GENETYKA MOLEKULARNA BAKTERII I WIRUSÓW
Organizacja materiału genetycznego bakterii
Pojedynczy chromosom prokariotyczny zawiera praktycznie całą informację genetyczną. Zdecydowana większość bakterii ma chromosom kolisty i nie posiada błony oddzielającej go od cytoplazmy co daje możliwość bliskiego występowania procesu produkcji mRNA na matrycy DNA oraz maszynerii odpowiedzialnej za biosyntezę białek.
W komórkach prokariotycznych procesy transkrypcji i translacji zachodzą jednocześnie do tego stopnia, że możliwe jest rozpoczęcie translacji na jednym końcu mRNA zanim zostanie zakończona transkrypcja na drugim końcu.
Kolisty chromosom bakteryjny jest podzielony na kilkadziesiąt pętli, które mają końce unieruchomione w białkowym szkielecie. Białka występujące w chromosomach bakteryjnych tzw. białka histonopodobne, poza organizowaniem DNA w chromosomie pełnią jeszcze pewne dodatkowe funkcje przypominając działaniem czynniki transkrypcyjne w komórkach eukariotycznych.
Mapa chromosomu bakteryjnego daje pewne wiadomości o jego organizacji. Poza niektórymi grupami genów skupionymi w operony, nie da się zaobserwować konkretnego wzorca, według którego następowałaby lokalizacja genów w chromosomie bakteryjnym. Transkrypcja operonów może zachodzić dla niektórych w jednym kierunku, a dla innych w przeciwnym.
Miejsce replikacji chromosomu bakteryjnego jest ściśle określone tzw.ori (origin of replication) dla każdego typu bakterii, ponadto podobna jest aranżacja genów zarówno w ori jak i w miejscu terminacji syntezy DNA. Poza tym w niektórych bakteriach wydaje się ważne, aby w przypadku pewnych regionów kierunek transkrypcji był taki sam jak kierunek poruszania się widełkek replikacyjnych DNA. (FIG7.33bomicroorg.)
Replikacja DNA
W replikacji DNA głównym problemem jest precyzyjna duplikacja sekwencji nukleotydowych, co zachodzi dzięki parowaniu komplementarnemu. Proces replikacji jest semikonserwatywny, co oznacza, że wyprodukowane podwójne helisy zawierają jedną nić rodzicielską i jedną nowoutworzoną.
Replikacja zachodzi od 5' do 3' końca dzięki polimerazom DNA. Enzymy te nie mogą rozpocząć syntezy nowej nici bez primera (zwykle krótka cząsteczka RNA).
Dobrze poznany jest mechanizm replikacji u E. coli. Proces ten zaczyna się w ori (origin of replication, około 300 b rozpoznawanych przez specyficzne białka). W ori podwójna helisa DNA otwiera się i zachodzi inicjacja na obu niciach jednocześnie z utworzeniem specyficznej struktury tzw. widełek replikacyjnych.
W kolistym DNA E. coli dwukierunkowa replikacja prowadzi do powstania struktur theta (na rysunku). U bakterii tej są trzy polimerazy DNA: I, II i III. Polimeraza DNA III działa w widełkach replikacyjnych dodając nowe nukleotydy. W celu zajścia replikacji podwójna helisa DNA jest rozwijana przez helikazę i stabilizowana przez SSBP (single stranded binding protein).
Pomiędzy syntezą DNA na obu niciach istnieją wyraźne różnice. Synteza na nici wiodącej 5' 3' przebiega w sposób ciągły, gdyż jest koniec 3'OH, do którego można dodać nowy nukleotyd. Na drugiej nici DNA jest syntetyzowane fragmentami, ponieważ nie ma końca 3'OH i konieczne jest zsyntetyzowanie małego primera RNA aby dostarczyć wolne grupy 3'OH.
Po syntezie primeru primaza jest zastępowana przez polimerazę DNA III, która dodaje nukleotydy do momentu dojścia do uprzednio zsyntetyzowanego DNA. Wtedy polimeraza DNA III jest odłączana a pojawia się polimeraza DNA I, która poza zdolnością do syntezy DNA, może usuwać primer RNA znajdujący się przed nią.
Po usunięciu primera polimeraza DNA I jest uwalniania i ostatnie wiązanie fosfodiestrowe zostaje wyprodukowane przy pomocy ligazy DNA.
Podczas syntezy DNA w widełkach replikacyjnych następują zmiany w zwinięciu DNA spowodowane przez enzymy rozplatające oraz topoizomerazy, które w pewnym stopniu regulują proces replikacji.
Błędy replikacyjne naprawiane są przez polimerazę DNA III, która poza zdolnością do syntezy DNA, ma aktywność 3' 5' egzonukleazy, co oznacza, że usuwa ona źle wstawiony nukleotyd i zastępuje go nukleotydem prawidłowym. System naprawczy nie zawsze zdoła wychwycić wszystkie błędy co może spowodować powstanie mutacji.
Modele replikacyjne:
obracającego się koła
theta
przemieszczającej się pętli
Wytłumaczone na rysunkach
Regulacja ekspresji genów u bakterii
Pierwszym etapem ekspresji każdego genu jest transkrypcja. Prowadzi ona do powstania RNA na matrycy DNA. Proces ten jest przeprowadzany przez polimerazę RNA, a prekursorami są ATP, GTP, UTP, CTP. W przeciwieństwie do polimerazy DNA polimeraza RNA może zacząć nową nić bez primera. Wszystkie polimerazy RNA u bakterii są skomplikowanymi enzymami składającymi się z wielu podjednostek. Enzym ten u E. coli zawiera podjednostki , ', w dwóch kopiach oraz σ , która jest luźno związana z pozostałymi i łatwo może oddysocjować. Wiązanie polimerazy RNA do DNA odbywa się w specjalnych miejscach promotorowych.
Cząsteczka σ bierze udział tylko w formowaniu początkowego kompleksu polimerazy RNA z DNA i jest odpowiedzialna za rozpoznanie promotorów: sekwencji -35 od miejsca inicjacji i sekwencji Pribnow box w regionie -10 od miejsca inicjacji. W wyniku działania polimerazy RNA w kierunku 5' 3' powstaje mRNA.
U Prokaryota pojedyncza molekuła mRNA często koduje więcej niż jedno białko ze względu na występowanie grup genów zwanych operonami. Polimeraza RNA transkrybuje wtedy wszystkie geny z danego operonu na pojedynczą molekułę mRNA (tak zwane policystroniczne mRNA). W mRNA u Prokaryota zazwyczaj nie występują introny, jednak jeśli już się tam znajdą to są samoistnie wycinane przez RNA (zwane rybozymem).
tRNA i rRNA powstają jako długie cząsteczki prekursorowe, które są następnie cięte w kilku miejscach w celu utworzenia dojrzałych cząsteczek RNA. mRNA podlega na ogół bezpośredniej translacji.
Translacja zachodzi w kilku etapach : inicjacja, elongacja, terminacja, uwolnieni i sfałdowanie polipeptydu przy wykorzystaniu całej maszynerii jaką jest m.in. rybosom. U Prokaryota rybosomy składają się z dwóch podjednostek: 30S i 50S dających w połączeniu rybosom 70S. Podjednostka 30S zawiera 16S rRNA i około 21 białek, natomiast podjednostka 50S zawiera 5S i 23S rRNA i około 34 białek.
