BIOCHEMIA ĆW ZAL


ĆWICZENIE 1

Zagrożenia pochodzące od preparatów biochemicznych

Należy pracować w rękawiczkach

Preparaty biochemiczne są nietrwałe z powodu możliwości namnażania bakterii

Analiza chemiczna

• Jakościowa - określenie składu badanej substancji

• Reakcje charakterystyczne dla danego związku

• Ilościowa - określenie ilości badanej substancji

Stężenia

• mol/litr - M

• mikromol/litr - uM

• gram/litr - g/l

• miligram/mililitr - mg/ml

• C % = (masa substancji rozpuszczonej/masa roztworu) * 100%

Dysocjacja elektrolityczna

• NaCl → Na+ + Cl-

• H2O + H2O → H3O+ + OH-

• CaCl2 → Ca2+ + 2Cl

Moc jonowa

Substancje biochemiczne a zwłaszcza białka są bardzo wrażliwe na obecność soli w roztworze. Różne sole w różny sposób wpływają na właściwości białek. Aby porównywać wpływ różnych soli na właściwości białek wprowadzono pojęcie mocy jonowej

0x01 graphic
,

gdzie: ci, zi - stężenie i ładunek jonu i,

Metody analityczne

Pierwszym etapem jest rozdział

• Badaną substancje można wydzielić przez:

Denaturacja - ogrzewanie lub dodanie czynnika denaturującego

Filtracja lub wirowanie

Chromatografia

• Polega na przepuszczaniu przez kolumnę roztworu związków chemicznych. Kolumna jest to rura wypełniona złożem mającym taką właściwość że substancje w trakcie przepływu przez nią cieczy migrują z różną szybkością.

• Zbierając frakcje o określonej objętości dokonujemy rozdziału.

• Najpierw zbieramy substancje szybko migrujące przez kolumnę a na końcu te najwolniej migrujące

Elektroforeza

• technika analityczna stosowana w chemii i biochemii. Polega na rozdzielaniu mieszaniny związków chemicznych na jednorodne frakcje przez wymuszanie wędrówki ich cząsteczek w

polu elektrycznym.

Analiza ilościowa i jakościowa

• Metody ilościowe

• Metody Jakościowe

Obecnie podstawowe metody analityczne związane są ze spektrofotometrią

Spektrofotometria polega na pomiarze pochłaniania światła przez rozpuszczoną substancje.

Promieniowanie elektromagnetyczne

1- 1000 m radiowe

106 - 108 nm mikrofale

750 - 106 nm podczerwień

400 -750 nm widzialne

10- 400 nm nadfiolet

10-3 - 10-1 nm rentgenowskie

380 - 450 nm Fiolet

575 - 585 nm żółty

450 - 500 nm Niebieski

585 - 620 nm

Pomaranczowy

500 - 575 nm Zielony

620 - 780 nm Czerwony

Światło ma charakter korpuskularno falowy co oznacza ze zachowuje się jak fale ale zarazem jakcząstki energii.

• Światło o określonej barwie (długości fali) składa się z kwantów energii o jednakowej energii

• Cząsteczki chemiczne maja ściśle określone poziomy energetyczne i mogą pochłaniać kwanty światła ściśle odpowiadające różnicom między tymi poziomami energetycznymi. Wynika z tego że dana substancja pochłania światło w bardzo specyficzny sposób,

Jeśli naświetlimy barwny roztwór białym światłem zawierającym wszystkie kolory, to zaobserwujemy ze część światła została pochłonięta co powoduje zmianę barwy światła po przejściu przez badany roztwór.

• Roztwory miedzi mają kolor niebieski kobaltu różowy a niklu zielony.

• Różne substancje pochłaniają światło przy różnych długościach fali,

• alkohol etylowy pochłania fale świetlne w zakresie podczerwieni, zjawisko to wykorzystuje się miernikach stężenia alkoholu w wydychanym powietrzu

• Białka i nukleotydy (ATP, kwasy nukleinowe) pochłaniają fale świetlne w zakresie UV nadfioletu

Spektrofotometria

• Są różne metody spektrofotometryczne, różniące się metodą pomiaru jak i długością fali przy której dokonujemy pomiarów.

• Można mierzyć bezpośrednio badaną substancje na przykład roztwory białek przy długości fali 280 nm lub też kompleksy barwne oznaczanej substancji z odczynnikiem wywołującym

barwę

• oznaczenia fosforanów metodą Fiske Subarowa

• białek przeprowadzając reakcje barwną z biuretem a następnie oznaczając stężenie tworzącego się barwnego kompleksu.Można zbudować przyrząd , spektrofotometr wytwarzający światło monochromatyczne o jednej barwie , jednej długości fali a następnie zmieniać długość fali wytwarzanego światła.

• Jeśli takie światło przepuścimy przez badaną substancje i będziemy rejestrować zmiany pochłaniania tego światła w zależności od długości fali to otrzymamy widmo absorpcyjne

danej substancji.

• Ponieważ wiadomo jak związki chemiczne absorbują światło to z takiego widma można zorientować się co zawiera badana próbka. Białka absorbują w nadfiolecie przy długości fali ok. 280 nm (UV) a kwasy nukleinowe przy 260 nm (UV). Takie widma pozwalają określić skład i stężenie zawartych w roztworze substancji.

Widmo absorpcyjne

Widmo jest to graficzny zapis zmian wartości absorbancji w zależności od długości fali

przechodzącej przez badany roztwór. Głównymi parametrami widma są:

a - położenie pasm (wartość długości fali przy których na widmie można wyróżnić

maksima; lmax)

b - molowy (lub właściwy) współczynnik absorpcji związany z danym maksimum.

Prawo Lamberta Beera

A = e·c·l

c =A/(e*l)

Ponieważ l = 1cm można zapisać c =A/e

e - molowy współczynnik absorpcji, równy liczbowo absorbancji, która

wystąpiłaby, gdybyśmy mierzyli w danych warunkach roztwór o

stężeniu 1 mol/dm3 przy grubości warstwy równej 1 cm;

c - stężenie mierzonego roztworu w mol/dm3;

l - grubość warstwy roztworu w cm.

• Najczęściej używa się współczynnika absorpcji wyrażonego w jednostkach w jakich wyrażamy stężenia badanych substancji. Dla białek są to mg/ml a nie mol/dm3

Transmitancja i absorbancja

Jeśli badany roztwór pochłonie 90% promieniowania o danej długości fali, to powiemy, że jego transmitancja wynosi 10%, zaś absorbancja będzie wynosić lg(100/10)=1

Skale logarytmiczne

• L - poziom natężenia dźwięku

• I - natężenie dźwięku

• I0 - wartość odniesienia, wynosząca 10-12 W/m2

Definicja pH

• pH= -log [H +]

• pH= -log [H3O+]

Prawo addytywności absorpcji

• Absorpcja roztworu wieloskładnikowego równa się sumie absorbancji poszczególnych składników:

A = A1 + A2 + … An

• Gdzie: A1, A2, …, An są to absorbancje poszczególnych składników.

Pomiary spektrofotometryczne

• Najczęściej pomiary prowadzi się w kuwetach pomiarowych o długości drogi optycznej 1 cm, często kuwety nie są symetryczne i należy wkładać je do spektrofotometru we właściwy sposób

• Kuwety muszą być wykonane z materiału nie pochłaniającego promieniowania w zakresie długości fali przy których dokonujemy pomiaru.

• Dla nadfioletu (UV) używamy tylko kuwet kwarcowych oznaczonych literą Q, kuwety plastikowe lub szklane pochłaniają promieniowanie co uniemożliwiłoby pomiary.

• Najprościej byłoby zmierzyć absorpcje podzielić przez współczynnik absorpcji i odczytać stężenie. W praktyce jest to niemożliwe bo roztwory pochłaniają światło w niespecyficzny

sposób na skutek zmętnienia co więcej zawierają zanieczyszczenia np. ATP związek chemiczny bardzo mocno pochłaniający promieniowanie w zakresie nadfioletu (UV)

• Posługujemy się zmodyfikowanym wzorem do oznaczania stężenia

Abs(specyficzna) -Abs (niespecyficzna)

C= ---------------------------------------

współczynnik absorpcji

ĆWICZENIE 2

Krew

• Krew stanowi około 7% masy ciała. Większość (55% objętości) to osocze, czyli płynne środowisko dla zawieszonych elementów morfotycznych (upostaciowanych), którymi są

krwinki czerwone (erytrocyty), krwinki białe (leukocyty) oraz płytki krwi.

Funkcje krwi

• transportowa,

• obronną

• homeostatyczną (czyli utrzymującą stałość

parametrów biochemicznych i biofizycznych

organizmu).

Funkcja transportowa

• Krew dostarcza do komórek tlen (pobrany wcześniej z płuc) oraz składniki energetyczne, sole mineralne i witaminy (pobrane z przewodu pokarmowego). Zbędne produkty przemiany materii (dwutlenek węgla, mocznik, kwas moczowy) również są transportowane przez krew, która zabiera je z tkanek i przenosi do narządów wydalniczych (nerek, skóry) i do płuc (usuwają dwutlenek węgla).

