Modele badań genetycznych.
Organizmy modelowe w badaniach genetycznych to wybrane gatunki reprezentujące grupę zwierząt , które poddane określonym eksperymentom mogą dostarczać cennych informacji dla poznania procesów genetycznych kontrolujących rozwój zarodkowy czy funkcjonowanie poszczególnych genów lub kompleksów genów w badanym organizmie. Ponadto na podstawie takich obserwacji można wnioskować o występowaniu podobnych mechanizmów u gatunków pokrewnych. Większość wiadomości z zakresu biologii rozwoju i embriologii jakie obecnie posiadamy na temat określenia osi ciała zarodka i tworzenia się ogólnego schematu budowy organizmu pochodzi właśnie z badań modelowych organizmów zwierzęcych.
Przy typowaniu organizmu modelowego bierze się pod uwagę takie cechy jak: łatwość hodowli i utrzymywania dużych populacji w laboratorium, wysoką płodność, krótki cykl życiowy, łatwość manipulacji chirurgicznych i transplantologicznych w warunkach in vitro i in vivo oraz ocenia się czas eksperymentu i koszty. Obok bakterii i drożdży warunki takie spełniają dwa modelowe gatunki w obrębie bezkręgowców: muszka owocowa (Drosophila melanogaster) oraz nicień (Caenorhabditis elegans), a wśród kregowców : ryba pręgowana (Brachydanio rerio), żaba szponiasta (Xenopus laevis), kura domowa (Gallus domesticus) i mysz (Mus musculus).
Drosophila melanogaster
Muszka owocowa jako model służy od początku XX wieku, kiedy to T. Morgan obserwował w naturalnej populacji pojawiające się mutanty jednogenowe o łatwo rozróżnialnych cechach np. kolor oczu. Krzyżując między sobą rozmaite mutanty jako pierwszy odkrył geny sprzężone segregujące niezgodnie z prawami Mendla, co doprowadziło do opracowaniem pierwszej mapy genetycznej określającej odległości między genami na podstawie częstości rekombinacji pomiędzy sprzężonymi loci.
Również chromosomy olbrzymie (politeniczne) obecne w śliniankach larw muchówek stały się modelowym obiektem mapowania niektórych genów na podstawie korelacji aberracji chromosomowych typu delecji, translokacji czy duplikacji (widocznych pod mikroskopem) z wystąpieniem mutacyjnych zmian fenotypowych. Ponadto dzięki obserwacjom chromosomów olbrzymich , podobnie jak chromosomów szczoteczkowych u płazów dokonano także pierwszych odkryć zależności między strukturą chromosomów a ich stanem funkcjonalnym, wynikającym z zapotrzebowania na duże ilości różnych białek w danym momencie rozwoju.
Chromosomy olbrzymie powstają w wyniku dziesięciu cykli replikacyjnych, po których nie następuje podział na chromosomy potomne. W ten sposób powstaje około 1024 (210) identycznych, położonych obok siebie nici chromatydowych. Chromosomy te wykazują łatwo rozpoznawalny wzór chromomerowy (naprzemiennie występujące prążki jasne i ciemne. Ciemne odpowiadają skondensowanej, nieaktywnej heterochromatynie, natomiast jasne regionom luźniejszej, aktywnej euchromatynie. Podczas rozwoju larwalnego przejściowo na chromosomach olbrzymich powstaje szereg nabrzmiałych „puf”. Są to miejsca intensywnej transkrypcji rDNA . Lokalizacja oraz czas trwania stadium „puf” odzwierciedla różne fazy rozwoju larwalnego W przypadku chromosomów olbrzymich dochodzi więc do zwielokrotnienia liczby genów na drodze endomitozy, natomiast w chromosomach szczoteczkowych oocytów płazów występuje amplifikacja genów kodujących rRNA , co powoduje uwypuklenie symetrycznych, dobrze widocznych, pętli chromatydowych.
W biologii rozwoju muszka jest organizmem modelowym już od ponad 20 lat. To właśnie dzięki badaniom na modelu Drosophila m. udało się zrozumieć, w jaki sposób niezróżnicowany zarodek uzyskuje informację niezbędną do wytworzenia się złożonych części ciała. A ponadto okazało się, że podstawowe mechanizmy planu budowy ciała muszki są podobne do odpowiednich mechanizmów u innych organizmów, włącznie z człowiekiem..