Inicjacja syntezy białek zaczyna się od uformowania kompleksu zawierającego podjednostkę 30S, mRNA, tRNA dla formylometioniny i czynniki inicjatorowe. Do tego kompleksu przyłącza się podjednostka 50S. Związanie mRNA z rybosomem zależy od tzw. sekwencji Shine-Dalgarno (3 do 9 nukleotydów zlokalizowanych przed kodonem inicjacyjnym na mRNA). Ta sekwencja jest komplementarna do 3' końca 16S RNA rybosomu i pozwala komórkom prokaryotycznym na translację policystronicznego mRNA.
Proces inicjacji rozpoczyna się przyłączeniem aminoacylo-tRNA do kodonu start. U bakterii inicjatorowym aminoacylo-tRNA jest formylometionina. Terminacja syntezy białek zachodzi gdy osiągnięty zostanie kodon nonsensowny inaczej zwany kodonem stop. Białka uwalniają się, a rybosom dysocjuje na dwie podjednostki.
Zgromadzenie powiązanych ze sobą funkcyjnie genów bakteryjnych w jednym miejscu związane jest z regulacją przeprowadzaną przez specyficzne cząsteczki, umożliwiającą kontrolę ekspresji genów jednego szlaku metabolicznego.
Tego typu regulacja ekspresji genów bakteryjnych bierze się z konieczności efektywnego wykorzystania ograniczonych zapasów i energii oraz produkcji wyłącznie niezbędnych związków.
Prawidłowo funkcjonująca komórka bakteryjna nie powinna syntetyzować enzymów do metabolizmu laktozy, jeżeli brak jest laktozy w pożywce. Podobnie bezsensowne byłoby produkowanie enzymów do syntezy tryptofanu jeśli znajdowałby się on w wystarczającej ilości.
Dlatego też komórki bakteryjne opracowały precyzyjne mechanizmy kontroli syntezy różnych związków oparte na strukturze ich informacji genetycznej, w której geny odpowiedzialne za konkretny szlak metaboliczny znajdują się w jednym miejscu i tworzą tzw. operon.
Pierwszym poznanym mechanizmem regulacji operonowej u bakterii jest proces rozkładu laktozy u E.coli. Laktoza jest disacharydem ulegającym rozłożeniu na dwa cukry składowe: galaktozę i glukozę, pod wpływem enzymu beta-galaktozydazy. Jeśli w środowisku nie ma laktozy, w komórce E.coli znajduje się tylko kilka cząsteczek tego enzymu. Natomiast w momencie gdy w środowisku znajduje się laktoza, w komórce pojawiają się tysiące cząsteczek beta-galaktozydazy. Dodatkowo zwiększa się w komórce ilość pozostałych enzymów zaangażowanych w szlak laktozowy (galaktozydopermeazy i transacetylazy galaktozydowej). Każdy z tych enzymów jest kodowany przez oddzielny gen jednak ich ekspresja ulega wspólnej regulacji. Geny tych trzech enzymów znajdują się w jednym liniowym odcinku na chromosomie E.coli i zostały oznaczone według kolejności występowania:
Z - beta galaktozydaza
Y - beta galaktozydopermeaza (białko transportowe)
A - transacetylaza galaktozydowa.
Ekspresja wszystkich trzech genów podlegać może jednoczesnej indukcji przez cząsteczkę laktozy. Na tej podstawie stwierdzono, że przed tymi genami musi się znajdować niezależny element genetyczny, który reguluje ich ekspresję.
W końcu okazało się, że w regulacji bierze udział kilka genów:
gen regulatorowy (gen lacI), który koduje cząsteczkę represora zdolną do przejścia w inne miejsce, do operatora, gdzie indukuje ona sygnał wyłączający operon
gen operatora, który otrzymuje sygnał wyłączający z represora
trzy geny kodujące białka, które są transkrybowane na jedno mRNA
miejsce promotora (częściowo nachodzące na gen operatorowy), gdzie przyłącza się RNA polimeraza i indukuje syntezę mRNA
Operon laktozowy, lac, działa w następujący sposób. Gen regulatorowy produkuje cząsteczkę represora, która może przenieść się do miejsca występowania operatora, przyłączyć się do niego i zahamować transkrypcję genów strukturalnych w tym operonie.
Jeżeli w pobliżu nie ma cząsteczek laktozy, cząsteczka represora przyjmuje konformację zdolną do związania się z operatorem. Gdy represor zwiąże się z operatorem, promotor jest częściowo zasłonięty, wobec czego polimeraza RNA nie może się z nim związać i nie dochodzi do transkrypcji mRNA a następnie syntezy trzech białek.
Jeżeli natomiast w środowisku obecna jest laktoza, represor wiąże się z nią i przyjmuje inny kształt, który nie pozwala na połączenie się z operatorem. Promotor pozostaje odsłonięty, wiąże się z polimerazą RNA i dochodzi do ekspresji genów, które następnie prowadzą do rozkładu laktozy.
Jest to przykład regulacji genów na poziomie transkrypcyjnym.
FIG 14-10 z Hopsona p. 314 An inducible operon
Ten mechanizm jest prosty i ładnie tłumaczy dlaczego komórka E.coli produkuje tylko tyle beta-galaktozydazy ile jest jej potrzebne. Jednak w rzeczywistości sytuacja staje się nieco bardziej skomplikowana gdyż komórka bakterii może jednocześnie otrzymać laktozę i glukozę. Co wtedy?
Dla bakterii korzystniejsze jest rozłożenie glukozy niż laktozy, ponieważ glukoza może być natychmiast zużyta w metabolizmie, a laktoza musi zostać najpierw rozłożona w skomplikowanych reakcjach chemicznych.
Bakteria zdolna do zużycia glukozy pomimo obecności laktozy w pożywce będzie rosła szybciej niż inne bakterie tym samym zdobywając pewną nad nimi przewagę.
Dlatego też nie należy się dziwić, że powstał mechanizm tzw. represja kataboliczna, który umożliwia bakterii zużywanie na początku glukozy nawet gdy jest laktoza. Mechanizm represji katabolicznej opiera się na fakcie, że polimeraza RNA łączy się z promotorem w operonie lac dużo lepiej w obecności specyficznego białka CAP (catabolite gene activator protein), które musi być związane ze specyficznym miejscem DNA położonym w pobliżu tzw.CBS (CAP binding site). Białko CAP wiąże się z tym miejscem jeśli do tego białka przyłączą się cząsteczki cAMP, co zachodzi przy braku glukozy.
Jeżeli natomiast glukoza znajduje się w pożywce, spada poziom cAMP, białko CAP zmienia kształt, nie wiąże się z CBS, polimeraza RNA gorzej wiąże się z promotorem i synteza enzymów szlaku laktozowego zostaje spowolniona.
Fig14-11 p.315 Represja kataboliczna Biology Wessels Hopson
Istnieją więc trzy różne poziomy aktywności operonu lac, zależne od obecności laktozy i glukozy w pożywce oraz regulowane przez trzy różne białka: lac represor, polimerazę RNA i CAP.
Najniższy poziom ekspresji zachodzi pod nieobecność laktozy: nie ma substratu, niepotrzebne są enzymy do katalizy, represor lac jest połączony z operonem i blokuje wiązanie się polimerazy RNA.
Najwyższy poziom ekspresji obserwuje się przy obecności laktozy, lecz braku glukozy: laktoza wiąże represor uniemożliwiając mu związanie się z operatorem, co z kolei pozwala na przyłączenie polimerazy RNA, a dodatkowo wysoki poziom cAMP i łączenie się go z CAP i CAP z CBS co w rezultacie uaktywnia polimerazę RNA.
Model regulacji rozkładu laktozy w operonie lac jest jednym z wielu jakie funkcjonują w komórkach bakteryjnych. Jest to przykład pozytywnej regulacji ekspresji gdyż obecność substratu w pożywce indukuje produkcję enzymów.