• Krew odbiera ciepło z okolic, w których produkowane jest ono w nadmiarze (np. z wątroby i z mięśni), i przenosi je do nieco chłodniejszych regionów. Dzięki temu nasz organizm utrzymuje w miarę stałą temperaturę w całym ciele, jedynie z niewielkimi różnicami pomiędzy różnymi rejonami.

• transportuje hormony, biorąc udział w regulacji przez te aktywne biologicznie substancje wielu reakcji biochemicznych w ustroju.

Funkcja obronna i udział w homeostazie

• Krew bierze udział w reakcjach obronnych organizmu; przenoszone przez nią przeciwciała i

komórki odpornościowe zwalczają wszelkie zagrożenia z zewnątrz i z wewnątrz.

Krew bierze udział w tworzeniu stałego środowiska wewnętrznego, czyli w homeostazie.

Osocze

• Osocze jest zasadniczym składnikiem krwi, stanowi medium, w którym zawieszone są elementy morfotyczne. Zawiera składniki organiczne i nieorganiczne (głównie jony sodowe, potasowe, chlorkowe i węglanowe). Składniki organiczne to: białka, składniki pozabiałkowe oraz lipidy osocza.

FUNKCJE OSOCZA:

- dzięki zawartości albumin i elektrolitów utrzymuje stałe ciśnienie osmotyczne płynów ciała, stałą moc jonową oraz pH

- transportuje substancje odżywcze, tlen, dwutlenek węgla, szkodliwe produkty przemian związków azotowych, hormony

Osmolalność

• Miarą aktywności osmotycznej roztworu jest osmolalność, która jest równa iloczynowi liczby moli substancji rozpuszczonej i liczby cząstek powstałych w wyniku dysocjacji

w 1 kg rozpuszczalnika (wody).

• Jednostką jest 1 osmol, czyli aktywność osmotyczna roztworu, który zawiera 1 mol substancji nie dysocjującej lub jonów w 1 kg wody. Częściej używane są jednostki 1000-

krotnie mniejsze, czyli miliosmole (mosmol/kg), odpowiadające stężeniu wyrażonemu w milimolach/kg wody.

Roztwór hipertoniczny - roztwór do którego następuje przepływ indywiduum chemicznego

zdolnego do przenikania przez błonę półprzepuszczalną.

Roztwór hipotoniczny - roztwór od którego następuje przepływ indywiduum chemicznego

zdolnego do przenikania przez błonę półprzepuszczalną.

Roztwór izotoniczny - roztwór, który w kontakcie z innym roztworem przez błonę półprzepuszczalną pozostaje z nim w osmotycznej równowadze dynamicznej.

Hematokryt

Hematokryt - stosunek objętości skoagulowanych erytrocytów do objętości całej krwi. Wyrażany jest w procentach lub w postaci ułamka (frakcji objętości).

• Rozcieńczona krew ma mniejszą lepkość i łatwiej przechodzi przez naczynia krwionośne i

lepiej dostarcza tlen do tkanek.

Składniki nieorganiczne

• Stałość elementów osocza (szczególnie nieorganicznych) jest kluczowa w prawidłowym

funkcjonowaniu komórek, szczególnie nerwowych i mięśniowych. Wahania stężeń potasu i sodu odbijają się na pracy tych układów i mogą np. doprowadzić (w przypadku zwiększenia stężenia potasu) do zatrzymania akcji serca. Składniki nieorganiczne wraz z białkami osocza pełnią też zasadniczą rolę w utrzymaniu odpowiedniego odczynu (pH) osocza, co

nazywamy równowagą kwasowo-zasadową

Białka osocza

• Zawartość białka w osoczu 6-8%

• Albuminy 60%

• Globuliny 40%

• Zmniejszenie zawartości białka po jego utracie zachodzi rzadko (np. nerczyca)

• Często zmienia się stosunek np. frakcji albuminowej do frakcji globulinowej (normalnie wynosi 1,5

• Zmniejszenie ilości albumin występuje z powodu ich utraty (białkomocz, krwotoki) lub zahamowanie ich syntezy (choroby wątroby)

• Zwiększenie zawartości globulin obserwuje się w stanach zapalnych w przewlekłych chorobach zakaźnych lub schorzeniach wątroby

Albuminy

Niskocząsteczkowe białka Mcz do 60 kD wiążące wode i utrzymujące ciśnienie osmotyczne krwi. Spadek zawartości albumin może wywoływać obrzęki tkanek

Globuliny (wysalają się przy 50% wysoleniu siarczanem amonu) masa cząsteczkowa ok. 100 kD białka biorące udział w procesie krzepnięcia krwi, enzymy, fosfataz , proteazy, lipazy, białka o właściwościach immunologicznych, białka wiążące metale np.: transferyna (żelazo)

Kinazy - enzymy katalizujące fosforylacje białek.

Fosfatazy. enzymy należące do grupy katalizują rozkład estrów kwasu fosforowego

Lipazy, enzymy z katalizujące rozkład lub syntezę estrów kwasów tłuszczowych i gliceryny (tłuszczów)

Proteazy to enzymy które dokonują hydrolizy wiązań Peptydowych

Otrzymywanie osocza

• W celu otrzymania osocza należy krew pobierać do naczyń zawierających czynniki zapobiegające krzepnięciu takich jak : heparyna, cytrynian sodu, szczawian amonu (Ck=0,2 %). Substancje te wiążą jony wapnia (oprócz heparyny) które są niezbędne do krzepnięcia krwi. Krew należy możliwie szybko odwirować przy 3000 obrotach/ minutę przez 15

minut. Roztwór po wirowaniu to osocze.

Surowica, serum

Osocze krwi pozbawione białka fibrynogenu (włóknika) oraz innych składników biorących udział w krzepnięciu krwi (układ krzepnięcia). Otrzymuje się przez pozostawienie krwi

na kilkadziesiąt minut w 37 stopniach (skrzep krwi kurczy się) i wydziela się surowica którą ostrożnie zbieramy i następnie wirujemy

Pomiary spektrofotometryczne

• Często oznaczamy nie bezpośrednio daną substancje a powstający w reakcji z nią barwny związek w takich wypadkach należy zastosować krzywą wzorcową gdyż reakcja barwna

może zachodzić w różnym stopniu (odczynniki się starzeją)

• Przygotowujemy roztwór jak najbardziej zbliżony do roztworu badanego a następnie przygotowujemy kilka próbek zawierających mierzoną substancje o wzrastających

stężeniach. dodajemy mierzoną substancje po zmierzeniu absorpcji rysujemy zależność absorpcji od stężenia i otrzymujemy krzywą wzorcową.

Krzywe wzorcowe

• Roztwory wzorcowe powinny mieć podobny skład do próbki

• Krzywa wzorcowa powinna składać się co najmniej z czterech punktów

• Stężenia roztworów wzorcowych powinny być zbliżone do stężenia badanej próbki

Oznaczanie całkowitego białka osocza krwi metodą biuretową

Odczynniki

• 0,9 % roztwór NaCl

• 23 % roztwór Na2SO4 pH 6,3

• Odczynnik biuretowy: W 200 ml H2O rozpuścić 1,5 g CuSO4*5H2O. W 300 ml H2O rozpuścić 6 g winianu sodowo-potasowego. Po zmieszaniu tych roztworów dodać 300 ml 10 % NaOH i uzupełnić wodą do 1 l. Przechowywać w ciemnej butelce zamkniętej korkiem

gumowym.

• 1% wzorcowy roztwór albuminy surowicy bydlęcej

(BSA) w 0,9 % NaCl.

Procedura

• Pobrać do probówki 0,5 ml osocza i 9,5 ml roztworu Na2SO4. Po wymieszaniu inkubować w cieplarce w 37oC przez 30 minut

• Wymieszać i pobrać 2 ml zawiesiny (na oznaczenie białka całkowitego)

• Resztę przesączyć przez twardy sączek(???) w cieplarce.

• 2 ml klarownego przesączu dodać do probówki A (albuminy).

• Trzecia próba kontrolna (K) dodać 2 ml roztworu Na2SO4.

• Do wszystkich probówek dodać po 3 ml odczynnika biuretowego i wymieszać.

• Po 15 minutach określić wartość absorbancji wobec próby kontrolnej (długość fali 530 nm)

Krzywa kalibracyjna

• Do probówek odmierzyć kolejno następujące ilości roztworu 1% albuminy:

• 0,2; 0,4;0,6; 0,8 i 1,0 ml. Uzupełnić do 2ml 0,9% roztworem NaCl.

• Do wszystkich probówek dodać po 3 ml odczynnika biuretowego i po 15 min oznaczyć absorbancje wobec próby K.

• Odczynnik biuretowy dodawać co 0,5 min do wszystkich prób. Badanych i krzywej wzorcowej.

• Oznaczać po 15 min co 0,5 minuty by zachować ten sam czas reakcji barwnej.

