Hybrydyzacja polega na tworzeniu podwójnej helisy między komplementarnymi niciami badanego DNA lub RNA a sondą molekularną. Techniki hybrydyzacji kwasów nukleinowych pozwalają na wykrycie i pomiar stężenia specyficznych sekwencji kwasu nukleinowego z wykorzystaniem znakowanej sondy DNA. Przed rozpoczęciem hybrydyzacji DNA lub RNA należy wyizolować i oczyścić preparat kwasów nukleinowych. Ważne jest, aby nie zanieczyścić próbki nukleazami, które zdegradują, cząsteczki kwasów nukleinowych. Należy więc dezaktywować nukleazy, np. przy pomocy DEPC (dietylopirowęglan).inkubację próbki, z proteinazą K, lub traktowanie jej tiocyjanianem guanidyny, która denaturuje białka. Można też dodać związku takiego jak, merkaptoetanol, który redukuje mostki dwusiarczkowe chroni się badany materiał przed RNazami endogennymi. Do metod hybrydyzacyjnych zaliczamy m.in.:

1. Analiza hybrydyzacji w roztworach, głównie w badaniach nad budową i strukturą genomów.

2. Hybrydyzację in situ, w której badaną tkankę inkubuje się z sondą w postaci znakowanego kwasu nukleinowego. Nadmiar sądy odmywa się i określa lokalizację tej jej części, która uległa hybrydyzacji. Jest to metoda o wysokiej czułości i specyficzności.

3. Hybrydyzacja na stałym nośniku:

• Metodę Southerna, oparta na elektroforetycznym rozdziale fragmentów DNA, które potem przenosi się na filtr nitrocelulozowy i inkubuje z sondą znakowaną DNA, co ma na celu wykrycie tych fragmentów DNA, które są komplementarne do sondy

• Metodę Northerna, będąca analogiczna metoda, z tym że analizie podawane jest RNA i dostarcza informacji o ekspresji genów,

• Hybrydyzacja punktow w której DNA jest bezpośrednio nakładany na membranę, unieruchamiany przez ogrzewanie bądź UV a następnie inkubowany z sondą molekularną

• DNA fingerprinting

Stosowane sondy są zdolne do wybiórczego wiązania się z sekwencjami do nich komplementarnych. Odpowiednio przygotowana i zastosowana w warunkach optymalnych sonda molekularna rozpoznaje sekwencje różniące się kilkoma nukleotydami i tworzy trwałe wiązania z wyłącznie komplementarnym fragmentem kwasu nukleinowego. Pozwala to specyficznie wykrywać interesujące nas sekwencje mimo obecności dużej ilości innych nie komplementarnych cząsteczek. W diagnostyce molekularnej stosowane są krótkie lub długie sondy molekularne, mogą to być syntetyczne oligomery, syntetyczne bądź naturalne geny lub ich fragmenty, cDNA, fragmenty chromosomów lub całe genomy bakteryjne. Sondy wyznakowane są radioaktywnie, enzymatycznie lub fluorochemicznie a czułość badań zależy od sposobu znakowania sondy. Niezależnie od wariantu technicznego wyróżniamy kilka charakterystycznych etapów hybrydyzacji: unieruchomienie denaturowanego DNA lub RNA na membranie, inkubowanie w roztworze sondy, odpłukanie niezwiązanej sondy, wykrywanie hybrydów,np. przez autoradiografię.

Hybrydyzacja metodą Southerna.

Metoda Southerna jest jedną z najczęściej stosowanych metod hybrydyzacji DNA:DNA Podczas przygotowywania DNA do metody Southerna tnie się je enzymem restrykcyjnym na fragmenty restrykcyjne. Pozbawione struktur drugorzędowych próbki mogą zostać rozdzielone pod względem masy cząsteczkowej w żelu agarozowym . W metodzie Southerna, DNA w żelu jest nadal dwuniciową należy, więc je denaturować przed hybrydyzacją, gdyż sonda wiąże się tylko do jednoniciowych struktur. Po procesie elektroforezy DNA lub RNA należy przenieś na membranę nitrocelulozową lub nylonową i przeprowadzić hybrydyzację. Możemy wyróżnić 5 rodzajów transferu:

• Kapilarny transfer ku górze

• Kapilarny transfer ku dołowi

• Spontaniczny transfer do dwóch membran

• Elektroforeza

• Transfer w próżni

Sondy stosowane w hybrydyzacji Southerna znakowane są najczęściej radioaktywnie (³²P). Przygotowanie takiej sondy polega na odzyskaniu przy pomocy trawienia z wektora molekularnego, najczęściej plazmidu interesującej nas sekwencji. Fragmenty restrykcyjne, czyli matryce z wektora są następnie znakowane z użyciem losowych heksametrów lub oligo-T. Znakowanie odbywa się poprzez syntezę nowych nici badanej poszukiwanej sekwencji na matrycy sekwencji z wektora. Denaturowane termicznie matrycowe DNA mieszamy z mieszaniną losowych heksametrów. Heksamery te parują ze wszystkimi komplementarnymi miejscami, jakie odnajdą na matrycy a polimeraza DNA rozpoczyna syntezę nowych nici przy pomocy dATP, dGTP, dTTP, dCTP. Siła sygnału sondy radioizotopowej w hybrydyzacji zależy od immobilizacji DNA, komplementarności sond i ich specyficzności oraz ilości DNA na membranie.  Co raz częściej w procesie znakowania sond molekularnych radioizotopy fosforu zastępowane są ligandami rozpoznawanymi przez swoiste przeciwciała skoniugowane z  enzymem. Sondy znakowane digoksygeniną, dinitorfenolem, bromodeoxyurydyną, biotyną, streptawidyną w których wykrycie ligandu przebiega z zastosowaniem reakcji immunochemicznych i kolorymetrii, jak również sondy dla których końcowym sposobem detekcji jest chemiluminescencja znajdują coraz szersze zastosowanie. Do enzymów reporterowych możemy zaliczyć alkaliczną fosfatazę, peroksydazę chrzanową, β-galaktozydazę, 9oksydazę ksantynową, oksydazę glukozową.

DNA fingerprinting.

DNA fingerprinting jest odmianą metody Southerna mającą zastosowanie w diagnostyce. Pozwala ona uwidocznić po przez hybrydyzację z sondą molekularną proste nukleotydowe powtórzenia, charakterystyczne dla poszczególnych osobników w populacji. DNA fingerprinting stosowany jest na przykład w badaniach dotyczących wykrywania ojcostwa.

---