Ponadto mamy do czynienia z innymi modelami regulacji ekspresji genów również wynikającymi z dążenia komórki do efektywnego wykorzystania surowców ale jednocześnie nie nadprodukowania jakiejś substancji bez wyraźnej potrzeby. Ten typ mechanizmu regulacji to represja czyli zahamowanie syntezy enzymów szlaku biosyntetycznego w odpowiedzi na nadmiar końcowego produktu. Przykładem operonu regulowanego w ten sposób jest operon tryptofanowy (trp).
Operon ten zawiera pięć genów (E,D,C,B,A) kodujących enzymy, które prowadzą do syntezy aminokwasu - tryptofanu. W przypadku operonu tryptofanowego również mamy do czynienia z cząsteczką represora kodowaną w niewielkiej odległości od operonu. Cząsteczka represora trp podobnie jak lac może istnieć w dwóch konformacjach: jedna powoduje łączenie z operatorem i zablokowanie transkrypcji, natomiast druga konformacja nie pozwala na związanie się represora z operatorem i umożliwia zajście transkrypcji.
W obecności tryptofanu cząsteczka represora wiąże się z tym aminokwasem i zmienia konformację, na taką która umożliwia związanie się z operatorem i zablokowanie syntezy enzymów.
Jeżeli tryptofan jest nieobecny, represor nie może związać się z operatorem. Dochodzi wtedy do przyłączenia polimerazy RNA i syntezy enzymów, które w następstwie doprowadzą do syntezy tryptofanu.
Oba opisane mechanizmy regulacji ekspresji genów czyli indukcja operonu lac i represja operonu trp są przykładami na kontrolę negatywną. Oznacza to, że ekspresja genów podlegających takiej kontroli zachodzi dopóki nie zostanie wyłączona przez cząsteczkę represora.
Istnieje jeszcze model pozytywnej regulacji ekspresji genów, co z kolei oznacza, że geny znajdujące się pod taką kontrolą ulegają ekspresji dopiero pod wpływem działania specyficznego białka regulatorowego. Przykładem tego typu regulacji może być opisana już wcześniej aktywacja kompleksu promotor-polimeraza RNA operonu lac przez wiąząnie się białka CAP do CBS.
Innym przykładem regulacji pozytywnej jest katabolizm maltozy u E.coli. Enzymy do rozkładu maltozy są syntetyzowane dopiero po dodaniu maltozy do pożywki. Ich synteza jest regulowana na poziomie transkrypcji przez białko aktywujące (AP-activator protein). AP nie może związać się z DNA dopóki nie połączy się z cząsteczką maltozy. Gdy AP zwiąże się z cząsteczką maltozy, kompleks taki łączy się z DNA i umożliwia polimerazie RNA rozpoczęcie transkrypcji. Aktywator podobnie jak represor rozpoznaje specyficzną sekwencję DNA tzw. miejsce wiązania aktywatora. Geny potrzebne do katabolizmu maltozy znajdują się w kilku operonach wobec czego aktywator kontroluje więcej niż jeden operon. Grupa operonów regulowanych przez jedno białko aktywujące nazywana jest regulonem.
Atenuacja
Atenuacja jest typem regulacji opartym na fakcie, że w organizmach prokariotycznych transkrypcja i translacja są procesami wzajemnie połączonymi. Atenuacja została zaobserwowana w niektórych operonach kontrolujących biosyntezę aminokwasów.
Najlepiej zbadanym przykładem jest atenuacja w operonie tryptofanowym. Poza wspomnianymi już wcześniej genami i strukturami znajdującymi się w tym operonie, operon ten zawiera tzw. sekwencję liderową w obrębie której znajduje się region atenuatora kodujący polipeptyd zawierający przy końcu kodony tryptofanu. Jeżeli w komórce znajduje się dużo tryptofanu peptyd liderowy zostanie zsyntetyzowany. Natomiast przy braku tryptofanu nie powstanie peptyd liderowy. Jakie są tego rezultaty?
Synteza peptydu liderowego prowadzi do zahamowania transkrypcji genów tryptofanowych. W jaki sposób?
Proces ten jest możliwy ze względu na fakt, że transkrypcja i translacja w komórkach bakterii zachodzi praktycznie jednocześnie. Sekwencja liderowa jako pierwsza ulega transkrypcji i gdy następnie transkrypcja idzie dalej, mRNA sekwencji liderowej ulega już translacji. Jednakże w przypadku mRNA sekwencji liderowej, gdy jest już uwolnione z DNA i połączy się z rybosomem ulega ono sfałdowaniu w podwójną pętlę, która sygnalizuje zatrzymanie transkrypcji dalszych genów (tryptofanowych).
Jeśli nie ma tryptofanu to nie dojdzie do translacji całej sekwencji liderowej gdyż zostanie ona zatrzymana na kodonie tryptofanowym, co powoduje przyjęcie innej konformacji przez mRNA sekwencji liderowej. Ta konformacja nie blokuje polimerazy RNA, która przechodzi dalej do transkrypcji genów tryptofanowych. Mechanizmy represji i atenuacji operonu tryptofannowego w precyzyjny sposób kontrolują syntezę enzymów szlaku biosyntezy tryptofanu.
Podobne modele atenuacji odkryto w innych szlakach metabolicznych bekterii np. w biosyntezie histydyny czy fenyloalaniny.
Antysensowne RNA
Większość systemów kontrolujących czy to transkrypcję czy translację wykorzystuje białka jako cząsteczki regulatorowe. Jednak niekiedy zdarza się, że w regulację zostanie zaangażowane RNA.
Jednym z rodzajów regulatorowego RNA jest RNA antysensowne używane w kontroli różnych genów bakteryjnych. Antysensowne RNA oddziałuje jako regulator poprzez parowanie z komplementarną, sensowną nicią RNA. Jeżeli tą komplementarną nicią jest mRNA, to parowanie z antysensownym RNA może zapobiec zajściu translacji.
Antysensowne RNA może być syntetyzowane z tego samego genu co mRNA przez zastosowanie drugiego promotora zorientowanego w przeciwnym kierunku do pierwszego lub poprzez drugi gen z promotorem na przeciwnym końcu.
PLAZMIDY
Plazmidy są to elementy genetyczne zdolne do autonomicznego powielania się i istnienia pozachromosomalnego. Większość plazmidów ma koliste, superzwinięte dsDNA, a niektóre liniowe dsDNA. Wiele plazmidów może być przenoszonych w procesie koniugacji z jednej do drugiej komórki. Niektóre plazmidy mają zdolność do wintegrowywania się w chromosom bakteryjny i wtedy ich replikacja podlega kontroli bakterii.
Jednym z najlepiej poznanych plazmidów jest plazmid F z E.coli. Jest tp plazmid typu koniugacyjnego i może być transferowany z komórki donora do akceptora nawet z fragmentami chromosomalnego DNA donora. Plazmid F jest kolistą cząsteczką (dł.100bp) i zawiera różne geny niezbędne do procesu replikacji i transferu , a ponadto sekwencje, które pozwalają na rekombinację z chromosomem bakteryjnym w celu utworzenia Hfr. Plazmidy zdolne do integracji w chromosom gospodarza nazywane są episomami.
Większość plazmidów w bakteriach gramujemnych przechodzi replikację dwukierunkową według modelu theta z zastosowaniem enzymów komórkowych. Natomiast plazmidy bakterii gramdodatnich w większości replikują według modelu obracającego się koła. Plazmidy, które posiadają materiał genetyczny w formie liniowej replikują w sposób podobny do adenowirusów. FIG 6.47
Pomimo, że plazmidy są niezależnie replikującymi elementami genetycznymi, ilość ich cząsteczek w komórce jest do pewnego stopnia określona przez daną komórkę a ponadto przez warunki zewnętrzne.
