Biofilm prof. dr hab. Waldemar Dąbrowski

Biofilmy tworzą drobnoustroje przytwierdzając się do powierzchni na styku dwóch faz
Biofilmy tworzone być mogą na, praktycznie, każdej wilgotnej powierzchni
Biofilmy tworzone są najszybciej w układach, gdzie jest stały dopływ składników odżywczych

Biofilmy to:
zróżnicowana zbiorowość drobnoustrojów, występująca zwykle na powierzchniach stałych, zazwyczaj wielogatunkowa,
chroniąca formy ją tworzące i sprzyjająca ich namnażaniu Mikroorganizmy posiadają, zwykle, osłonkę syntezowanych przez siebie zewnątrzkomórkowych polisacharydów

Biofilny mogą tworzyć się:
na stałych nawilżonych powierzchniach
na powierzchni tkanek żywych organizmów
na powierzchni styku: faza wodna - powietrze
Jednymi z bardziej typowych miejsc powstawania biofilmów są:
- skały (rafy) i inne twarde powierzchnie (kamienie, kadłuby statków) w środowisku morskim i słodkowodny.

Biofilm utworzony przez mieszaną hodowlę Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens Klebsiella pneumoniae. (mikroskop laserowy- 6 um grubości) - odcinek = 10 um.

Biofilm złożony z organizmów: auto- i heterotroficznych
* Glony (algi) czerpią energię z procesu fotosyntezy; źródłem C - CO2.
* Bakterie - głównie heterotrofy- czerpią energię z materii organicznej, której źródłem są glony lub materiał spłukiwany do jeziora z lądu.

Naturalny biofilm na ziarenkach piasku - in the clog mat of a septic system infiltration mound.
Biofilm złożony z:
cząsteczek mineralnych,
różnych mikroorganizmów,
siateczki śluzu lub glikokaliksu (strzałki) , która wiąże mikroorganizmy i cząsteczki

Glony - większe, okrągłe formy zielone - brązowe

Bakterie - mniejsze ciemne komórki przytwierdzone do glonów.

Oba typy komórek tworzą zewnątrzkomórkową warstwę śluzu otaczającą komórki. Komórki + polisacharydowe śluzy = biofilm.

The ability of oral bacteria to store iodophilic polysaccharides or glycogen-like molecules inside their cells is associated with dental caries since these storage compounds may extend the time during which lactic acid formation may occur. It is this prolonged exposure to lactic acid which results in decalcification of tooth enamel.

Do powierzchni, które bakterie mogą kolonizować zaliczają się również nasze ciała: zęby, migdałki czy wszelkiego rodzaju implanty, na przykład sztuczne zastawki serca.

Korzystne działanie biofilmów:
* uzdatnianie środowiska
** punkty uzdatniania wody
** oczyszczalnie ścieków, wód zrzutowych poprzez eliminację
patogenów i materii organicznej

Drobnoustroje bytujące w biofilmach

• Są bardziej oporne na działanie antybiotyków i dezynfektantów

• Są bardziej oporne na niekorzystne warunki środowiskowe

• Są trudno usuwalne mechanicznie z powierzchni na której występują

• http://www.youtube.com/watch?v=fOodzEAgyKw

Niekorzystne działanie biofilmów - medyczne:
Zagrożenie dla zdrowia pacjentów z implantami, cewnikami, itp.
powód nawracających infekcji - tworzenie się mieszanych biofilmów na sztucznych powierzchniach tworzonych przez implant, cewnik, itp..,

Glikokaliks, którym osłonięta jest bakteria:
chroni ją przed działaniem antybiotyków
jest powodem uporczywości infekcji nawet przy zmasowanej chemoterapii
bakterie w osłonce biofilmu może być 50 - 1000 razy bardziej oporna na stosowane chemoterapeutyki niż ta sama - wolno żyjąca

Mechanizm zwiększonej oporności nie jest znany

Niekorzystne działanie biofilmów - technologiczne

• Powstawanie biofilmów w przetwórniach żywności powoduje uporczywe zanieczyszczanie produktów bakteriami z biofilmu,

• Powstawanie biofilmów na powierzchniach metalowych jest powodem korozji mikrobiologicznej

Etapy powstawania biofilmu w środowisku wodnym:

* adsorbcja składników odżywczych
* wyszukanie i zbliżanie się komórki do zasiedlanej powierzchni (wici, pili)
* asocjacja- wstępna faza adhezji (faza odwracalna)
* adhezja (przytwierdzanie) - trwały związek między komórką a powierzchnią
* kolonizacja - tworzenie mikrokolonii
* produkcja egzopolimerycznych związków stanowiących osłonę przed nieko-
rzystnymi czynnikami środowiska - tworzenie trójwymiarowego biofilmu
egzopolisacharydy
alginian - Pseudomonas
kwas cholowy - E.coli
osłabienie cechy hydrofobowej ściany na korzyść wytwarzanych biosurfaktantów

Zdolność tworzenia biofilmu jest cechą kodowaną genetycznie swoistość genów
* przytwierdzanie się innych organizmów - tworzenie mikrośrodowisk

Cechy biofilmu

Charakterystycznym dla biofilmów jest to, iż występuje w nich mieszanina stanów metabolicznych. Bakterie na obrzeżach wykazują przejawy życia, takie jak np. wzrost.

Komórki położone w głębszych warstwach są żywe, ale „uśpione” (znajdują się w stanie anabiozy). Główną przyczyną zmiany w metabolizmie komórki bakteryjnej jest zróżnicowanie środowiska chemicznego w obrębie biofilmu oraz ograniczony dostęp do składników odżywczych (np. odmienne stężenie tlenu w miejscach odległych niż w warstwie zewnętrznej).

Wskutek tego, jedna komórka bakteryjna może wyglądać i zachowywać się zupełnie inaczej niż druga, nawet jeśli obie są genetycznie identyczne.

Miejscowe warunki wpływają również na wytwarzanie przez bakterie wielu toksyn i innych substancji wywołujących objawy choroby. Czasami bakterie jednego gatunku żywią się zbędnymi metabolitami bakterii innego gatunku, z korzyścią dla obu.

Inną charakterystyczną cechą bakterii tworzących biofilm, która odróżnia je od osobników niezwiązanych, jest ich ogromna odporność na antybiotyki

Komunikacja interkomórkowa
Pozytywna - np. jakościowe i ilościowe zróżnicowanie substratu
Letalna - bakteriocyny,
wyżeracze (E.coli i Micrococcus xanthus)

Podtrzymuje warunki fizyko-chemiczne sprzyjające rozwojowi biofilmu Wytwarzany egzopolisacharyd może być materiałem zapasowym i ochronnym
Nabywanie przechodnich składników genetycznych (Plazmidy Transpozony)

Drobnoustroje tworzące najczęściej biofilm E.coli Pseudomonas sp

Biofilm epilityczny = biofilm tworzony na powierzchni wód

Mikroorganizmy tworzące biofilm powierzchniowy
bakterie - algi - sinice -- grzyby

Rozmieszczenie mikroorganizmów w biofilmie zależy od:

* tolerancji na światło
* rodzaju powierzchni
* obecności POM i FPOM

Mikrobiologiczni mieszkańcy biofilmów tworzą wielokomórkowe zbiorowiska w których w zależności od miejsca występowania drobnoustroju w biofilmie odgrywają one różne funkcje.

Tworzenie biofilmów przez drożdżaki zależy od:

Szczepu (szczepy patogenne tworzą biofilmy łatwiej niż niepatogenne)

Struktury podłoża

Stabilności fazy płynnej ( gdy faza płynna jest ruchoma powstaje większy biofilm)

Składu pożywki

Powstawanie biofilmu
Pierwszy krok
spontaniczne tworzenie się warstwy związków organicznych (aminokwasy i inne substraty pokarmowe).
Zdjęcie z pod mikroskopu elektronowego (x 2 600).