• Metoda jest liniowa do stężenia 10 % białka a wiec można kreślić linię prostą

• Tangens nachylenia da nam wartość współczynnika absorbancji.

Przykład

• Ap=0,334

• Krzywa A= 0,108; 0,216; 0,324; 0,432; 0,540

• Do oznaczenia brano 0,1 ml osocza (0,5 ml osocza znajdowało się w 10 ml roztworu)

• Należy obliczyć mnożniki wzorca dla każdej próby

• Mnożnik wzorca [%]M =Vwzorca/ V badanej próby

• M1=2; M2=4; M3=6; M4=8; M5 =10

• Współczynnik kalibracji F=(M/Abs) * Cwz

• Współczynniki kalibracji wynoszą

• F=18,5 ; 18,5; 18,5; 18,5; 18,5

• Stężenie białka wynosi

• C [%]=F*Abad

• C [%]=18,5*0,334

• C=6,179%

ĆWICZENIE 3

  1. Struktura pierwszorzędowa

Czyli najniższy poziom organizacji strukturalnej cząsteczki jest wyznaczona przez sekwencję aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Jest ona uwarunkowana jeszcze zanim zostanie zsyntetyzowany łańcuch polipeptydowy, gdyż informacja o kolejności aminokwasów w cząsteczce białka jest zakodowana w DNA, w postaci sekwencji nukleotydowej. Dzięki procesom transkrypcji, a później translacji sekwencja nukleotydowa zostaje odczytana w trakcie syntezy odpowiedniego polipeptydu.

  1. Struktura drugorzędowa

Są to typy regularnego ułożenia głównego łańcucha polipeptydowego stabilizowane wiązaniami wodorowymi. Odkryto dwa podstawowe, regularne układy drugorzędowe

występujące powszechnie w strukturze białek. Są to struktury a -helisy i b -harmonijki.

a -helisa

Struktura a -helisy ma kształt cylindra. Ciasno spleciony łańcuch główny polipeptydu tworzy centralną część cylindra, natomiast boczne łańcuchy reszt aminokwasowych wystają na zewnątrz w ułożeniu helikalnym. Struktura a -helisy jest stabilizowana wiązaniami wodorowym grup NH i CO głównego łańcucha. Grupa CO każdego aminokwasu wiąże się wiązaniem wodorowym z grupą NH, aminokwasu odległego do przodu o cztery reszty

aminokwasowe i leżącego bezpośrednio nad nią. Rezultatem tego jest fakt, że wszystkie grupy CO i NH łańcucha głównego są połączone wiązaniem wodorowym.

Każda reszta aminokwasowa jest przesunięta w stosunku do sąsiedniej o 0,15 nm wzdłuż osi helisy i obrócona o 100o wokół osi. Na jeden obrót helisy przypada zatem 3,6 reszt

aminokwasowych. Skok helisy wynosi wtedy 0,54 nm.

Struktura b -harmonijki (b -kartki)

Struktura b -harmonijki (b -kartki) - W odróżnieniu od cylindrycznej struktury a -helisy, cząsteczka polipeptydu przyjmuje kształt, prawie całkowicie rozciągnięty.

W uformowaniu struktury b -harmonijki, może brać udział więcej niż jeden łańcuch polipeptydowy. Odległość sąsiednich aminokwasów wzdłuż osi cząsteczki wynosi 0,35 nm (w a-helisie - 0,15 nm). Harmonijkę b stabilizują wiązania wodorowe pomiędzy grupami CO i NH, leżącymi w jednej płaszczyźnie obok siebie i niekoniecznie pochodzących ze wspólnego łańcucha polipeptydowego.

Czynniki stabilizujące strukturę trzeciorzędową białek

-Wiązania wodorowe

-Oddziaływania hydrofobowe

-Wiązania jonowe

-Kowalencyjne mostki dwusiarczkowe

-Oddziaływania międzycząsteczkowe

Struktura czwartorzędowa

• Struktura czwartorzędowa powstaje po przez łączenie się kilku podjednostek białkowych.

• Stabilizują ją te same siły co strukturę trzeciorzędową

Białka opiekuńcze

• Łańcuch polipeptydowy ulega ostatecznemu uformowaniu dzięki oddziaływaniom z białkami opiekuńczymi (czaperony)

• Aktywność enzymów jest determinowana ich strukturą czwartorzędową (ułożeniem przestrzennym).

• Enzymy są zwykle dużo większe od przerabianych substratów, ale tylko kilka aminokwasów znajdujących się w centrum aktywnym bierze bezpośredni udział w katalizie.

• reakcja katalizowana anhydrazą węglanowa jest jedną z najszybciej przebiegających znanych reakcji enzymatycznych - w ciągu 1 sekundy enzym uwadnia 106 cząsteczek dwutlenku węgla.

• Niektóre enzymy zawierają miejsca wiązania kofaktorów, niezbędnych dla ich prawidłowego funkcjonowania.

• Mogą zawierać miejsca substancji regulujących aktywność np.. Wapń lub produktów reakcji.

Lizozym

Obecny w mleku kobiecym. Chroni niemowlę przed zakażeniami. Rozkłada ściany komórkowe bakterii, dezaktywuje DNA wirusów

Krwinki czerwone

• Najbardziej znane elementy morfotyczne krwi to krwinki czerwone, czyli erytrocyty. W jednym milimetrze sześciennym znajduje się średnio 5,4 miliona erytrocytów u mężczyzn i 4,8 miliona u kobiet.

Ich główną rolą jest przenoszenie tlenu z płuc do tkanek. Te funkcje zapewnia obecność

hemoglobiny - czerwonego barwnika krwi.

Hemoglobina

• Hemoglobina składa się z białka - globiny - oraz z czterech cząsteczek hemu.

• W hemie ważny jest atom żelaza, który wiąże się z jedną cząsteczką tlenu, tworząc oksyhemoglobinę.

• Żelazo wiąże tlen jedynie na drugim stopniu utlenienia; jeśli pod wpływem związków utleniających (np. anilina, azotany, nitrobenzen) stanie się trójwartościowe (trzeci stopień

utlenienia), to tworzy się methemoglobina, która nie wiąże tlenu.

Karboksyhemoglobina, tworzy się przez połączenie hemu z tlenkiem węgla. Tlenek węgla wypiera tlen z oksyhemoglobiny, czyniąc hemoglobinę bezużyteczną.

• Tlenek węgla wiąże się z hemoglobiną ok.. 300 razy mocniej

Budowa hemoglobiny

• Cząsteczkę hemoglobiny tworzą 4 helikalne łańcuchy polipeptydowe

• Dwa łańcuchy  i 2 łańcuchy  z których każdy owija grupę hemową zawierającą atom żelaza dwuwartościowego.

• Związki kompleksowe (inaczej kompleksy, związki koordynacyjne) to związki chemiczne, w których można wyróżnić jeden lub więcej atomów centralnych, otoczonych

przez inne atomy lub ich grupy zwane ligandami, przy czym przynajmniej jedno wiązanie atomu centralnego z ligandem ma charakter wiązania koordynacyjnego.

Hem

•Cztery wiązania koordynacyjne atomu żelaza wiążą się z 4 azotami grup pierścieni

pirolowych piąte z tlenem a szóste z białkiem przez pierścień imidazolowy histydyny

Regulacja allosteryczna enzymów

• Regulacja allosteryczna polega na wiązaniu aktywatora lub inhibitora enzymu w innym miejscu niż następuje wiązanie substratu

Mioglobina i hemoglobina

Mioglobina jest białkiem wiążącym i magazynującym tlen. Największe jej stężenie znajduje się w mięśniach szkieletowych odpowiedzialnych za ruch oraz w sercu. Mioglobina jest niewielkim białkiem globularnym o masie około 18 kDa. Nie ma budowy podjednostkowej,

Hemoglobina jest białkiem allosterycznym

Wiązanie tlenu z jedną z podjednostek, wpływa na oddziaływanie pozostałych podjednostek z tlenem. Po związaniu pierwszej cząsteczki tlenu do pierwszej kolejne cząsteczki tlenu przyłączają się coraz łatwiej

Kooperatywność hemoglobiny

• Podobnie jak w namiocie najtrudniej wstawić pierwszy maszt, następne prawie same się wstawiają.

Wiązanie tlenu przez mioglobinę i hemoglobinę

• Mioglobina najmocniej wiąże tlen przy niskim wysyceniu tlenem

• Hemoglobina wiąże tlen słabo przy niskim wysyceniu tlenem a przy większym wysyceniu

tlenem wiąże tlen mocno

Efekt Bohra

W zależności od pH zmienia się powinowactwo tlenu do hemoglobiny. W pracujących mięśniach pH się obniża (środowisko ulega zakwaszeniu) co ułatwia dysocjację tlenu.

Siła wiązania tlenu w środowisku kwaśnym jest mniejsza niż w zasadowym.