Plazmidy są w biologii molekularnej bardzo istotnym narzędziem służącym do badania różnorodnych procesów genetycznych czy ekologii i życia bakterii. Ponadto stosowane są w biotechnologii.
Obecność plazmidów w komórce może mieć znaczny wpływ na jej fenotyp np. u Rhizobium to plazmidy umożliwiają współdziałanie z roślinami.
Ze względu na zróżnicowanie wielkości plazmidów oraz posiadanych przez nie genów na:
produkcję toksyn
uodpornienie komórki gospodarza na antybiotyki i inne substancje
katabolizm nietypowych substrató np. pestycydów
kontrolę procesu koniugacji
i wiele innych, nie jest łatwo sklasyfikować plazmidy według jakiejś charakterystycznej cechy.
Jednak dokonuje się podziału na pewne grupy.
Plazmidy koniugacyjne
Plazmidy te mają zdolność do przenoszenia się z komórki donora do akceptora w procesie koniugacji. Za ten proces odpowiedzialne są geny w regionie tra znajdujące się w plazmidach. Geny te związane są między innymi z syntezą pili np. F i I
Pili typu F biorą udział w transferze plazmidu F oraz niektórych plazmidów z odpornością na antybiotyki. Pili typu I są zaangażowane w przenoszenie plazmidów z opornością na antybiotyki i innymi właściwościami.
Plazmidy opornościowe (R - resistance)
Plazmidy te nadają komórce oporność na antybiotyki i inne inhibitory wzrostu. Plazmidy R mogą posiadać różnorodne geny oporności na antybiotyki. Geny te kodują zazwyczaj białka które inaktywują antybiotyk albo wpływają na pobranie antybiotyku przez komórkę.
Plazmid R100 niesie oporność na sulfonamidy, streptomycynę, tetracyklinę, chloramfenikol i inne. Plazmid ten może być przenoszony pomiędzy bakteriami z Enterobakteriaceae: Escherichia, Klebsiella czy Salmonella.
Poza tym znane są plazmidy z opornością na kanamycynę, penicylinę czy neomycynę. Ponadto plazmidy typu R posiadają geny, które hamują wprowadzanie plazmidu tego samego typu do komórki, plazmid dodatkowy zostaje zgubiony w procesie replikacji, co nie przeszkadza współistnieć w jednej komórce plazmidom z dwóch różnych grup.
Możliwa jest rekombinacja genetyczna pomiędzy dwoma R co może prowadzić do powstania organizmów opornych na wiele leków. Plazmidy R są odpowiedzialne za uzyskiwanie przez bakterie chorobotwórcze oporności na leki (antybiotyki).
Komórki bakteryjne mogą wymieniać między sobą materiał genetyczny w trzech procesach, które zachodzą naturalnie: koniugacja, transdukcja i transformacja. mechanizmy przekazywania materiału genetycznego nie są związane z procesem reprodukcji komórki bakteryjnej, zachodzą one w konkretnych warunkach i polegają na przekazaniu niewielkiej części materiału genetycznego z komórki dawcy do biorcy.
REKOMBINACJA DNA U BAKTERII
Proces rekombinacji jest to przeprowadzanie wymiany pomiędzy homologicznymi odcinkami DNA. Jest to podstawowy mechanizm wymiany genów pomiędzy chromosomami w żywych organizmach. Powoduje on zwiększenie różnorodności genetycznej, a ponadto w sytuacjach ekstremalnych przy dużym zniszczeniu DNA umożliwia przeżycie organizmu.
W trakcie rekombinacji u bakterii uczestniczy specyficzne białko RecA. Białko to ma zdolność do niespecyficznego (czyli niezależnego od sekwencji) wiązania się z jednoniciowym DNA. Następnie kompleks białko- DNA atakuje losowo drugą cząsteczkę DNA, powodując rozplecenia nici. Jeżeli natrafi na sekwencję komplementarną to zapoczątkowuje powstanie DNA rekombinowanego z nici atakującej i atakowanej. Powstaje przejściowa struktura krzyżowa (rysunek). Po czym struktura ta zostaje pocięta przez endonukleazy i powstają dwie zrekombinowane cząsteczki DNA.
W organizmach bakteryjnych rekombinacja zachodzi na trzy sposoby:
koniugacja
transformacja
transdukcja
Koniugacja
Koniugacja u bakterii jest to proces transferu genetycznego zachodzący podczas kontaktu dwóch komórek. Przenoszonym materiałem genetycznym może być plazmid lub fragment chromosomu, który jest transferowany dzięki plazmidowi. W koniugacji jedna z komórek tzw. donor przekazuje informację genetyczną komórce biorcy. Komórka dawcy posiada specyficzną strukturę powierzchniową tzw. pilus płciowy, który pozwala na kontakt pomiędzy komórkami. Natomiast komórka biorcy posiada na swej powierzchni specyficzne receptory dla pilusa płciowego. Znane są dwa typy dawców:
F+ plazmid w tej komórce funkcjonuje jak typowy plazmid i tylko on jest przenoszony w procesie koniugacji
Hfr plazmid jest wintegrowany w chromosom dawcy i umożliwia on przekazanie DNA chromosomalnego podczas koniugacji.
Gdy komórki koniugujące już się ze sobą zetkną, zostaje zainicjowana synteza DNA i zachodzi przejście pojedynczej nici DNA z jednej do drugiej komórki. Synteza DNA w obu komórkach prowadzi do zachowania dwuniciowej natury DNA i zapewnia zachowanie pełnej informacji genetycznej w komórce dawcy. Przekazanie materiału genetycznego zachodzi sekwencyjnie zaczynając od określonego miejsca w chromosomie dawcy.
Transfer DNA z F+ do F-
Podczas koniugacji musi zajść synteza DNA. Odbywa się to według modelu obracającego się koła. Koliste DNA plazmidowe zostaje nacięte i jedna nić rodzicielska jest przekazywana do komórki biorcy.
Gdy komórki koniugujące już się ze sobą zetkną, zostaje zainicjowana synteza DNA i zachodzi przejście pojedynczej nici DNA z jednej do drugiej komórki. Synteza DNA w obu komórkach prowadzi do zachowania dwuniciowej natury DNA i zapewnia zachowanie pełnej informacji genetycznej w komórce dawcy. Przekazanie materiału genetycznego zachodzi sekwencyjnie, w konkretnym miejscu na chromosomie dawcy.
Koniugacja pomiędzy komórkami typu F+ i F-, zachodzi podobnie do modelu replikacji obracającego się koła. Gdy dojdzie do kontaktu pomiędzy dwiema komórkami, zostaje nacięte DNA plazmidowe i jedna nić jest przekazywana do komórki biorcy. Synteza DNA według modelu obracającego się koła odbudowuje drugą nić DNA u dawcy. Podobnie komplementarna nić jest tworzona u biorcy.
Obecność plazmidu F w komórce powoduje różne zmiany:
komórka ma zdolność do syntezy pilii płciowych
istnieje możliwość przeniesienia fragmentów DNA do innej komórki
zmiana receptorów komórkowych uniemożliwiająca pobieranie kolejnych plazmidów
Plazmid może być wintegrowany w chromosom w konkretnych miejscach, które charakteryzują się homologią DNA komórkowego do plazmidowego. Po wintegrowaniu plazmidu mamy do czynienia z komórką typu Hfr (high frequency of recombination), która nie może w koniugacji przekształcić komórki F- w F+ lub Hfr, ponieważ bardzo rzadko zachodzi w takich sytuacjach transfer całego plazmidu.