Klasyczna metoda badania roli genów rozwoju odpowiedzialnych za różnicowanie się komórek i narządów polega na analizie zmian spowodowanych mutacjami. Mutacje te powodują zmiany determinacji losów komórek w poszczególnych liniach zaburzając tym samym plan budowy organizmu,, co w efekcie daje usytuowanie prawidłowo wykształconych narządów w nietypowych miejscach. Przykładowo: udało się spowodować mutację określaną jako homeotyczną, w wyniku której, zamiast czułka na głowie muszki wyrastały odnóża, inna mutacja z kolei powodowała zamianę części segmentu odwłoku na część tułowiową co prowadziło do wyrastania drugiej pary skrzydeł.
Mutacje rozwojowe pozwoliły na zlokalizowanie około100 genów zaangażowanych w kontrolę rozwoju owada. Geny te tworzą ścisłą hierarchię, w której geny wyższej kategorii regulują aktywność genów podrzędnych. W tej grupie genów znajdują się geny homeotyczne (HOM) zidentyfikowane po raz pierwszy u Drosophila m. Geny HOM występują w DNA wszystkich komórek muszki, ale czynne są tylko w niektórych. Geny te nadzorują specjalizowanie się segmentów ciała i wykształcenie charakterystycznych dla nich narządów.
Geny HOM tworzą u muszki pojedynczy kompleks składający się z 8 genów, który zlokalizowany jest w chromosomie 3. Ekspresja genów HOM występuje w ściśle określonym porządku przestrzennym i czasowym. Geny usytuowane najbliżej końca 3' decydują o rozmieszczeniu narządów w segmentach części głowowej zarodka a bliższe końca 5' w części ogonowej (jest to mechanizm przednio-tylnej specyfikacji). Kontrola ekspresji genów HOM związana jest więc z ich lokalizacją chromosomową.
Klonowanie genów homeotycznych wykazało, że wszystkie one zawierają sekwencję długości 180 nukleotydów o bardzo wysokim stopniu homologii. Sekwencja ta została nazwana homeoboksem, który koduje domenę białkową (homeodomenę) o długości 60 aminokwasów, złożoną z trzech fragmentów tworzących strukturę typu „heliks-skręt-heliks”. Homeodomena jest składnikiem białek o charakterze czynników transkrypcyjnych wiążących się z DNA i regulujących ekspresję powiązanych ze sobą funkcjonalnie zespołów różnych genów {geny regulatorowe}
Geny te są wysoce konserwatywne ponieważ obecność homeoboksu stwierdzono u różnych zwierząt ewolucyjnie odległych od siebie (u nicieni, pierścienic, jeżowców, prymitywnych strunowców i u kręgowców włącznie z człowiekiem). Tak wysoki stopień homologii jest wynikiem wspólnego pochodzenia genów kodujących homeodomenę. Są one prawdopodobnie powieleniem hipotetycznej sekwencji w toku ewolucji której, amplifikacja stworzyła serię różnie ewoluujących genów ale z dużą homologią homeoboksów.
Geny te zostały dość dobrze poznane u człowieka i nazwano je genami HOX.. Zidentyfikowano około 30 różnych genów HOX, które występują w 4 kompleksach: HOXA, HOXB, HOXC i HOXD zlokalizowanych odpowiednio w chromosomach pary 7, 17, 12 i 2. Ułożenie genów w każdym z tych kompleksów jest określone. Najbardziej homologiczne w stosunku do siebie geny, tworzące tzw. podrodziny występują w tej samej kolejności. A więc geny zajmujące tę samą pozycję w różnych kompleksach są bardziej do siebie podobne niż geny sąsiadujące w jednym kompleksie. Homologia tych genów dotyczy głównie sekwencji kodujacych homeodomenę. Podobnie jak u Drosophila m. również u kręgowców istnieje określony porządek czasowo-przestrzenny w kolejności genów od 3' do 5'i taka sama funkcja decydująca o wytyczeniu planu ciała zarodka wzdłuż ośrodkowego układu nerwowego i zawiązków kończyn. A więc mechanizm przednio-tylny został utrzymany w toku ewolucji.