• oksyhemoglobina (O2) - transport tlenu

• karbaminohemoglobina (CO2) - transportuje CO2

• karboksyhemoglobina ze związanym tlenkiem węgla (CO)

Hemoliza krwi

• Krwinka czerwona zawiera 280mln cząsteczek hemoglobiny

• Umieszczenie krwinek w czystej wodzie prowadzi do pękania błony krwinek czerwonych i uwolnienia cząsteczek hemoglobiny

• W roztworze izotonicznym błonę można usunąć rozpuszczając ją w rozpuszczalnikach organicznych (eter aceton)

Wpływ tlenu na absorpcje światła przez hemoglobinę

• Hemoglobina pochłania światło w zależności od stopnia utlenowania

• Po związaniu tlenu absorbuje światło przy 578 nm i 540 nm (żółta i zielona barwa)

• Po uwolnieniu tlenu (warunki redukujące roztworu np.. Dodatek dwutionianu sodu) ma barwę czerwono fioletową 565 nm

• Hemoglobina wiąże 300 razy mocniej tlenek węgla i absorbuje światło przy 572 nm i 535 nm

Ilościowe oznaczanie hemoglobiny

Odczynniki

-0,04% NH3

-Na2S2O4 (dwutionian sodu - reduktor))w stanie stałym

• Krew z opuszka palca 0,1 ml wprowadzić do 9,9 ml 0,04% roztworu NH3, Następnie dodać kilka kryształków Na2S2O4. Powstaje fioletowe zabarwienie.

• Oznaczać względem wody przy 570 nm spektrofotometrycznie.

• Równolegle zmierzyć absorpcje wzorcowego roztworu hemoglobiny.

Stężenie hemoglobiny liczyć według wzoru

• Amoniak dodany by przeciwdziałać wytrącaniu się białek

Oznaczanie hemoglobiny na podstawie zawartości żelaza

Odczynniki

Cząsteczka hemoglobiny zawiera 0,34% Żelaza. Z ilości żelaza można obliczyć zawartość hemoglobiny

-72% roztwór HClO4

- Perhydrol

- 25% roztwór amoniaku

- 20% roztwór kwasu sulfosalicylowego

• Roztwór wzorcowy żelaza10 μg/ml. Rozpuścić 86,3 mg 12 hydratu siarczanu żelazowo-amonowego w wodzie z dodatkiem 10 ml stężonego H2SO4 i uzupełnić wodą do1000 ml.

Wykonanie

• Do probówki wprowadzić 0,05 ml krwi następnie dodać0,2 ml HClO4 i 0,2 ml perhydrolu. Ogrzewać na wrzącej łażni wodnej do całkowitego odbarwienia roztworu. Po mineralizacji dodać 0,5 ml 20% roztworu kwasu sulfosalicylowego i 1 ml roztworu NH3 uzupełnić wodą do 5 ml i oznaczać absorbancje przy 420 nm wobec próby kontrolnej (skład ten sam ale bez krwi)

• Oznaczenia w roztworach wzorcowych żelaza analogicznie jak

w badanej próbie

ĆWICZENIE 4

Definicja pH

• pH= -log [H +]

• pH= -log [H3O+]

Iloczyn jonowy wody

• Ponieważ stężenie wody w wodzie jest bardzo duże to praktycznie się nie zmienia

Iloczyn jonowy wody

Mocne i słabe kwasy

Mocne kwasy takie jak kwas solny, kwas siarkowy kwas azotowy są całkowicie zdysocjowane w roztworach wodnych i ich stężenie analityczne (dodane) jest równe

stężeniu jonów wodorowych

Dla słabych kwasów (np. octowy, mrówkowy) częściowo tylko zdysocjowanych stężenie jonów wodorowych (pH) należy wyliczać w oparciu o prawo działania mas

pH buforu nie zależy od rozcieńczenia

• 1 kropla kwasu solnego (ok. 0,05 ml = 0,00005 l)

• Stęzony HCl 12 M 12 moli w litrze

• n = C * V; C = n / V

• [H+] =(12 M * 0,00005 l ) / 1l =0,0006 M

• pH=3,22

• Zmiana pH o 3,78

• Dla 2 M buforu mrówczanowego pKa = 3,74 przy pH = 3,74

1 litr buforu zawiera 1 mol formy A- i jeden mol fomy HA

• Dodajemy tyle samo kwasu solnego co poprzednio do wody (12M * 0,00005= 0,0006)

Pojemność buforowa

• Miarą zdolności roztworu buforowego do przeciwdziałania wpływom zmieniającym jego pH jest zdolność buforowa, wyrażona zwykle liczbą moli mocnego kwasu lub zasady,

która wprowadzona do 1 dm3 roztworu buforowego zmienia jego pH o jedność.

• Pojemność buforowa jest wprost proporcjonalna do stężenia roztworu buforowego.

• Największa pojemność buforowa jest gdy pH = pK

Przykładowe bufory

• bufor octanowy: CH3COOH, CH3COONa w zakresie pH = 3,5 - 6 pKa = 4,8

• bufor amonowy: NH4Cl, NH3 , w zakresie pH = 8 - 11 pKa = 9,2

• bufor fosforanowy: KH2PO4, K2HPO4 w zakresie pH = 5,5 - 8

Przykładowe wartości pH dla niektórych płynów ustrojowych

• łzy, pot, ślina - ok. 7

• mocz 5 - 7,5

• sok żołądkowy 0,8 - 0,98

• osocze - średnio 7,4

• pokarm kobiety - 6,8

Mechanizm buforowania roztworów przez białka

Bufory w organizmie

•Płyny fizjologiczne (np. krew) zawierają bufory gdyż reakcje biochemiczne są bardzo wrażliwe na zmiany pH.

•Ludzka krew jest lekko zasadowa, pH » 7.39 - 7.45

•U zdrowych ludzi pH krwi maksymalnie zmienia się o 0,2 pH

•pH < 7.2, “acidoza”; pH > 7.6, “alkaloza”

•Zgon jeśli pH < 6.8 lub > 7.8

Równowaga kwasowo-zasadowa

• Równowaga kwasowo-zasadowa - to stan, w którym zachowany jest właściwy stosunek kationów i anionów w płynach ustrojowych, warunkujący odpowiednie pH i prawidłowy przebieg procesów życiowych

Optymalny zakres pH krwi dla większości procesów przemiany materii wynosi 7,35-7,45

• Wiele produktów przemiany materii to kwasy

• w procesach utleniania węglowodanów, tłuszczów i białek powstaje kwas węglowy, który jest wydalany w postaci dwutlenku węgla przez płuca,

• w wyniku oksydacji metioniny i cystyny tworzy się kwas siarkowy,

• organiczne związki fosforu (fosfolipidy, nukleoproteidy) są metabolizowane do kwasu fosforowego.

• Jeśli przemiana węglowodanów nie przebiega do końca, powstaje kwas mlekowy (np. przy nadmiernym wysiłku fizycznym), a w warunkach niecałkowitego spalania lipidów, co

następuje przy głodzeniu lub gdy w pożywieniu jest dużo tłuszczów, a mało węglowodanów, powstają kwas acetooctowy i kwas betahydroksymasłowy

Stabilizacja pH organizmu

Najważniejsze procesy odpowiedzialne za stabilizacje pH:

- wydalanie nadmiaru dwutlenku węgla przez płuca

- wydalanie kwasów lub zasad przez nerki

System buforów krwi i tkanek

• Podstawowymi buforami krwi są:

-układ wodorowęglanowy

- białczanowy i hemoglobinianowy

- w tkankach istotną rolę odgrywa również układ fosforanowy.

Regulacja pH

• Regulacja wydalania CO2 przez płuca odbywa się w wyniku pobudzenia ośrodka oddechowego przy obniżeniu pH krwi. Następstwem jest zwiększenie wentylacji płuc i usunięcie CO2.

• O zmianach pH krwi decydują również nerki. Ich rola polega na resorpcji zwrotnej wodorowęglanów, przesączonych w kłębuszkach nerkowych, dzięki czemu następuje uzupełnienie zapasów (regeneracja) tych anionów buforowych we krwi

• Gdy do krwi wnikną wartości kwaśne, np. w mięśniach powstały kwas mlekowy czy fosforowy lub z pożywienia kwas octowy, to zostaną zobojętnione węglanami, przez co stosunek dwutlenku węgla do kwaśnego węglanu sodu zmieni się na korzyść

dwutlenku węgla, do zakwaszenia krwi nie dojdzie bo dwutlenek węgla swoiście drażni odpowiednie chemoreceptory lub sam ośrodek oddechowy, powodując większą wentylację, wskutek czego nadmiar CO2 zostanie usunięty z organizmu przez płuca.

• Gdy do krwi wnikają wartości zasadowe, (np. z pokarmów roślinnych uwalniane zasady) reagują z kwasem węglowym powstałym z dwutlenku węgla.

• Zmniejsza się ilość dwutlenku węgla

• Organizm zmniejsza wentylację płuc tak długo, aż produkowany dwutlenek węgla zgromadzi się we krwi w takiej ilości, aby jego stosunek do dwuwęglanów wrócił do wartości prawidłowej

• Zasadowica gazowa (oddechowa) jest spowodowana czynnikami takimi jak: hiperwentylacja (np. w histerii), przebywanie na znacznych wysokościach nad poziomem morza lub zatrucie salicylanami u dzieci.