Szczegółowe wyjaśnienie procesu na rysunkach
W procesie koniugacji przerywanej przeprowadzanym doświadczalnie możliwe jest zmapowanie ułożenia genów na chromosomie.
Transdukcja
W procesie transdukcji DNA między bakteriami jest przekazywane przy udziale bakteriofagów. Wyróżniamy dwa typy transdukcji: ogólną i ograniczoną.
Transdukcja ogólna polega na przeniesieniu przez faga dowolnych genów zlokalizowanych w przypadkowym miejscu w genomie bakterii do komórki biorcy, z niską efektywnością.
Transdukcja ograniczona występuje tylko w przypadku fagów łagodnych i polega na tym, że fag wintegrowuje się w specyficzne miejsce w genomie bakterii, następnie jako profag jest replikowany wraz z genomem komórki gospodarza. Potem zachodzi proces uwolnienia profaga, który może być na tyle nieprecyzyjny, że spowoduje wycięcie profaga wraz z pobliskim fragmentem chromosomu. Kolejnym etapem jest liza komórki i uwolnienie cząsteczek fagowych z konkretnymi fragmentami chromosomów. FIG 7 16 7 17
Transformacja
Transformacja jest to proces pobierania przez komórki bakteryjne wolnego DNA z podłoża lub uwolnionego przez inne bakterie. Niektóre komórki mają naturalną zdolność do przeprowadzania tego procesu dzięki specyficznym systemom w błonie, ułatwiającym pobranie DNA. Są to tzw. bakterie kompetentne. W inżynierii genetycznej stosuje się różne metody umożliwiające również innym bakteriom przeprowadzenie transformacji. Podczas pojedynczej transformacji może dojść do pobrania niewielkiej ilości DNA, która jednak wydatnie rośnie przy zastosowaniu bakterii kompetentnych.
WIRUSY
Wirus jest to element genetyczny nie posiadający organizacji komórkowej. Może on istnieć pozakomórkowo, jednak wtedy nie zachodzą w nim żadne przemiany metaboliczne. Pozakomórkowa forma wirusa, wirion, jest cząsteczką zawierającą kwas nukleinowy, otoczoną przez białka i niekiedy posiadającą pewne inne komponenty makrocząsteczkowe.
Replikacja wirusa odbywa się dopiero po wprowadzeniu jego materiału genetycznego do komórki. Gdy wirus znajdzie się w komórce rozpoczyna się jego reprodukcja. Proces ten związany jest z infekowaniem komórki gospodarza.
W związku z małą wielkością wirus zawiera jedynie bardzo podstawowe informacje dotyczące jego genomu, regulacji reprodukcji oraz budowy otoczki białkowej. Wobec tego podczas procesu reprodukcji jest on w dużym stopniu zależny od metabolicznych i strukturalnych cech gospodarza, dostosowując je w pewnym stopniu do swoich potrzeb.
Wirus zdolny jest do wprowadzania dziedzicznych zmian w genomie gospodarza. Zmiany te mogą mieć charakter korzystny lub destruktywny dla gospordarza.
Wirusy można sklasyfikować w oparciu o organizację posiadanego przez nie materiału genetycznego. Materiał genetyczny wirusów może występować w kilku formach: DNA jedno- lub dwuniciowe, RNA jedno- lub dwuniciowe oraz zarówno DNA jak i RNA lecz na różnym etapie istnienia wirionu.
Poza tym dokonuje się podziału na grupy w zależności od rodzaju infekowanego gospodarza: wirusy roślinne, zwierzęce i bakteryjne.
WIRIONY
Wiriony cechuje zarówno różnorodność kształtu jak i wielkości. Są one znacznie mniejsze niż komórki (około 28 - 200 nm) a ponadto mają dużo mniejsze genomy ( największe około 200kbp).
Kwas nukleinowy znajduje się wewnątrz cząsteczki wirionu i otoczony jest przez białkowy "płaszcz" zwany kapsydem, precyzyjnie uformowany z kilku podjednostek białkowych tzw. kapsomerów. Informacja dotycząca formy kapsydu zawarta jest w strukturze kapsomerów, a tworzenie otoczki zachodzi na zasadzie samoskładania, często z udziałem chaperonów.
Kompleks otoczki z kwasem nukleinowym zwany nukleokapsydem, często jest dodatkowo otoczony dwuwarstwową błoną lipidową zawierającą glikoproteiny pochodzenia wirusowego oraz lipidy pochodzące z błony komórki gospodarza. Błona wirusa jest pierwszym elementem wchodzącym w interakcje z komórką gospodarza i jej pochodzenie wpływa na sposób infekcji oraz penetracji wirusa wewnątrz komórki.
Wewnątrz wirionu mogą znajdować się specyficzne enzymy odgrywające pewną rolę w procesie infekowania komórki gospodarza. Wiele wirusów zawiera własne polimerazy, natomiast retrowirusy posiadają odwrotne transkryptazy. Ponadto w wirusach występują neuroaminidazy, które rozrywając wiązania glikozydowe glikoprotein i glikolipidów ułatwiają wirusom penetrację tkanek zwierzęcych oraz lizozym, który umożliwia wniknięcie wirusów bakteryjnych do komórki oraz powoduje jej lizę.
Wirusy posiadają pewną symetrię budowy. Symetria wirusów odnosi się do nukleokapsydu a nie do całego wirusa z błoną.
Wyróżniamy dwa podstawowe typy symetrii:
helikoidalna, gdy podjednostki białkowe są ułożone w heliks, którego długość zależy od długości kwasu nukleinowego a szerokość od wielkości i upakowania podjednostek. Przykładem jest tu wirus RNA mozaiki tytoniowej TMV
izometryczna (bryłowa) gdy mamy do czynienia z ikosaedrami czyli dwudziestościanami
ZASADY REPRODUKCJI WIRUSA
Podstawowym problemem jaki wirus napotyka na swej drodze w namnażaniu jest wzbudzenie komórki gospodarza do produkcji elementów niezbędnych do wytworzenia następnych cząsteczek wirusa.
Pierwszym etapem w tym procesie jest przyłączenie się lub też adsorpcja wirionu na podatnej komórce gospodarza. Następnie zachodzi penetracja, która polega na iniekcji wirionu lub jego kwasu nukleinowego do wnętrza komórki.
Początkowa faza replikacji polega na przystosowaniu maszynerii biosyntetycznej komórki gospodarza do syntezy kwasu nukleinowego wirusa. Produkowane są enzymy wirusowe.
Kolejnym etapem jest replikacja kwasu nukleinowego wirusa, a następnie synteza podjednostek białkowych otoczki i ich składanie oraz upakowanie kwasu nukleinowego w nowe cząsteczki wirusa i uwolnienie ich z komórki.
W genomie wirusa kodowane są niektóre enzymy niezbędne do jego replikacji jednak reszta czyli: systemy zapewniające energię, rybosomy, tRNA (z pewnymi wyjątkami) oraz enzymy aktywujące aminokwasy są dostarczane przez komórkę gospodarza.
FIG 6-9 p 194.
(Powyżej opisany proces dotyczy wirusów bakteryjnych).
PRZYŁĄCZENIE
Pierwszy etap replikacji wirusa charakteryzuje się dużą specyficznością interakcji pomiędzy wirusem a gospodarzem. Cząsteczka wirusa posiada na swojej powierzchni białka, które oddziałują ze specyficznymi elementami powierzchniowymi na komórce zwanymi receptorami. Zwykle pełnią one w komórce normalne funkcje np. białka transportowe czy białka otoczki bakteryjnej lub w przypadku grypy jest to glikoproteina na erytrocytach.
