Inzynieria genetyczna roslin i jej wykorzystanie w rolnictwie
Gatunbki modelowe roślin w badaniach genetycznych
Zielenica, toczek (org wielokomórkowy), rzodkiewnik pospolity, tyton, geoch, ryż siewny
Najczesciej wykorzystywany jest rzodkiewnik - dlaczego? Bo ma niewielki genom, dobrze poznany, precyzyjne mapy fizyczne i genetryczne wszystkich 5 chromosomow, ktorki cykkl zyciowy (6 tygodni od kiełkowania można uzyskac nasiona), wysoka plodnosc( do 5000 nasion na roślinę), samopylnosc, wysoka podatność na transformację z zastosowaniem systemu Agrobacterium tumefaciens, duza dostepnosc zmutowanych linni rzodkiewnika
Rozmiary genomow roślinnych i człowieka
Rzodkiewnik wielkoisc genomu 125, ryz 466, kukurydzxa 2 500, groch 4 800, pszenica 16 000, paris japonica 150 000, homo sapiens 3 000
Totipotencja (zdolność komorek do różnicowania się) , komórki somatryczne roślin zachowują totipotencję w ciągu całego zycia rosliny, co ulatwia uzyskiwanie organzimow zmodyfikowanych genetycznie ( GMO)
Woprowadzanie obcych genow do komorek roślinnych
Etapy otzrymywania rosliny transgenicznej
Wybor genu, który ma zostać wprowadzony do genomu rosliny
Przygotowanie konstruktu genowego i jego klonowanie w komorkach e coli
Wprowadzanie konstruktu genowego do komórki roślinnej
Regeneracja transformowanych roślin
Sprawdzenie intergracji,ekspresji,stabilności i spsoobu dziedziczenia się wprowadzonego genu
Etapy otrzymywania rosliny transgenicznej:
- wybor genu, który ma zostać wprowadzony do genomu rosliny
- wprowadzony gen powinien być pozbawiony intronów, żeby ta sekwencja która wsprowadzam była jak najkrotsza
- przygotowanie konstruktu genowego, klonowanie w komorkach e coli
Wektor powinien zawierac: sekwencje regulatorowe: promotor i sekwnecja termiantora np. promotor wirusa mozaiki kalafiora ( CaMV 35S) lub promotory tkankowo i organowo specyficzne np. promotor genu patatyny ulegający ekspresji w bulwach
Gen markerowy – pozwala wyselekcjonować komórki bakteryjne lub organzimy roślinne, które przyjely konstrukt genowy, najczesniej stosowane geny markerowe to geny odpowrnosci nba atybiotyki(kanamycyna, neomycyna, chloramfenikol) lub herbicydy (fosfinotrycyny, glifosat)
Gen reporterowi – umozliwia wczesne wykrycie ekspresji wprowadzonych genow w organizmie rosliny np. beta-glukuronidaza (GUS) z e coli, lucyferazę ze świetlika, bialko GFP z meduzy wykrywanie przy pomocy metod histochemicznych, fluorymetrycznych lub molekularnych
Swkencje umozliwiajace wydajną repliklację w komorkach e coli np. sekwencja pBR322 ori
Transoformacja roślin: wektorowa(agrobasterium tumefaciens,agrobacterium rhizogenes) i bezwektorowa (makroiniekcja, mikroiniekcja, elektroporacja, metoda chemiczna, mikrowstrzeliwanie, wlkona krzemowo-karbidowe)
Wektorowa transformacja roślin:
- niektóre bakterie glebowe z rodzaje Rhizobium wykazują zdolność do wbudowywania swojego DNA plazmidowego do genomu rosliny
- najczesniej wykorzystuje się gatunki agrobacterium tumofaciens i agrobacterium rhizogenes
- a tumefaciens posiadaja plazmid Ti którego przenieisenie do rosliny powoduje tumorowate narosla
-obecne w plazmidzie Ti geny umozliwiaja infekjcję komorek roślinnych zmiane ich metabolizmu oraz zmiany fenotypowe
Fragment plazmidu ti tzw T-DNA dlugosc ok 23 kpz, który po zakazeniu ulega intergracji z genomnem rosliny
Zawiera geny syntezy opin – zrodla wegla i azotu dla bakterii zyjacych w przestrzeniach miedzykomorkowych rosliny a także geny odpowiedzialne za biosynstezę cytokinin i auksyn, stymulujących podzialy stransformowanych komorek co umozliwia powstanie tumoru
Na koncach t-DNA znajduja się krótkie sekwencje graniczne 24-25 kpz : lewa (LB) i prawa (RB) niezbędne do intergracji T-DNA z genomem gospodarza
Po usunieciu onkogenów, T-DNA można wykorzystać jako wektor do prowadzania genow do roślin niezbede sa sekwencje graniczne pomiędzy nimi umieszcza sie wprowadzony gen
Zalety metody wektorowe: najczesniej stosowana, najstarrsza i najwydajniejsza meotda transformacji komorek roślinnych, niskie koszty, nieiwelkka liczba kopii transgenu przenoszona do genomu rosliny, stabilna intergracja z genomem
Wady: początkowo mogą być uzywana jedynie dla roślin dwuliściennych, gdyż rosliny jednoliścienne w tym zboza, sa odporne na infejkcję agrobacterium, obecnie opracowano metody transformacji gatunkow jednoliściennych, infekcja oslabia zdolności regeneracyjne roślin
Meotdy bezwektorowe
Makroiniekcja – polega na wstrzykiwaniu wodnego roztworu plazmisu w rozwijającym się kwiatostanie roślin w stadium przedmejotycznym, prowadzony gen znajduyje się w nasionach
Mikroiniekcja- wprowadzanie plazmidowego DNA do jader komórkowych