Białe ślady = zdrapana warstwa osadów organicznych osadzonych na szkiełku ( osad o określonej grubości)

Drugi krok
selektywne przytwierdzanie się bakterii cylindrycznych do pierwotnej powłoki organicznej.
* Rodzaj (skład) powłoki organicznej
* warunki w jakich powstaje decydują o:

* rodzaju bakterii je zasiedlających,
* szybkości z jaką tworzony jest biofilm

Pierwsze - zasiedlające bakterie mają ( zwykle)
-rzęski
-długie fimbrie

Gram-ujemna pałeczka -Pseudomonas sp S61tworzy biofilm na szkiełku zanurzonym w 1% roztworze glukozy.
Tworzenie się biofilmu (czerwień Kongo) komórki - ciemna czerwień egzopolysaccharydy pomarańczowo - różowe (DG Allison & IW Sutherland, 1984, Journal of Microbiological Methods 2, 93-99).
Komórki - mikrokolonie - osłonka polisacharydowa

Ryzosfera to strefa w otoczeniu korzeni roślin - obejmująca wzajemne relacje między korzeniami, mikroflorą gleby i glebą jako taką.
Korzenie roślin i związany z nimi biofilm wpływać mogą na chemizm gleby (pH i przekształcanie azotu) . nitrogen transformations.  
Zdjęcie z mikroskopu fluorescencyjnego ( 100 X) obrazuje:
*fluoryzujące na czerwono nitki grzybni przerastającej rizosferę- spring wheat -
*fluoryzujące głównie na czerwono - bakterie (część ASM Biofilm Collection)
 

Wykrywanie obecności gronkowców koagulazo - dodatnich
(S. aureus, S. intermedius, S. hyicus)

Charakterystyka gronkowców

Gram (+) ziarniaki

Nie posiadają rzęsek

Nie wytwarzają przetrwalników

Występują w formie gron lub pojedynczych komórek

Wytwarzają katalazę

Wytwarzają koagulazę

Mogą wytwarzać toksyny

Podział gronkowców

Koagulazo (+) np. Staphylococcus aureus

• Chorobotwórczy dla człowieka

• Rezerwuarem jest człowiek

• Nosicielstwo - 40-50% populacji

• Wywołują

Zatrucia pokarmowe

Owrzodzenia

Posocznice

Koagulazo (-) np. Staphylococcus epidermidis

• Formy saprofityczne

• Składnik mikroflory skóry

• Składnik błon śluzowych

Intoksykacje - zatrucia pokarmowe wywołane przez gronkowce koagulazo (+), w wyniku wytworzenia toksyny

Do enzymów i toksyn (niektóre toksyny mogą działać jak enzymy) wytwarzanych przez gronkowce należą m.in..:

• Katalaza - rozkład H₂O₂ do H₂O i O₂

• Koagulaza - białko podobne do enzymu, powodujące krzepnięcie krwi cytrynianowej w obecności czynnika występującego w wielu surowicach, (czynnik surowicy + koagulaza = esteraza + krzepliwość)

• Hialuronidaza - czynnik rozprzestrzeniania, ułatwia wnikanie i rozprzestrzenianie się gronkowców

• Stafilokinaza - powoduje fibrynolizę, (rozpuszczenie skrzepu i rozprzestrzenianie procesu chorobowego)

• Egzotoksyny:

• hemolizyna - wywołuje lizę erytrocytów (krwinek czerwonych),

• toksyna - rozkład sfingomieliny,

• leukocydyna - uszkadza leukocyty (krwinki białe), głownie granulocyty i makrofagi

• Enterotoksyny:

• toksyny odpowiedzialne za zatrucia pokarmowe

• rozpuszczalne,

• wytwarzane przez ok.. 50% szczepów S. aureus,

• ciepłostałe (100⁰C/30`),

• oporne na działanie enzymów przewodu pokarmowego.

Testy pomocnicze w różnicowaniu Gram (+) ziarniaków

Kryterium badania	Staphylococcus sp	Micrococcus sp	Enterococcus sp
Kształt komórki -ziarniak	+	+	+
Gram (+/-)	+	+	+
Wzrost w warunkach beztlenowych	+	-	+
Rozkład H2 O2	+/(-)	-	-
Rozkład mannitolu	+/-	-/+	-/+
Rozkład glukozy (O/F) *	F	O	F
Wzrost w obecności 15% NaCl	+	-	+
Wzrost w obecności 40% żółci	+	-	+
Reakcja VP	+	-	-/+
Dekarboksylacja argininy	+	-/+	+