Jeśli receptor nie występuje lub jest zmieniony, wirus nie może adsorbować i infekcja nie zajdzie - gospodarz staje się odporny na wirusa, oczywiście dopóki w wirusie nie zajdzie mutacja umożliwiająca mu adsorpcję do zmutowanego receptora.
Przyłączanie się wirusa może zachodzić również na niespecyficznej drodze poprzez fagocytozę lub inne procesy endocytozy (powszechne wśród wirusów zwierzęcych i roślinnych).
PENETRACJA
Proces penetracji wirusa do wewnątrz komórki gospodarza zależny jest od charakteru tej komórki, szczególnie od jej struktur powierzchniowych w wyniku czego penetracja zachodzi inaczej w komórkach zwierzęcych pozbawionych ściany komórkowej niż w roślinnych i bakteryjnych.
Przykładem skomplikowanego mechanizmu penetracji jest infekcja komórki E.coli bakteriofagiem T4 (FIG 6.11) Wirion T4 posiada strukturę głowową, osadzoną na ogonku, który kończy się zestawem włókien ogonowych. Włókna te jako pierwsze przyłączają się do powierzchni komórki a następnie obkurczają co powoduje zbliżenie się rdzenia ogonka do powierzchni komórki. Enzym wirusowy o charakterze lizozymu powoduje powstanie niewielkiego otworu w ścianie komórkowej, przez który wnika DNA wirusowe.
Na tym etapie istnieje jeszcze możliwość usunięcia kwasu nukleinowego wirusa poprzez działanie enzymów restrykcyjnych znajdujących się na terenie komórki. Jednakże wirusy "nauczyły się" przeciwdziałać temu procesowi; modyfikując kwasy nukleinowe w podobny sposób jak komórki gospodarza lub hamując działanie systemów restrykcyjnych przez specyficzne białka.
W celu powstania nowych białek wirusowych muszą zostać utworzone specyficzne mRNA. Synteza mRNA wirusowego zależy od typu wirusa i jego materiału genetycznego. FIG6.12 p196.
W przypadku gdy informację genetyczną wirusa stanowi RNA możliwe jest kilka rozwiązań dla produkcji mRNA. Gdy mamy do czynienia z wirusem zawierającym jednoniciowe RNA pozytywne (+), oznacza to, że służy ono bezpośrednio jako mRNA. W tym RNA kodowana jest między innymi polimeraza RNA specyficzna dla wirusa. Polimeraza ta początkowo powoduje powstanie negatywnej nici komplementarnej, która następnie służy jako matryca do wytworzania większej ilości nici pozytywnych.
Jeśli natomiast wyjściowym materiałem genetycznym jest jednoniciowe RNA negatywne (-) lub dwuniciowe RNA sytuacja się nieco komplikuje, gdyż nie może ono pełnić bezpośrednio funkcji mRNA. Aby powstało mRNA konieczna jest RNA-zależna polimeraza RNA, która występuje w wirusach i prowadzi do syntezy mRNA.
Retrowirusy (wirusy RNA) replikują się dzięki pośrednictwu DNA. Proces kopiowania informacji genetycznej z RNA na DNA jest to odwrotna transkrypcja i zachodzi on pod wpływem enzymu tzw. odwrotnej transkryptazy. Po zainfekowaniu komórki, RNA wirionu kopiowane jest na dwuniciowe DNA (dsDNA) z przejściem przez etap ssDNA. Następnie dsDNA służy jako matryca do syntezy mRNA.
BIAŁKA WIRUSOWE
Gdy mamy już mRNA możliwa jest synteza białek wirusowych. Białka te należą do trzech głównych grup:
wczesne białka o charakterze enzymatycznym, niezbędne do replikacji kwasu nukleinowego wirusa, syntetyzowane w niewielkich ilościach
późne białka czyli m.in. białka płaszcza wirusowego, białka strukturalne, syntetyzowane w dużych ilościach
białka lityczne, które umożliwiają otworzenie komórki gospodarza i uwolnienie cząsteczek wirusa.
WIRUSY BAKTERYJNE
Istnieje ogromna liczba wirusów bakteryjnych, wiele z nich ma skomplikowaną strukturę, tylko niektóre posiadają lipidową otoczkę. Większość badanych wirusów atakuje E.coli lub Salmonella typhimurium.
Bakteriofagi RNA
Najlepiej poznane bakteriofagi RN-owe zawierają jednoniciowe RNA. U Enterobacteriaceae bakteriofagi infekują tylko komórki odgrywające rolę donorów w procesie rekombinacji genetycznej co związane jest z występowaniem na tych komórkach specyficznech pili, będących jednocześnie receptorami dla cząsteczek tych wirusów.
Bakteriofagi te, są niewielkie (ok. 26 nm) i mają symetrię ikosaedralną. Niektóre genomy tych bakteriofagów zostały już poznane np. MS2 ma genom o długości 3569 nukleotydów, nić RNA (+), która działa bezpośrednio jako mRNA. W komórce gospodarza mRNA wchodzi do rybosomu i produkowane są cztery typy białek; dojrzałości, odpowiedzialne za lizę, strukturalne do budowy płaszcza oraz replikaza RNA (kombinacja polipeptydów wirusa i gospodarza). Ciekawostką jest, że gen białka odpowiedzialnego za lizę komórki gospodarza nachodzi zarówno na gen białka płaszczowego jak i na gen replikazy, co w rezultacie powoduje, że rozpoczęcie translacji tego genu jest niemożliwe dopóki nie powstanie odpowiednia ilość białka płaszczowego.
Ikosaedralne bakteriofagi ssDNA
Bakteriofagi ssDNA mają genom w formie zamkniętego koła o średnicy ok. 25 nm, płaszcz zbudowany z pojedynczego białka w 60 kopiach, do którego dołączone są inne białka tworzące strukturę szpikulcopodobną.
Bakteriofagi te, w przeciwieństwie do poprzednich, podczas replikacji korzystają głównie z maszynerii komórkowej i posiadają we własnym genomie jedynie podstawowe informacje dotyczące białek kapsydowych, szpikulcowych czy powodujących lizę komórki bakteryjnej.
Najpowszechniej badany wirus z tej grupy to X174, atakujący E.coli, w którym po raz pierwszy odkryto geny nachodzące na siebie (ang. overlapping genes). Geny te stanowią rozwiązanie problemu małej ilości DNA kodującego, pozwalając na bardziej efektywne wykorzystanie informacji genetycznej, ale jednocześnie stwarzają niebezpieczeństwo, że jedna mutacja może wpłynąć na dwa geny.
FIG 6.17
Replikacja tego wirusa zachodzi według modelu obracającego się koła (rolling circle replication). Najpierw jednak dochodzi do powstania RF, czyli replikacyjnej formy DNA. Jest to superzwinięte dsDNA, które powstaje wskutek działania komórkowych enzymów na ssDNA wirusa.
Następne RF tworzone są w konwencjonalny sposób poprzez semikonserwatywną replikację z pośrednimi formami theta, ale utworzenie genomu ssDNA zachodzi według wspomnianego wyżej modelu. FIG 6-18.
Jedna nić zostaje przerwana i koniec 3' używany jest do rozpoczęcia syntezy nowej nici. Synteza ta jest asymetryczna ponieważ tylko jedna z nici jest matrycą. Gdy zostanie osiągnięta odpowiednia długość odpowiedni enzym przecina i łączy dwa końce nowej nici.