Przy wprowadzaniu DNA bardzo przydatne sa protoplasty, czyli komroki roślinne pozabiowne sciany komórkowej uzyskane poprzez inkubację tkjanki roślinnej w roztworze zawierający enzymy cellulolityczn i pekttynolityczne, sole mineralne, i substacnje regulujące potencjal osmotyczny
Elektroporacja – polega na wporwadzneiu DNA do protoplastów za pomocą impulsów elektrycznych przez powstałe pory w blonie protoplastu DNA wnika do wnętrza komórki, wydajność tej metody wynosi 2-8 %
Metoda chemiczna – polega na inkuybacji protoplastoiw z plazmidowym DNA w obecności jonow magnezu i glikolu polietylenowego, który obniza napiecie powierzchniowe blony, umozliwiajac wnikniecie konstruktu genowego, wydajności metody wynosi 0,1-12%
Włókna krzemowo-karbidowe – wytrząsanie kalusa, komorek zawiesionowychy lub zarodkow w obecności DNA i wlokien, które mechanicznie uszkadzają sciany komórkowej i ulatwiaja penetrację do wnętrza komorek
Mikrowstrzeliwanie – polega na wstrzeliwaniu do komorek roślinnych mikropociskow z wolframu lub zlota, oplaszczonych wektorami
Wady metod bezwektorowych: brak ochrony DNA biorcy przed uszkodzeniami, wporwadzanie wielu kopii transgenu do genomu biorcy, w przypadku niektórych metod wysoka smiertelnosc komorek
Etaoy otrzynywania rosliny transgenicznej
Regeneracja transformowanych komorek celem uzyskania kompletnie wykształconych roślin
Konstrukt genowy wprowadzany jest do pojedynczych komorek lub tkanek czy organow, z których latwo jest zregenrrowac całe rosliny
Sprawdzenie intergracji, ekspresji, stabilności i sposobu dziedziczenia się wpriowadzonego genu
Po uzyskaniu rosliny transgenicznej wymagane jest sprawdzenie metodami molekularnymi obecności prowadzonego DNA: metoda PCR, hybrydyzacja typu Southern(czyli specyficzna sonda wykrywający interesujące nas dna)
Wykorzystanie roślin transgenicznych:
-odpornosci roślin na herbicydy
- skuteczniejsza ochrona przezd zachwaszczeniem i mniejsza uciazliwosc dla srodoiwksa
- odmiany soi, kukurydzy i innych roślin odpornych na glifosat
- odmiany soi, rzepaku, i innych roślin odporne na gluyfosynat
Odpornosc roślin na choroby i szkodniki
Odpornosc na choroby grzybowe uzyskuje się wprowadzając genu odpowiedzialne za syntezę chitynaz lub beta-1,3-glukanaz rozkladajacych sciany komorkwoe
Żaden mechanizm nie zapewni trwalej ochrony na skutek ciaglej ewolucji patogenow
Odpornosc roślin na szkodniki i choroby
Odporność na szkodniki np. wprowadzenie genow Bt z bacillus , kodujacycy bialka Cry, które w przewodznie pokarmowym owadow zerujących na roslinie transgenicznej ulegaja częściowemu rozkładowi przez proteazy, uwalniając aktywną toksynę. Bialka Cry sa specyficzne wobec określonych gatuynkow owadow, takich jak motyle, cmy, muchy, komary, chrząszcze, np. ziemniaki nierwazliwe na stonkę ziemnaczaną i kukurydza odpornana stonkę kukurydzainą
Zmiana pokroju rosliny i zwiększenia plonow
Zwiększenie produkcji ziaren przez zboza, wprowadzenie genu NORIN10 do zboza powoduje skaracanie i wzmacnianie łodyg roślin – bardziej odporne na urazy mechaniczne. W wyniku zahamowania wzrostu elongacyjnego części wegetatywnych roślin dochodzi do lepszego rozwoju części generatywnych roślin i wzmożonej produkcji nasion
Podniesienie odporności roślin na stres abiotyczny : wiele obszarow ziemi wylaczono z uzytkoiwania ze wzgled na suszę, wysokie zasolenie lub silnie zasadowy odczyn gleby
Gen tolerancji na wysokie zasolenie z mangrowców umozliwia roślinom transgenicznym znsic duże zasolenie
Transgeniczne rosliny z nadprodukcją kwasu cytrynowego w korzeniach które wykazują wieksza tolerancję na glin w glebie
Przykład: słonecznik odporny na szuszę,m mrozy i zasolenie gleby
Podniesienie wartości odżywczej i smakowej roślin
Wprowadzenie genow kodujących określone bialka może wyleminowac niektóre choroby związane z nieodborem mikroelementow lub witamin
Transgeniczny ryz (wproiwadzoen geny z żonkila), który wyjazyhe zwiększoną produkcję beta karotenu, proekursora witaminy A, co powoduje zolte zabarwienie nasion
Polepszenie innych właściwości uztkowych roślin: modyfikacja procesow fizjologicznych związanych z dojrzewaniem owocow może przedluzyc ich trwalosci oraz ulatwic skladowanie
Zmodyfikowanie genetyczne pomidora poprzez wprowadzenie genu kodującego syntetazę spermidyny z drozdzy przedluzylo trwalosc pomidora
Biorekatory : transgeniczne rosliny jako bioreaktory – do produkcji antybiotykow, enzymow, ludzkich hormonow i szczepionek
Np. produkt bialka krwi- produkowane w :ziemniak, tyton
Szczepionki- ziemniak, tyton,
Hormony- tyton
Cytokininy i czynniki wzrostowe- tyton, ryz, ziemniak, mszaki,