• Zasadowica metaboliczna (nieoddechowa) jest następstwem nagromadzenia we krwi nadmiaru zasad np. w wyniku znacznej utraty kwaśnego soku żołądkowego (podczas długotrwałych wymiotów, biegunek), stosowania leków alkalizujących (np. w

chorobie wrzodowej),

• Jeżeli buforowanie i kompensacja oddechowa nie wystarczają do utrzymania równowagi kwasowozasadowej, to przy zakwaszeniu organizmu dochodzi do zwiększonego wydalania jonów H ' przez nerki (pH moczu może się wahać od 4,8 do 7,5)

• Przy zmianach pH w kierunku zasadowym z moczem wydala się więcej jonów HCO3

ĆWICZENIE 5

Trawienie białek

Wchłanianie aminokwasów

-Wchłanianie odbywa się poprzez transport aktywny

- Transportowane są naturalne izomery aminokwasów

- W transporcie uczestniczy witamina B6 (fosforan pirydoksalu)

- Aminokwasy transportowane są przez rąbek szczoteczkowy (miejscewchłaniania: jelitoczcze)

błony komórkowe, który zachodzi z udziałem mechanizmówtransportujących lub substancji przenośnikowych, ze środowiska omniejszym stężeniu do środowiska o stężeniu większym, czyli wbrewgradientowi elektrochemicznemu. Taki transport wymaga dostarczeniaenergii chemicznej

Aminokwasy egzogenne

Aminokwasy egzogenne (nazywane też aminokwasami niezbędnymi -jest to grupa

aminokwasów, które nie mogą być syntetyzowane w organizmie zwierzęcym i muszą być dostarczane w pożywieniu, w przeciwieństwie do aminokwasów endogennych. Żywienie pokarmami ubogimi w aminokwasy niezbędne może doprowadzić do zaburzeń chorobowych. Do aminokwasów niezbędnych dla człowieka zalicza się 10 aminokwasów egzogennych

Aminokwasy niezbędne egzogenne

• Histydyna (His)

• Arginina (Arg)

• Izoleucyna (Ile)

• Leucyna (Leu)

• Lizyna (Lys)

• Metionina (Met)

• Fenyloalanina (Phe)

• Treonina (Thr)

• Tryptofan (Trp)

• Walina (Val)

Aminokwasy endogenne

Aminokwasy endogenne -to aminokwasy, które organizm zwierzęcy może syntetyzować

samodzielnie, w przeciwieństwie do aminokwasów egzogennych, które musi przyjmować systematycznie wraz z pożywieniem.

Aminokwasy nie niezbędne endogenne

• Alanina (Ala)

• Asparagina (Asn)

• Kw. asparaginowy (Asp)

• Cysteina (Cys)

• Glutamina (Gln)

• Kw. glutaminowy (Glu)

• Glicyna (Gly)

• Prolina (Pro)

• Seryna (ser)

• Tyrozyna (Tyr)

Wydalanie jest procesem fizjologicznym polegającym na usuwaniu z organizmu szkodliwych produktów przemian związków azotowych (amoniak,mocznik,kwas moczowy),dwutlenku węgla oraz wody i nadmiaru soli mineralnych i innych związków zbędnych dla organizmu.

Wśród aminokwasów wyróżnić można zasadniczo na trzy grupy.

Wydajność energetyczna aminokwasów

Transaminacja

Pierwszym etapem katabolizmu większości aminokwasów jest transaminacja - przeniesienie grupy aminowej z aminokwasu na a -ketoglutaran. Reakcje transaminacji katalizowane są

przez enzymy AMINOTRANSFERAZY zależne od fosforanu pirodyksylu ( witaminy B6 )

Katabolizm - ogół reakcji chemicznych metabolizmu prowadzący do rozpadu złożonych związków chemicznych na prostsze cząsteczki.

Anabolizm -grupa reakcji chemicznych, w wyniku których z prostych substratów powstają związki złożone, gromadzące energię

Fenyloketonuria

Fenyloketonuria jest chorobą genetyczną spowodowanamutacją genu kodującego enzym_hydroksylaze fenyloalaninową

Chorobę rozpoznaje się u ok. 1 na 15000 dzieci, ale częstość_jej występowania jest różna w różnych populacjach

Mutacja powoduje upośledzenie aktywności enzymatycznejPAH, który katalizuje przekształcanie w organizmieaminokwasu fenyloalaniny w inny aminokwas tyrozynę. We krwidziecka chorego na fenyloketonurię zaczyna gromadzić sięfenyloalanina i produkty jej metabolizmu, przy względnymniedoborze tyrozyny. Przy braku odpowiedniego leczeniadochodzi do uszkodzenia mózgu. Szkodliwe produkty sąszczególnie niebezpieczne dla układu nerwowego podczas jegorozwoju. Dlatego wśród dzieci robi się testy na fenyloketonurie.

Obecnie sądzi się że również dla dorosłych te metabolity sąniezdrowe.

Dziedziczenie fenyloketonurii

Choroba dziedziczy się w sposób autosomalny recesywny -oznacza to, że dziecko musi odziedziczyć wadliwy allel od obojga rodziców, żeby rozwinęła się choroba. Chorobę rozpoznaje się u ok. 1 na 15000 dzieci, ale częstość jej występowania jest różna w różnych populacjach.

Bezwodnikowe wiązania (tworzone między cząsteczkamikwasu fosforowego lub między cząsteczką kwasu fosforowego igrupą karbonylową przez odłączenie cząsteczki wody) mają

duży ujemny potencjał termodynamiczny (dG hydrolizy)

CYKL MOCZNIKOWY

Sumaryczny zapis reakcji cyklu mocznikowego

• CO2 + NH4+ + 3 ATP + asparaginian + 2 H2O.

• .mocznik + 2 ADP + 2 Pi + AMP + PPi + fumaran

MOCZNIK

Jest to główny końcowy metabolit przemiany białkowej. Stężenie mocznika we krwi jest wypadkową produkcji która zachodzi wyłącznie w wątrobie i nerkowego wydalania,

zwiększa się ona wraz z wiekiem.

ZAKRES WARTOŚCI PRAWIDŁOWYCH

Norma dla mocznika 2,5-6,4 mmol/l lub 15 -39 mg/100ml

WARTOŚCI PODWYŻSZONE

Zwiększenie stężenia mocznika jest prawie zawsze dowodem upośledzonej czynności wydalniczej nerek.

-dieta bogata w białka

-nadmierny katabolizm białek w ustroju (gorączka, posocznica)

-krwawienie do przewodu pokarmowego

-niewydolność nerek

-niewydolność pozanerkowa np. zwężenie moczowodów.

Oznaczanie mocznika metodą ureazową

odczynniki

• preparat ureazy

• 3% roztwór Na2SO4

• 10% roztwór ZnSO4

• 0,5 M roztwór NaOH

• wzorcowy roztwór NH4Cl zawierający 0,01 mg N w 1 ml ( 25 ml roztworu NH4Cl o stężeniu 1,53 mg/ml + 10 ml 1 M H2SO4 dopełnić do 1 l)

odczynnik Neslera

• w kolbie rozpuścić 30 g KI dodać 22g jodu + 30 g metalicznejrtęci.

• Mieszaninę wstrząsać . zdekantować roztwór znad metalicznejrtęci. I uzupełnić wodą do 400 ml.

• Roboczy odczynnik Neslera: do75 ml roztworu macierzystegododać 75 ml wody i 350 ml 10% NaOH. Powstały po kilkudniach osad odwirować. Klarowny roztwór używać dooznaczeń. Przechowywać w ciemnej butelce.

Wykonanie

• Do 3,2 ml 3% Na2SO4 dodać 0,2 ml krwi. Dodać 20 mg ureazy i inkubować 20 min w 37oC.

• Dodać 0,3 ml 10% ZnSO4 0,3 ml 0,5 M NaOH by strącić białka.

• Wstrząsnąć i odwirować.

• Do 2 ml supernatantu dodać 5ml wody i 1 ml odczynnika Nesslera

• W drugiej probówce sporządzić roztwór wzorcowy biorąc 2 lub 5 ml NH4Cl i 5 lub 2 ml wody dodać 1 ml odczynnika Nesslera.

• Oznaczać spektrofotometrycznie przy długości fali 430 nm

Obliczenie

• mg mocznika /100ml=(Ap/Aw) * Cw*(100/0,05)*2,14

• Cw=0,02 mg gdy dano 2 ml NH4Cl lub 0,05mg gdy dano 5 ml wzorca

•1 mg N odpowiada 2,14 mg mocznika.

ĆWICZENIE 6

Glukoza

• Naszym źródłem energii jest pokarm. Energiękumulują wszystkie podstawowe składniki pożywienia-białka, tłuszcze i węglowodany.