Bakteriofagi dsDNA
Wiele wirusów zawiera materiał genetyczny w postaci podwójnej nici DNA (dsDNA). Były to pierwsze odkryte wirusy bakteryjne i są one bardzo intensywnie badane.
Bakteriofag T7 jest wirusem atakującym E.coli, posiada ikosaedralną główkę i mały ogonek. Jego genom został zsekwencjonowany i zbadany. Okazało się, że część genów nachodzi na siebie i ich kolejność wpływa na regulację powielania wirusa.
DNA wirusowe wchodzi liniowo do komórki gospodarza, zaczynając od lewego końca i następuje natychmiastowa transkrypcja kilku genów na tym końcu dzięki komórkowej RNA polimerazie.
Powstają nachodzące na siebie policystroniczne mRNA, które zostają przecięte przez komórkową Rnazę, dając mniejsze mRNA kodujące: białka hamujące system restrykcyjny gospodarza oraz wirusową RNA polimerazę, a także białka hamujące RNA polimerazę komórki gospodarza.
Gdy zostaje zahamowana polimeraza komórki bakteryjnej (kontrola negatywna), zakończona jest transkrypcja wczesnych genów T7. Natomiast fagowa polimeraza rozpoznaje tylko pozostałe promotory na genomie T7 prowadząc do syntezy reszty białek faga.
Replikacja DNA zaczyna się w ori skąd odbywa się w obu kierunkach jednocześnie, przy zastosowaniu dwóch typów primerów RNA ; w lewo primer syntetyzowany przez primazę T7, w prawo syntetyzowany przez T7 RNA polimerazę. Oba primery podlegają wydłużaniu przez fagową polimerazę DNA. FIG6.21
Wirus T7 posiada pewną cechę strukturalną tzw. dtr (direct terminal repeat o długości ok.160bp, na 5' końcach cząsteczki) przydatną podczas replikacji. W celu zakończenia replikacji na 5' końcu DNA primery RNA muszą zostać usunięte. Na obu końcach DNA faga T7 zostają pewne fragmenty, które nie uległy replikacji. T7 "rozwiązuje" ten problem przy użyciu wspominanych już sekwencji dtr. Na obu niciach 3' DNA znajdują się sekwencje komplementarne do dtr i łączą się z nimi tworząc cząsteczkę o podwojonej długości w porównaniu do normalnego T7. Niezreplikowane do tej pory fragmenty DNA zostają uzupełnione dzięki działaniu polimerazy i ligazy DNA co prowadzi do utworzenia tzw. konkatameru. Konkatamer zostaje pocięty na cząsteczki o długości odpowiadającej wirusowi T7 przez specjalny enzym.
Duże bakteriofagi dsDNA
Największe i najbardziej skomplikowane fagi zarówno pod względem struktury jak i replikacji należą do tzw. grupy fagów T-parzystych.
Przykładowym fagiem z tej grupy jest T4, mający ikosaedralną główkę wydłużoną przez dodatkowe białka oraz zróżnicowany strukturalnie ogonek. W genomie T4 znajduje się nietypowy nukleotyd 5-hydroksymetylocytozyna (dodatkowo glukozylowany) zamiast cytozyny, który powoduje że dane DNA jest odporne na restrykcyjne endonukleazy bakteryjne. DNA T4 występuje w formie liniowej jednak jego mapa genetyczna przedstawiana jest w formie kołowej.
Proces replikacji DNA T4 jest podobny do T7 jednakże enzym tnący DNA na jednakowe fragmenty liniowe nie jest specyficzny do sekwencji co powoduje powstawanie zróżnicowanych końcow cząsteczki i nieco dłuższych genomów wirusowych.
Geny fagaT4 kodują dwie podstawowe grupy białek; wczesne, czyli enzymy zaangażowane w proces replikacji i transkrypcji, oraz późne czyli białka strukturalne główki i ogonka, a także enzymy uwalniające faga z komórki. Fag T4 korzysta w trakcie syntezy z polimerazy RNA występującej w komórce bakteryjnej. Formowanie główki i ogonka zachodzi niezależnie, DNA zostaje upakowane w główce nastepnie przyłącza się ogonek i fag gotowy jest do opuszczenia komórki. Liza ściany komórkowej bakterii zachodzi pod wpływem lizozymu, który atakuje peptydoglikany komórkowe. Cały proces może trwać około 25 minut.fig6.24
Wirusy łagodne
Większość wirusów bakteryjnych przechodzi cykl lityczny prowadzący do zabicia komórki bakteryjnej. Jednakże jest wiele wirusów, które pomimo możliwości zabicia komórki wybierają drogę lizogeniczną czyli łagodną kiedy to większość genów faga nie ulega ekspresjii a genom fagowy wbudowany do bakteryjnego ulega synchronicznej replikacji i wraz z podziałami komórkowymi jest przekazywany następnym pokoleniom bakterii. FIG 6.25 koniecznie Bakteria zainfekowana wirusem w łagodnej postaci jest odporna na następne ataki nowych cząsteczek tego wirusa.
Wirusy łagodne istnieją w komórkach zazwyczaj w formie zwanej prowirusem. Prowirus posiada taką samą informację genetyczną jak wirus. Jednak jest ona zablokowana przez specjalny fagowy represor i nie ulega ekspresji. Ta sytuacja może ulec zmianie pod wpływem specyficznych czynników (np.UV, promieniowanieX) powodujących inaktywację represora - indukcja lizogeniczna.
Wirus łagodny może istnieć w dwóch formach zależnych od warunków. Czasem jako niezależna jednostka, kontrolująca swoją replikację (cykl lityczny), lub jako DNA wintegrowane w materiał genetyczny komórki gospodarza (cykl łagodny - lizogeniczny).
Najlepiej poznanym wirusem łagodnym jest lambda atakująca E.coli, zawiera on dsDNA w formie liniowej z 12-nukleotydowymi jednoniciowymi, komplementarnymi ogonami na 5' końcach, które łączą sie formując dwuniciową kolistą cząsteczkę.
Genom faga lambda zawiera dwa zestawy genów; jeden - kontrolujący cykl lityczny, drugi - lizogeniczny. Podczas infekcji dochodzi do zapoczątkowania ekspresji genów obu cykli. Fag lambda zawiera kilka operonów.
Po wprowadzeniu wirusa do komórki zapoczątkowana zostaje transkrypcja jego genów. Produktem genu cI jest białko cI będące represorem transkrypcji genów zaangażowanych w cykl lityczny. Jeśli represor zgromadzi się w komórce zanim ulegną ekspresji geny lityczne to zahamuje on cykl lityczny.
Powodem dla którego liza nie zawsze zostaje zahamowana jest istnienie białka Cro będącego produktem genu cro. Kluczem do zrozumienia tego procesu jest położenie genów kodujących te dwa białka. Te dwa geny leżą blisko siebie, są transkrybowane w przeciwnych kierunkach a pomiędzy nimi znajdują się promotory i operatory do których mogą się wiązać produkty obu genów. Gdy represor lambda jest związany ze swoim operatorem, zasłania on promotor cro. Natomiast gdy białko Cro jest związane ze swoim operatorem zasłania ono jeden z promotorów dla cI.
W cyklu lizogenicznym następuje ciągła ekspresja genu cI. Produkt czyli represor wiąże się z dwoma operatorami na DNA i wyłącza transkrypcję reszty genów faga lambda (kontrola negatywna), jednocześnie indukuje syntezę samego siebie (kontrola pozytywna). W ten sposób represor zapewnia zahamowanie ekspresji innych genów koniecznych do wzrostu i reprodukcji faga.