Należy podkreślić wielkie znaczenie odkrycia sekwencji homeoboksu. Ponieważ u ssaków nie pojawiają się mutanty homeotyczne (są letalne) nie można było wyszukać genów rozwoju metodami klasycznymi. Na ich ślad naprowadziły dopiero badania na Drosophila. Był to przełom, który zapoczątkował szybki postęp genetyki rozwoju.
Za badania poświęcone wczesnym etapom powstania zarodka i odkrycie funkcji homeodomeny została przyznana w 1995 roku nagroda Nobla, a w 2000 roku genom Drosophila został zsekwencjonowany.
Caenorhabditis elegans
Dzięki wyborowi nicienia Caenorhabditis elegans jako modelu eksperymentalnego prześledzono procesy podziału i różnicowania każdej komórki organizmu od stadium zapłodnionej komórki jajowej do dorosłego osobnika oraz opisano geny regulujące proces apoptozy. Było to możliwe ponieważ nicień ten jest przeźroczysty o dł.1,2 mm co ułatwiło śledzenie podziałów komórkowych pod lupą.. Ciało dorosłych osobników hermafrodytycznych składa się z 959 komórek, natomiast ciało samców zbudowane jest z 1031 komórek. Dodatkowo obecne są komórki płciowe w liczbie 1000-2000. Wszystkie tkanki pochodzą od 6 komórek wyjściowych. Los dwóch komórek potomnych powstających w wyniku każdego podziału komórkowego jest ściśle zdeterminowany genetycznie. Analiza indukowanych mutacji punktowych umożliwiła powiązanie konkretnych genów i ich mutacji z procesem podziału i różnicowania się komórek oraz ustalenie jakie geny odpowiadają za ukształtowanie i rozkład narządów wewnętrznych. Udowodniono również, że programowana śmierć komórek (apoptoza) jest naturalnym elementem przebudowy struktur tkankowych. Szczegółowe badania wykazały, że jedna na osiem powstających komórek nicienia obumiera na drodze apoptozy. Opisano geny ced-3 i ced-4związane z zaprogramowaną śmiercią samobójczą komórek oraz gen ced-9 blokujący działanie dwóch poprzednich Obecnie wiadomo, że jeden ze szlaków sygnałowych prowadzących do śmierci komórki istnieje u człowieka oraz innych gatunków i nie zmienił się w przebiegu ewolucji. Uczestniczą w nim cząsteczki podobne do produktów genów ced-3 , ced-4 i ced-9. Odpowiednikiem genu hamującego apoptozę ced-9 C.elegans jest u ludzi gen BCL-2 kodujący białko wewnętrznej błony mitochondrialnej
W 2002 roku Brytyjczycy S.Brenner i J.Sulston oraz Amerykanin H.Horovitz otrzymali nagrodę Nobla za odkrycia dotyczące udziału genów w regulacji rozwoju narządów i programowanej śmierci u C.elegans.
Genom nicienia został w całości zsekwencjonowany w 1998 r. i jak się okazało około 32% sekwencji kodujących wykazuje podobieństwo do sekwencji ludzkich.
W ostatnich latach postęp w rozwoju metod molekularnych badania DNA oraz fakt, że genom nicienia został poznany umożliwiły badanie ekspresji genów w kolejnych etapach rozwoju zarodkowego. Do tego typu badań wykorzystuje się mikromacierze DNA zwane też mikroczipami DNA. Są to szklane płytki z naniesionymi fragmentami znanych genów (w tym wypadku całym, pofragmentowanym genomem C.elegans), na które nakłada się roztwory zawierające wyizolowane z tkanek nicienia różne rodzaje mRNA będące, jak wiadomo, pierwszym produktem działania genów. W procesie hybrydyzacji znakowane fluorescencyjnie mRNA łączy się z komplementarnym DNA. W miejscach hybrydyzacji na płytce występuje świecenie przetwarzane komputerowo.
Zatrzymując rozwój zarodkowy C.elegans na kolejnych etapach (po kolejnych podziałach) z jego komórek uzyskiwano całe mRNA będące odzwierciedleniem aktywnych w danym momencie genów i stosowano technologię mikromacierzy. Dzięki tej metodyce można było precyzyjnie określić aktywność wielu genów jednocześnie oraz określić stosunki ilościowe pomiędzy poszczególnymi białkami w różnych etapach rozwoju.
3