinaza K (proteinaza serynowa Tritirachium album, przecina białka za resztami alifatycznymi i aromatycznymi)
- proteaza alkaliczna (proteinaza serynowa, aktywna powyżej pH 9)
Wyróżnia się także proteazy specyficzne, takie jak:
- proteaza TEV (proteaza cysteinowa )
- czynnik Xa (proteinaza serynowa przekształcająca protrombinę w trombinę)
- właściwe proteazy specyficzne (proteaza ludzkiego Rhinowirusa i fuzyjne białko GST)
- proteaza cysteinowa
- trombina (proteinaza serynowa przekształcająca fibrynogen w aktywną formę tworzącą fibrynę);
2) Inna grupą są enzymy modyfikujące DNA.
-Najistotniejszymi dla inżynierii genetycznej enzymami (stanowiącymi jeden z podstawowych narzędzi I.G) sa należące do tej grupy enzymy restrykcyjne tzw. Restryktazy. Są to bakteryjne enzymy pełniące w komórce funkcje ochronną DNA przed zakażeniem przez bakteriofaga. Restryktazy wykorzystuje się w inżynierii genetycznej w celu włączania obcego materiału do DNA komórki oraz w badaniach zmienności genetycznej i wykrywania szkodliwych mutacji. Rozcinają one nici DNA, w wyniku rozpoznania określonej sekwencji nukleotydów w pobliżu miejsca rozcięcia. Rozpoznawany odcinek może mieć różną długość, ok. 4 do 8 nukleotydów. Restryktaza może rozpoznawać ściśle określoną sekwencję.W wyniku cięcia przez restryktazy na łańcuchu DNA mogą powstawać końce „lepkie” (gdy obie nici DNA są rozcięte w różnych miejscach) lub „tępe” końce (cięcie w tym samym miejscu).
-Innymi enzymami stanowiącymi element obrony własnego DNA są metylazy. Rozpoznają one te same miejsca co restryktazy. Metylują każdą nić na specyficznej pozycji tworząc np. 4-metylocytozyne. Metylowane DNA nigdy więcej nie ulega restrykcji.
-Przykładem „innych nukelaz” jest enzym Nukleaza Mung Bean i S1 nukleaza, sa to endonukleazy specyficzne dla jednoniciowego kwasu nukleinowego (bardziej ssDNA niż ssRNA). Usuwają lepkie końce dzięki czemu tworzy się tępe końce.
- Ligaza in vivo bierze udział w replikacji i naprawie DNA. Katalizuje tworzenie wiązań fosfodwuestrowych pomiędzy nukleotydami w łańcuchu DNA. Substratem jest dwuniciowy DNA a także hybrydy DNA-RNA. Może łączyć nici DNA o tępych końcach jednakże proces ten jest mało wydajny. Ligaza wykorzystywana jest do łączenia dwóch nici DNA między końcem 5’ (grupa fosforanowa) a końcem 3’ (grupa hydroksylowa). Najpowszechniej wykorzystuje się ligazę T4, która wymaga do działania ATP, Mg i DTT. Charakteryzuje się szerokim zakresem temperatury działania.
- Enzym kinaza polinukleotydowa (PKN) katalizuje transfer reszty fosforanowej z ATP na 5‘ koniec DNA i RNA.
- Topoizomeraza II wprowadza negatywne superskręty do DNA poprzez nacięcie dwóch nici i następnie ponowne połączenie wiązaniem fosfodwuestrowym.
-Wśród polimeraz wyróżniamy polimerazę DNA I (polimeraza Kornberga), polimerazę DNA I (fragment Klenowa), polimerazęDNA T4 i T7, Taq i Pfu oraz odwrotną transkryptaze. Najistotniejszymi z nich względem inżynierii genetycznej jest polimeraza Pfu (Pyrococcus furiosus)-posiada aktywność 3’5’ egzonukleazy (proof-reading) przez co cechuje się największą wiernością replikowanych fragmentów DNA (8x105).Polimeraza Pfu wymaga wyższego stężenia magnezu i wyższego pH niż polimeraza Taq.
3) Wśród enzymów modyfikujących RNA stosowanych w inżynierii genetycznej wyróżnia się polimerazy (RNA T7, RNA T3, RNA SP6) oraz rybonukleazy.
-Najistotniejszą polimerazą jest polimeraza RNA T7 pochodzi ona od rekombinanta E.coli, stosowana jest do syntezy transkryptów RNA z sekwencji pod kontrolą promotora T7 oraz do sekwencjonowania RNA.
- Rybonukleaza (RNaza) przecina fosfodwuestrowe wiązania 3’ przy pirymidynach. Nie wykazuje żadnej właściwości w stosunku do DNA. Enzymy te stosowane są do usuwania RNA z preparatów DNA.