• Głównym paliwem organizmu pozostaje tylko jeden z nich - glukoza - cukier pochodzący z przemian niemal szystkich strawnych węglowodanów.

• Po poziomie glukozy organizm rozpoznaje dostatek lub deficyt energetyczny.

• Glukoza jest głównym źródłem energii dlanaszego mózgu. Mózg zawsze potrzebujeglukozy.

Homeostaza glukozy

• Homeostaza glukozy jest wypadkową dopływu glukozy do krwi oraz jej zużycia w komórkach.

• Ważną rolę w utrzymaniu homeostazy glukozy odgrywają procesy metaboliczne w mięśniach szkieletowych i wątrobie.

• Wpływ na przebieg procesów metabolicznych w tkance mięśniowej wywiera wiele czynników, najważniejsze to:

• Najważniejsze hormony biorące udział w tej regulacji stężenia glukozy to: insulina i glukagon.

Glikoliza

• Glikoliza jest podstawowym procesem wytwarzającym energię w żywym organizmie. Substratem jest glukoza, a produktem jest pirogronian, który w warunkach tlenowych przechodzi poprzez acetylo-CoA do cyklu kwasu cytrynowego, a w warunkach beztlenowych ulega redukcji do mleczanu.

• Bilans glikolizy w warunkach beztlenowych to 2 mole ATP z jednego mola glukozy, a w warunkach tlenowych sumarycznie 32 mole ATP z jednego mola glukozy ( łącznie z cyklem

Krebsa).

Glukoneogeneza

Glukoneogeneza to enzymatyczny proces tworzenia przez organizm glukozy z metabolitów nie będących węglowodanami, np. aminokwasów, glicerolu czy mleczanu. Głównym substratem jest pirogronian.

Glikogen

• Jest głównym wielocukrem stanowiącym materiał zapasowy w komórkach zwierzęcych. Ma strukturę rozgałęzionych łańcuchów. Rozgałęzienie następuje co 812 reszt glukozy. Glikogen

może być szybko rozkładany do glukozy. Do najbogatszych w ten materiał zapasowy tkanek należą wątroba, mięśnie.

Glikogenoliza

• Glikogenoliza -rozkład glikogenu do glukozo-6-fosforanu (w mięśniach) lub do glukozy (w wątrobie) powodujący uzupełnienie chwilowego niedoboru glukozy w różnych tkankach organizmu m.in. we krwi. Proces pobudzany przez glukagon adrenalinę i hormon wzrostu.

Insulina

• Insulina to hormon peptydowy o działaniu ogólnoustrojowym, odgrywający zasadniczą rolę w metabolizmie węglowodanów oraz białek i tłuszczów.

• Nazwa insulina z łac. insula -wyspa, pochodzi od wysepek Langerhansa trzustki, gdzie insulina jest produkowana.

• Insulina produkowana jest przez komórki ß (komórki B) wysp trzustki.

• Najważniejszym bodźcem do produkcji insuliny jest poposiłkowe zwiększenie stężenia glukozy we krwi.

• Insulina sygnalizuje stan nasycenia substratami energetycznymi i stymuluje ich magazynowanie oraz syntezę białek

• Stymuluje syntezę glikogenu w mięśniach i wątrobie

• Przyspiesza w wątrobie glikolizę co zwiększa syntezę kwasów tłuszczowych.

• Powoduje wnikanie glukozy do mięśni i tkanki tłuszczowej

Glukagon

• to hormon produkowany w trzustce przez komórki alfa o działaniu przeciwstawnym do insuliny, podwyższający poziom glukozy we krwi. Działa głównie na wątrobę

• Stymuluje rozkład glikogenu i glukoneogenezę.Inhibuje syntezę kwasów tłuszczowych , glikolizę

• W czasie wysiłku fizycznego dochodzi do zwiększonego wykorzystywania substratów energetycznych, zwiększa się ich uwalnianie z magazynów tkankowych i udostępnianie do

przemian.

• Głównym substratem energetycznym, szczególnie w pierwszym etapie pracy mięśniowej, jest glukoza krążąca we krwi, pochodząca z glikogenu, oraz syntetyzowana w wątrobie.

• Zapasy glukozy zmagazynowane w formie glikogenu w mięśniach i wątrobie nie są duże i przy dłuższym wysiłku fizycznym ulegają wyczerpaniu.

• Po zakończeniu pracy następuje resynteza glikogenu, która jest stymulowana przez insulinę

• Glikogenu wystarcza na 8-12 godzin bez wysiłku lub ok. 2 godziny intensywnego wysiłku.

Regulacja poziomu glukozy w organizmie

• Regulacja poziomu glukozy we krwi związana jest z pracątrzustki, która wytwarza insulinę i glukagon oraz z pracąwątroby i mięśni

• Insulina pobudza przetwarzanie glukozy w glikogen i ułatwiatransport glukozy z krwi do komórek

• Glukagon pobudzający rozkład glikogenu do glukozy

• Wątroba i mięśnie magazynują nadmiar glukozy w postaciglikogenu. W przypadku niedoboru glukozy zmagazynowany wwątrobie i mięśniach glikogen zostaje rozłożony do glukozy.

• Nadmiar węglowodanów jest przekształcany w organizmieczłowieka w tłuszcze i magazynowany w tkance podskórnej.

Poziom glukozy we krwi

• Tkanką, która zawsze potrzebuje glukozy jestmózg, dlatego zachowanie homeostazy glukozyważne dla prawidłowej pracy organizmu.

• Mózg potrzebuje glukozy (ok. 150 gramów dziennie),a nie ma możliwości jej magazynowania

• We krwi stężenie glukozy wynosi ok. 90mg na 100cm3.W czasie intensywnego wysiłku fizycznego jej stan może spaść nawet do 70mg/100cm3,

• Spadek poziomu glukozy poniżej 60mg jest określany, jako hipoglikemia i staje się niebezpieczny.

• Podwyższony poziom cukru we krwi to hiperglikemia. Objawy obserwuje się przy stężeniu powyżej 200 mg/100cm3 ale stały podwyższony poziom (120mg/100ml) prowadzi do uszkodzeńorganizmu

Hipoglikemia-najważniejsze objawy

• silne uczucie głodu

• osłabienie

• nudności i wymioty

• niepokój

• zlewne poty

Organizm w czasie hipoglikemii stara się dostarczyć do mózgu glukozę który nie gromadzi zapasów glukozy.

Hormonami podnoszącymi stężenie glukozy we krwi są:

• adrenalina

• glukagon

• kortyzol

• hormon wzrostu

Hiperglikemia - zbyt wysoki poziom cukru we krwi.

• najczęściej powodem jest źle kontrolowana cukrzyca

• brak insuliny, insulinooporność

• przejadanie się

• zbyt mała aktywność fizyczna

Hiperglikemia-objawy

• nadmierne pragnienie

• wysychanie w ustach

• częstomocz

• chudnięcie

• nadmierna senność

Oznaczanie glukozy

• Wszystkie badania dotyczące stężenia glukozy wekrwi wykonuje się na czczo.

• Po posiłkach stężenie glukozy wzrasta.

• Krew ma właściwości glikolityczne, wskutek czegozawartość cukru we krwi wyrażnie maleje z czasem.Zapobiegamy dodając fluorek sodu 3mg/ml

• Krew odbiałcza się koloidalną zawiesiną ZnOH. Przesącz gotuje się z roztworem zawierającym Cu(ii) Cu(I) wypada z roztworu w postaci Cu2O. Tlenek miedzi rozpuszcza się w odczynnikuarsenomolibdenowym, dając niebieskie zabarwienie.

Odczynniki

• 1) 0,45% ZnSO4

• 2) 0,1 M NaOH

• 3) Odczynnik miedziowy I. W 600 ml wrzącej wody rozpuścić 200g bezwodnego Na2SO4. Oddzielnie w 100 ml wody rozpuścić 25 g soli Seignetta (winianu sodowopotasowego). Obydwa roztwory zmieszać dodać 20 g wodorowęglanu sodu i 25 g węglanu sodu i dopełnić do 1 l.

• Przesączyć. Przechowywać w 37oC. ( może się wytrącać).

• 4) Odczynnik miedziowy II 15% roztwór CuSO4 *5H2O + 2 krople H2SO4

• 5) mieszaninę roztworów miedziowych (I i II) w stosunku 1: 25 sporządzić bezpośrednio przed użyciem.

• 6) Odczynnik arseno molibdenowy. Rozpuścić 25 g molibdenianu (VI) amonowego w 450 ml wody. Dodać 31 ml stęzonego H2SO4. Rozpuścić 3 g arsenianu(V) sodowego (Na2HAsO4*7H2O) w 25 ml wody. Oba roztwory zmieszać. Inkubować w temp 37oC przez 48 h. Przechwywać w ciemnej butelce.

• 7) Roztwór wzorcowy glukozy o stężeniu 200 mg/100 ml.