Wykrywanie obecności gronkowców koagulazododatnich w 1g produktu

1. NAMNAŻANIE Posiew określonej ilości próbki i/lub jej rozcieńczeń do 3 probówek z pożywką Giolitti-Cantoni

2. Inkubacja 24-48h w 37˚C Wstępne odczytanie wyników na podstawie redukcji tellurynu potasowego - zaczernienie

3. NAMNAZANIE SELEKTYWNE Posiew redukcyjny na pożywkę selektywną Baird-Parkera

4. Inkubacja 24-48h w 37˚C Wybór 5 charakterystycznych kolonii wytwarzających koagulazę (czarne, otoczone mleczną strefą zmętnienia `egg-yolk') i posiew na pożywkę BHI

5. Inkubacja 18-24h w 37˚C

6. TEST POTWIERDZAJĄCY Potwierdzenie zdolności wytwarzania koagulazy testem probówkowym z osoczem króliczym (wynik dodatni - wytworzenie wyraźnego skrzepu, sprawdzane po 1,3,6 i 24h

Podłoże	Cel zastosowania	Charakterystyka
Giolitti - Cantoni	Namnażająco - wybiórcze	Zaczernienie w wyniku redukcji tellurynu
Chapman
Agar z krwią
Frezer
Pół frezer
Baird - Parker	Wybiórczo-różnicujące	Czarne, gładkie, błyszczące, wypukłe, otoczone przezroczysta lub opalizująca sterfa (egg-yolk)
Testy potwierdzające - rozkład mannitolu Wytwarzanie koagulat Wytwarzanie katalazy		- Kolonie żółte - Ścięcie osocza krwi - Rozkład H2O2

Wzrost gronkowców na podłożu Baird Parkera

*Kolonie typowe- czarne, gładkie, błyszczące, wypukłe; średnica 1-1,5mm(24h), 1,5-2,5mm(48h), otoczone strefa przeźroczystą lub opalizującą;

Kolonie nietypowe - czarne, szaroczarne z białą obwódką, błyszczące, strefa przeźroczysta słabo zaznaczona lub jej brak, niekiedy wzrost w postaci szorstkich kolonii.

Wzrost gronkowców na podłożu Chapmana

Typy hemolizy

- hemoliza - częściowa liza, zazielenienie podłoża wokół kolonii; paciorkowce a-hemolizujące, dawniej określane jako grupa paciorkowców zieleniejących (viridans)

- hemoliza - całkowita liza wokół kolonii, paciorkowce b-hemolizujące, np. Staphylococcus aureus

- hemoliza - brak hemolizy - paciorkowce γ -hemolizujące (właściwie niehemolizujące) np.Streptococcus mutans

1. TEST NA KOAGULAZĘ WOLNĄ
   - rozcieńczone, jałowym roztworem fizjologicznym NaCl, osocze krwi królika rozlać, po 1ml, do małych probówek aglutynacyjnych,
   - do każdej probówki dodać po 0,1 ml bulionowej hodowli badanego szczepu,
   - zawartość probówki wymieszać przez wstrząsanie,
   - wstawić do cieplarki o temp. 37°C
   -wyniki odczytywać co 1h do 6h
   (pozostawienie probówki w cieplarce do następnego dnia wytworzony skrzep może ulec rozpuszczeniu pod wpływem wytwarzanej przez szczep fibrynolizyny; mogą też wystąpić dodatnie reakcje nieswoiste)

2. TEST NA KOAGULAZĘ ZWIĄZANĄ (szybki test metodą szkiełkową)
   * do kropli plazmy króliczej na szkiełku przedmiotowym wprowadzić ezą materiał pobrany z pojedynczej kolonii na AO
   * w przypadku obecności koagulazy związanej ma miejsce natychmiastowe zlepianie się (5-15 sec.) komórek
   Większość szczepów wytwarzających koagulazę wolną wytwarza również koagulazę związaną

Istnieje wiele metod izolacji i oczyszczania materiału genetycznego. Wybór najwłaściwszej i najbardziej odpowiedniej zależy od kilku czynników:

1. analizowanego kwasu nukleinowego,

2. rodzaju materiału z jakiego izolujemy (rodzaj tkanki, stopień przetworzenia technologicznego),

3. docelowego przeznaczenia materiału (PCR, Real- Time PCR, blotting itp.).