Wykonanie

• Przygotować mieszaninę ZnSO4 i 0,1 M NaOH w stosunku 5:1. Do 2,9 ml mieszaniny dodać 0,1 ml krwi z opuszki palca.Próbkę grzać we wrzącej łażni wodnej 5 min.

• Po ostudzeniu przesączyć.

• Do 1 ml przesączu dodać 1 ml odczynnika 5 (miedziowego) igotować na łażni 20 min. Po ostudzeniu dodać 1ml odczynnikaarseno-molibdenowego i wstrząsać aż rozpuści się tlenek

miedzi. Dodać 7 ml wody i oznaczać spektrofotometrycznieprzy długości fali 660 nm.

• Analogicznie postępować ze wzorcem. Pobrać 0,1 ml roztworuwzorcowego z przyrządzonych roztworów w zakresie 10 do 200mg/100ml.

Obliczenia

• W tym zakresie krzywa ma charakter liniowy

• Stężenie wynosi

• •mg glukozy /100ml=(Ap/Aw) * Cw*

• •Cw= stężenie glukozy we wzorcu

Glikoliza

• Sumaryczna reakcja glikolizy przekształcenia glukozy wpirogronian jest następująca:

glukoza + 2Pi + 2ADP + 2NAD+ ›

• 2 cząsteczki pirogronianu + 2ATP + 2NADH + 2H+ + 2H2O.

• Jeśli zabraknie substratów to reakcja nie będzie zachodziła przy braku tlenu, podczas intensywnego wysiłku, ilość wytwarzanego NADH przekracza zdolnośćłańcuchaoddechowego do utleniania NADH z powrotem do NAD +.

• W warunkach tlenowych pirogronian zostaje przekształcony w acetylo-CoA (dehydrogenaza pirogronianowa)

pirogronian + NAD+ + CoA › acetylo-CoA + CO2 + NADH.

przy braku tlenu, podczas intensywnego wysiłku, ilość wytwarzanego NADH przekracza zdolność łańcucha oddechowego do utleniania NADH z powrotem do NAD +.

• Zadaniem cyklu Krebsa jest utlenić związek o nazwie:acetylokoenzym A (acetylo-CoA) do 2 cząsteczek dwutlenku węgla (CO2), pozyskaną w tym procesie energię ulokować w chemicznych nośnikach energii: GTP, NADH i FADH2.

Sumaryczny wzór cyklu Krebsa to:

acetylo-CoA + GDP + Pi + 3NAD+ + FAD + 2H20 ›

CoA + GTP + 3NADH + 3H+ + FADH2 + 2CO2

Powstają wysokoenergetyczne związki wymagające tlenu

Jeśli zabraknie substratów to reakcja nie będzie zachodziła3NAD+ + FAD

Brak NAD + powoduje że pirogronian syntetyzowany w mięśniach szkieletowych podczas glikolizy zostaje przekształcony w mleczan przez dehydrogenazę mleczanową w reakcji generującej NAD+, dzięki czemu glikoliza w dalszym ciągu wytwarza ATP.

Mleczan dyfunduje z mięśni do krwi, skąd przechodzi do wątroby.

W wątrobie, z udziałem dehydrogenazy mleczanowej zostaje przekształcony z powrotem w pirogronian.

Pirogronian w procesie glukoneogenezy ulega przekształceniu w glukozę; ta trafia do krwiobiegu, skąd może być pobierana przez mięśnie szkieletowe (i mózg).

Porównanie warunków tlenowych i beztlenowych

• W obecności tlenu NADH jest utleniany i powstaje NAD+

• NADH +1/2 O2 .> NAD+ +H2O dG= -220 kJ/mol

• ADP + Pi + H+ ---> ATP + H2O dG= +30,5 kJ/mol

• W warunkach beztlenowych pirogronian przekształcany jest w kwas mlekowy

• Pirogronian + NADH + H+ <-> kwas mlekowy +NAD+

• Powstawanie NAD+ dostarcza substratów dla glikolizy

• Kwas mlekowy (LA)- końcowy produkt glikolizy beztlenowej, uważany jest za jeden z czynników wywołujących zmęczenie mięśni, wielkość jego stężenia daje informację o intensywności (ciężkości) wykonywanego wysiłku, jest wykorzystywany w badaniach sportowych.

Próg mleczanowy

• Próg Mleczanowy zwany, progiem przemian beztlenowych, progiem anaerobowym jest obciążeniem treningowym, po którego przekroczeniu stężenie kwasu mlekowego we krwi

wzrasta

• Po przekroczeniu tego poziomu energia dostarczana jest w wyniku procesów beztlenowych, zmniejszeniu ulega udział wolnych kwasów tłuszczowych w procesie dostarczania energii.

• W czasie wysiłku powstaje mleczan, jako produkt uboczny przemian metabolicznych.

• Stężenie mleczanu we krwi wzrasta wraz z intensywnością wysiłku, gdy powstaje go więcej niż organizm może neutralizować -to ten moment nazywamy progiem mleczanowym.

• Przyjmuje się, że mniej niż 2 mmol/l kwasu mlekowego (milimole na litr) jest typowe dla spoczynku,

• 2 -4 mmol/l to wartość optymalnego treningu,

• 4 -8 mmol/l zakwaszenie mięśni jest już znaczne,

• powyżej 8 mmol/l organizm włącza mechanizmy obronne ATP nie może być dalej resyntezowane, komórki mięśniowe przestają pracować i wysiłek musi zostać przerwany.

• Badanie stężenia mleczanu we krwi, zarówno spoczynkowe jak i wysiłkowe,jest dobrym testem diagnozującym wydolność i zdolność regeneracji człowieka.

• Przyjmuje się, że próg mleczanowy osiągany jest przy wartości tętna 85% HRmax

• Aby testy były ze sobą porównywalne należy je przeprowadzać o podobnych godzinach. Najlepszą porą na przeprowadzenie testu jest poranek. Spowodowane jest to cyklem około

dobowym, podczas którego wiele wskaźników ulega wahaniom. W dniu badań należy ograniczyć picie kawy a na 3 godziny przed testem spożywania posiłków. Jeżeli podczas badań będzie oznaczana morfologia krwi, należy badania prowadzić na czczo

Hrmax (HEART RATE)

• Formuła Sally Edwards - dosyć dokładna metoda obliczania HRmax, bo uwzględnia wagę i płeć.

Mężczyźni HRmax = 210 -1/2 wieku - 1% masy ciała w funtach + 4

Kobiety HRmax = 210 - 1/2 wieku -1% masy ciała w funtach + 0

kiedyś liczono: Hrmax= 220 - wiek, bo błąd tutaj zwykle nie

przekracza 5%

• 220 bo takie tempo bicia serca noworodka

Trening podprogowy

• ćwicząc w tej strefie stopniowo podnosimy LT (lactate threshold -próg mleczanowy), w efekcie przy większej intensywności dłużej zostajemy w strefie tlenowej, co jest dla organizmu bardzo korzystne.

• Częsty trening ponadprogowy (anaerobowy) obniża LT, w konsekwencji wydolność stopniowo spada, czas regeneracji się wydłuża, pojawiają się różne dolegliwości, gdyż stały ,wysoki poziom mleczanu we krwi obniża odporność.

• Próg mleczanowy należy przekraczać w kontrolowany sposób

Strefy HR

• Strefa 0 (do 50% HRmax) - aktywność na tym poziomie niepoprawia zdolności organizmu ze sportowego punktu widzenia

Obliczenia oraz opisy stref odnoszą się do ćwiczeń opartych w głównej mierze na pracy dolnej połowy ciała, ze szczególnym naciskiem na marsz i biegi.

Aby wyliczać progi i korzystać ze stref w przypadku ćwiczeń angażujących górną połowę ciała trzeba obniżyć progi średnio o 13 uderzeń serca na minutę.

Dług tlenowy

• dług tlenowy, stan fizjologiczny organizmu lub jego narządu związany z czasowym (zwykle krótkotrwałym) przestawieniem procesów oddychania komórkowego z tlenowego na

beztlenowy); po przywróceniu warunków tlenowych część energii zużywana jest na zmetabolizowanie nagromadzonych produktów oddychania beztlenowego i odbudowanie rezerw substratów oddechowych wykorzystywanych w warunkach beztlenowych

Pułap tlenowy

• Pułap tlenowy (VO2max) -zdolność pochłaniania tlenu przez organizm. Jest to jeden z najpopularniejszych wskaźnikówwydolności fizycznej, szczególnie wydolności tlenowej. Częstociężkość (intensywność) wysiłku określa się w procentachVO2max.

• Za poziom VO2 max niezbędny do podołania codziennym obowiązkom i utrzymania pożądanej jakości życia przyjmuje sięwartość 15-17 ml•kg-1•min-1

• Przeciętnie wynosi około 30 - 40 ml•kg-1•min-1

• Wydolność tlenową ocenia się metodą bezpośrednią, przez pomiar maksymalnej wartości VO2 max (maksymalna wartość poboru tlenu). Pomiar ten wykonuje się w badaniuwytrzymałości na cykloergometrze

Oznaczenie stężenia kwasu mlekowego we krwi+

• Oznaczenie stężenia kwasu mlekowego polega na reakcji kwasu mlekowego z NAD+. Powstający NADH oznaczamy spektrofotometrycznie wykorzystując różnicę w absorpcji światła NADH i NAD+.Absorbancję mierzymy przy długości fali 340 nm stosujemy współczynnik absorbancji 6,22 mmol dla NADH

• Aby reakcja zaszła całkowicie dodajemy hydrazyny, która rozkłada pirogronian, usuwając produkt przesuwamy równowagę reakcji w prawo.

• Dodajemy fluorku sodu by przeciwdziałać glikolitycznej aktywności krwi i wiążącego wapń EDTA by zapobiec krzepnięciu krwi

ĆWICZENIE 7

Energia kwasów tłuszczowych

• Kwasy tłuszczowe są główną formą magazynowania energii organizmu

• Węgiel jest w postaci zredukowanej jako CH2

• Kwasy tłuszczowe są bardzo ściśle upakowane w tkance tłuszczowej, gdyż w odróżnieniu od węglowodanów i białek nie ulegają hydratacji

Rola kwasów tłuszczowych

• Materiał energetyczny (triacyloglicerole)

• Składniki błon (glicerofosfolipidy i sfingolipidy - pochodne aminoalkoholu sfingozyny)

• Uczestniczą w modyfikacji kowalencyjnej białek

• Pochodne kwasów tłuszczowych są hormonami i wtórnymi cząsteczkami sygnalizacyjnymi

Kwasy tłuszczowe -pożywienie

• Zawierają 30-60% energii pobieranej w przeciętnej diecie:Triacyloglicerole, fosfolipidy

• Główne źródła:

Trawienie triacylogliceroli

• Zachodzi w dwunastnicy

• Biorą udział

• Triacyloglicerol --------> Glicerol + Kwasy Tłuszczowe

b .-oksydacja kwasów tłuszczowych

• Aktywacja kwasu tłuszczowego poprzez estryfikację z CoASH

• Transport acylo-CoA przez błonę mitochondrium

• Reakcje procesu ß-oksydacji

• Odwodornienie

• Hydratacja

• Odwodornienie

• Tiolityczne rozerwanie wiązania z udziałem drugiej cząsteczki

Transport kwasów tłuszczowych

• Kwasy tłuszczowe o długich łańcuchach nie mogą wnikać do mitochondriów w sposób bierny, są transportowane aktywnie z użyciem karnityny

• Grupa acylowa przenoszona jest z atomu siarki CoA na grupę OH karnityny i w tej postaci dostaje się do mitochondriów

• Po wejściu do mitochondrium następuje przeniesienie grupy acylowej na siarkę CoA

• Karnityna wraca do cytozolu

Suplementacja karnityną

• Stosowano suplementację karnityną ale bez rezultatów, sądoniesienia o jej skuteczności oraz o braku skuteczności

• Proces wieloetapowy zawsze jest hamowany (ograniczanajest jego szybkość) po przez szybkość najwolniejszego etapu.

• Jeśli mamy niedobór karnityny (patologie, wegetarianie) suplementacja karnityną poprawi szybkość transportu WKTdo mitochondriów.

• W normalnych warunkach nic się nie zmieni bo szybkość uzyskiwania energii limituje limituje szybkość rozkładu WKT

• karnityna u ludzi jest dostarczana z pożywieniem i syntetyzowana. Głównym źródłem karnityny w żywności są mięso i przetwory mleczne.

• Pokarmy pochodzenia roślinnego zawierają śladowe ilości karnityny.

• Dzienne zapotrzebowanie zdrowej, dorosłej osoby na karnitynę wynosi średnio 15 mg. Synteza wynosi 11- 34 mg karnityny dziennie, a z dietą dostarczane jest codziennie średnio 20-200 mg. U wegetarian ilość karnityny w pożywieniu jest dużo mniejsza i wynosi

ok. 1 mg/dzień. cząsteczki CoA

Regulacja syntezy kwasów tłuszczowych

• Proces kontrolowany jest przez aktywność karboksylazy acetylo-CoA, katalizującej tworzenie malonylo-CoA.

• Karboksylaza traci aktywność po ufosforylowaniu przez kinazę białkową zależną od AMP. Jeśli jest duże stężenie AMP (małe stężenie ATP) karboksylaza jest ufosforylowana i nieaktywna.

• Defosforylacja kinazy przez fosfatazę białkową 2A, przywraca jej aktywność.

• Glukagon i Adrenalina hamują fosfatazę białkową 2A, karboksylaza pozostaje ufosforylowana i jest nieaktywna

• Odwrotnie działa insulina, aktywuje fosfatazę, zdefofosforylowana fosfotaza jest aktywna i zachodzi synteza kwasów tłuszczowych

Regulacja glikolizy i cyklu Krebsa

• Najważniejszy etap regulacji, druga fosforylacja glukozy katalizowana przez PKF (fosfofruktokinazę) hamowaną allosterycznie przez ATP (związek wysokoenergetyczny),

• Hamowanie jest znoszone przez AMP (związek niskokoenergetyczny)

• Cykl Krebsa również jest hamowany przez duże stężenie ATP oraz przez NADH (wysokoenergetyczny), stymulowany przez ADP (niskoenergetyczny)

Energetyka komórki

• Poziom energetyczny komórki, ściśle związany ze stężeniem ATP,

• stężenie ATP decyduje czy energia jest wytwarzana czy magazynowana

Porównanie syntezy i rozkładu kwasów tłuszczowych

SYNTEZA

-Zachodzi w cytozolu

-Związek redukujący NADPH

-Grupy acylowe związane z ACP (białkowy nośnik grup acylowych)

-Jeden enzym, syntaza kwasów tłuszczowych, mający kilka miejsc aktywnych

-nakład energetyczny ok. 124 cząsteczek ATP

OKSYDACJA

-Zachodzi w mitochondrium

-Związek wytwarzany NADH

-Grupy acylowe związane z CoA

-Poszczególne etapy oksydacji katalizowane przez odrębne enzymy

-zysk 106 cząsteczek ATP

Glikogen i Tłuszcz

Glikogen

Tłuszcz

energetyczna)

Triacyloglicerole

• Triacyloglicerole ulegają przemianie do wolnych kwasów tłuszczowych (WKT), które stanowią podstawowe lipidowe źródło energii podczas wysiłku.

• Duże kwasy tłuszczowe są nierozpuszczalne w wodzie i transportowane są przez białka frakcji albumin osocza

• kwasy tłuszczowe o średniej i małej masie, są rozpuszczalne

Wpływ wysiłku na stężenie WKT we krwi

• bieg na 10 km

• przed po

• WKT (umol/l) 436 954

• Wolny glicerol 0,208 0,554

• Triacyloglicerydy 1,181 0,791

• sądzono, że średnio-łańcuchowe triacyloglicerole (MCT), rozpuszczalne w wodzie, mogą dostawać się do krążenia łatwiej niż normalne lipidy zawarte w diecie, a zatem mogą

być bardziej wydajnym źródłem energii podczas wysiłku

• badania nie wykazały istotnego udziału doustnie podawanych MCT w metabolizmie energetycznym podczas wysiłku. W innych badaniach stwierdzono nawet, że suplementacja MCT może obniżać tolerancję wysiłkową podczas zawodów kolarskich na dystansie 40 km

Oznaczanie triacylogliceroli

• Pobieramy krew na czczo po 12 - 16 godz głodzenia

• 2 tygodnie zwyczajnej diety pacjenci powinni jeść to co zwykle

• Wycofać leki obniżające poziom lipidów

• Triacyloglicerole obecne w surowicy ulegają hydrolizie enzymatycznej w obecności LPL do glicerolu i WKT a następnie oznacza się ilościowo zawartość glicerolu w obecności

oksydazy 3-fosfoglicerynowej pośrednio określając ilość uwolnionego nadtlenku wodoru poprzez pomiar aktywności peroksydazy. W czasie oznaczenia przebiegają reakcje z

udziałem wymienionych enzymów i kinazy glicerynowej

• WKT wolne kwasy tłuszczowe

• LPL-lipaza lipoproteinowa


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Biochemia ćw 8
biochemia ćw
pytania na wejsciowki cwiczeniowe z fizyki, SGGW zajecia, Fizyka, FIZYKA ćw zal semestru
Barwniki biochemia ćw 
ochrona powietrza ćw zal, Ochrona środowiska, Ochrona powietrza
biochemia ćw1v2, biochemia, ćw, sprawozdania, v2
BIOCHEMIA cw.2 made by Tomek - białka, biochemia
biochemia I 1 cw
Biochemia ćw. 4, Studia - Studiowanie Tematu, Chemia, Biochemia
biochemia I 2 cw
Biochemia ćw 5
biochemia ćw 1 3 (1)
biochemia ćw
Biochemia ćw 9
biochemia ćw 12
biochemia ćw 10
biochemia ćw 5
biochemia ćw 6
biochemia ćw 3

więcej podobnych podstron