Izolacja kwasów nukleinowych z materiału biologicznego niezależnie od wybranej metody, wymaga przeprowadzenia lizy komórek, inaktywacji nukleaz komórkowych oraz oddzielenia izolowanego kwasu nukleinowego od pozostałości komórkowych. Często idealna procedura lizy komórek jest kompromisem pomiędzy metodą na tyle inwazyjną, aby zniszczyć materiał poddany izolacji i jednocześnie na tyle delikatną, aby zachować nieuszkodzony materiał genetyczny.

Techniki ekstrakcji DNA polegają na rozbiciu komórek i oddzieleniu DNA od:

1. Innych struktur komórkowych

2. Cząsteczek RNA

3. Białek związanych z DNA - Rozdzielenie DNA od innych frakcji komórkowych:

Odwirowanie, odseparowanie DNA od związanych z nim białek /fenol, chloroform z alkoholem izoamylowym, chloroform z etanolem, mieszanina fenolu z chloroformrm i alkoholem izoamylowym 25: 24: 1 / lub przez trawienie ich proteinazami, np. proteinazą K

Etapy:

1. Dezintegracja komórek metodami fizycznymi przez:

1. Zamrażanie i rozmrażanie komórek

2. Rozcieranie w moździerzu

2. Metodami chemicznymi

3. Liza komórek - detergentów jonowych lub niejonowych (SDS, Sarkozyl, Triton X - 10) rozpuszczalników organicznych roztworów alkalicznych podwyższonej temperatury EDTA (soli sodowej kwasu wersenowego) enzymów trawiacych ścianę komórkową, np. lizozymu

4. Oczyszczanie DNA

5. Usunięcie RNA. Przeprowadza się enzymatycznie poprzez inkubacje z RNA-zą

6. Rozpuszczenie DNA

Precypitacja DNA z odbiałczanych próbek Alkoholem (Et-OH, Ipr-OH) w obecności soli (octanu potasu, sodu lub amonu lub chlorku sodu)

Istota i porównanie metod izolacji DNA

Oprócz kwasów nukleinowych w komórce obecne są również węglowodany, lipidy oraz białka, tworzące struktury o zróżnicowanym stopniu organizacji.

Izolacja DNA, główne bariery stanowią błony plazmatyczne, które zbudowane są z fosfolipidów oraz białek. Podczas izolacji KONIECZNE jest rozbicie wszystkich tych struktur tak, aby jedynym pozostałym złożonym związkiem chemicznym był kwas nukleinowy.

1. W pierwszym etapie następuje rozbicie błon plazmatycznych. Do tego celu wykorzystuje się detergenty, wiążące fosfolipidy wewnątrz struktury wewnętrznej. W zależności od zastosowanej metody liza komórkowa zachodzi najczęściej pod wpływem SDS (dodecylosiarczan sodu), Po rozbiciu błon plazmatycznych Kwas nukleinowy wystawiony jest na działanie nukleaz. Ich działanie hamuje się poprzez wiązanie

2. Izolacja DNA jonów wapnia i magnezu niezbędnych do ich działania, najczęściej przy użyciu EDTA,

3. Kolejny etap to rozdzielenie DNA od związanych z nim białek histonowych tworzących chromatynę. W metodzie „klasycznej” wykorzystuje się bufor Tris/HCl. W metodach nowocześniejszych wykorzystywane są bufory fosforanowe, które tworzą środowisko zasadowe powodujące oddzielenie DNA od histonów.

4. Następny etap to całkowita eliminacja białek z roztworu. W tym celu wykorzystuje się różnego rodzaju enzymy proteolityczne, w tym Proteinazę K. W metodzie „klasycznej” stosuje się toksyczny czynnik denaturujący białka - fenol oraz chloroform. W metodach typu „kit” wykorzystywane są kolumienki ze złożami jonowymiennymi wiążące DNA

5. Ostatni etap to ekstrakcja DNA z roztworu buforowego. Dodanie alkoholu powoduje strącenie DNA. DNA jest strukturą nierozpuszczalną w alkoholu. Aby ograniczyć ilość alkoholu konieczna do strącenia DNA roztwór wysyca się solami silnego kwasu i silnej zasady np. octan amonu.

Wyizolowane i osuszone DNA poddaje się procesowi uwodnienia.

1

---