W komórce lizogenicznej powielenie faga może zajść tylko w przypadku inaktywacji represora, co jest możliwe przy zastosowaniu czynników niszczących DNA. Jednym z rezultatów działania takich czynników jest zmiana białka RecA ( w normalnych warunkach biorącego udział w rekombinacji genetycznej) w specyficzną proteazę, która bierze udział w zniszczeniu represora. W momencie gdy represor jest zdezaktywowany, może już zachodzić transkrypcja pozostałych genów faga lambda do tej pory zablokowanych, co w rezultacie prowadzi do lizy komórki.
FIG 6.25, 27
DNA faga lambda integruje w chromosom gospodarza w postaci kolistej w specyficznym miejscu na chromosomie tzw.att (bacterial attachment sites) dzięki enzymowi integrazie (kodowanym przez fagowy gen int).
Podczas wzrostu komórki system represji faga lambda uniemożliwia zajście lizy komórki, natomiast w trakcie replikacji DNA gospodarza zachodzi równoczesna replikacja DNA faga i w komórce potomnej dochodzi do uruchomienia cyklu produktywnego.
Fag lambda używany jest jako wektor w inżynierii genetycznej, do konstruowania hybryd DNA z enzymami restrykcyjnymi. Fag lambda zawiera długi region DNA, który dzięki temu, że nie pełnie żadnych istotnych funkcji w replikacji może być zastępowany obcym DNA.
Bakteriofag Mu
Bakteriofag Mu jest jednym z bardziej interesujących fagów ze względu na jego możliwość replikacji jako ruchomego elementu genetycznego. Mu jest wyjątkowo mutagenny, ponieważ może integrować w środku genu komórki gospodarza inaktywując go, ponadto ma zdolność do przemieszczania się w genomie.
WIRUSY ZWIERZĘCE
Wirusy zwierzęce posiadają materiał geneyczny zarówno w formie RNA jak i DNA. Jedną z ważniejszych grup wirusów zwierzęcych są retrowirusy, gdyż powodują one choroby bardzo groźne dla człowieka (AIDS). Wirusy dzieli się na różne grupy w zależności od typu kwasu nukleinowego, obecności otoczki i niekiedy według stosowanego modelu replikacyjnego.
FIG6.35
Wirusowa infekcja komórki zwierzęcej może mieć rożne efekty. Wirus może spowodować rozpadnięcie się komórki, trwałą infekcję z powolnym uwalnianiem cząsteczek wirusa lub infekcję utajoną kiedy to symptomy pojawiają się ze znacznym opóźnieniem w stosunku do czasu infekcji. Ponadto wirusy mogą powodować powstawanie nowotworów.
FIG6.36
Wirusy zwierzęce RNA (+)
Do tej grupy wirusów należą: wirus polio, hepatitis A, wirusy przeziębieniowe. W małych wirusach RNA takich jak polio, RNA działa bezpośrednio jako pojedyncze mRNA korzystając z translacyjnej maszynerii komórkowej produkuje pojedynczą długą poliproteinę, która następnie zostaje pocięta na liczne małe białka niezbędne w procesie powielania kwasu nukleinowego (polimeraza RNA) oraz powstania nowej cząsteczki wirusa (np. białka strukturalne). Synteza białek komórkowych zostaje zahamowana.
Wirusy zwierzęce RNA (-)
W tych wirusach RNA nie odgrywa bezpośrednio roli mRNA. Najpierw jest ono kopiowane przez RNA-zależną polimerazę RNA pochodzenia wirusowego dzięki czemu powstaje mRNA następnie wykorzystywane do syntezy białek wirusowych, które prowadzą do replikacji genomu wirusowego i powstania nowych cząsteczek wirusa. FIG6.39
Przykładem wirusa tego typu jest ludzki wirus grypy, ponadto rhabdowirusy.
Wirusy zwierzęce dsDNA
Wśród wirusów DN-owych można wyróżnić cztery główne rodziny; papovawirusy, wirusy herpes, pox i adenowirusy. Spośród nich wszystkie poza wirusami pox przechodzą replikację w jądrze komórkowym, natomiast pox nietypowo powiela się w cytoplazmie.
Niektóre wirusy z grupy papovawirusów mają zdolność do indukowania transformacji nowotworowej komórek gospodarza. Gdy wirus tego typu infekuje komórkę, mogą zajść dwa typy replikacji w zależności od komórki. W komórkach pierwszego typu infekcja wirusa polega na tworzeniu nowych wirionów i lizie komórki gospodarza. W drugim typie komórek nie dochodzi do wielokrotnego powielenia wirionu, lecz DNA wirusowe integruje w genomie niektórych komórek prowadząc do genetycznej modyfikacji, która w konsekwencji może spowodować transformację komórki i brak zahamowania jej wzrostu. Przykładem takiego wirusa jest SV40 posiadający zdolność do indukowania nowotworów w komórkach zwierzęcych FIG.6.44
Wirusy herpes są dużą grupą dsDNA wirusów powodujących wiele chorób u zwierząt i człowieka (np. ospę wietrzną), mają zdolność do pozostawania w formie utajonej w komórkach gospodarza, niektóre mogą prowadzić do transformacji nowotworowej (np.wirus Epsteina-Barra).
Najbardziej skomplikowane i największe wirusy zwierzęce należą do grupy wirusów pox. Unikatową wlaściwością tych wirusów jest zdolność do przeprowadzania replikacji DNA na terenie cytoplazmy komórki gospodarza. Do tej grupy należy wirus ospy, który jako pierwszy został szczegółowo zbadany, oraz wirus krowianki (cowpox), który powoduje bardzo łagodną i niegroźną infekcję w komórkach ludzkich. Wirus krowianki służy jako szczepionka przeciw ospie oraz jest używany w eksperymentach genetycznych do wprowadzania obcych genów do komórek zwierzęcych i ludzkich.
Adenowirusy zostały po raz pierwszy wyizolowane z migdałków, powodują one łagodne infekcje dróg oddechowych i występują często w zdrowych osobnikach.
Retrowirusy
Jedną z najbardziej skomplikowanych i niewątpliwie najciekawszych grup wirusów zwierzęcych są retrowirusy. Przyczyn, dla których znajdują się one w centrum zainteresowania jest wiele.
Po pierwsze, to one zostały początkowo zidentyfikowane jako czynniki indukujące powstawanie nowotworów. Po drugie, jeden z retrowirusów jest przyczyną jednej z najgroźniejszych i najbardziej kontrowersyjnych współcześnie chorób czyli AIDS.
Ponadto mogą one specyficznie wintegrowywać w genom komórki gospodarza przez pośrednicze DNA. Proces ten jest badany pod kątem wprowadzania obcych genów do komórek w terapii genowej.
Poza tym retrowirusy posiadają enzym - odwrotną transkryptazę, która stosując RNA jako matrycę kopiuje informacje genetyczną z RNA na DNA. Enzym ten jest powszechnie stosowany w inżynierii genetycznej. Należy tutaj zaznaczyć, że odwrotna transkryptaza nie jest "narzędziem" zarezerwowanym wyłącznie dla retrowirusów - posiadają ją także retrotranspozony u Eukaryota czy E.coli.
Retrowirusy posiadają otoczkę o nieokreślonej symetrii. Genom retrowirusów ma bardzo nietypową budowę. Składa się on z dwóch jednakowych pojedynczych nici RNA (+) , połączonych wiązaniami wodorowymi poprzez parowanie nukleotydów ze specyficznymi cząsteczkami tRNA. 5' koniec RNA posiada cap natomiast 3' koniec posiada ogon poly(A) wobec czego RNA mogłoby służyć bezpośrednio jako mRNA, jednak tak się nie dzieje.
Ogólnie proces replikacji retrowirusów zachodzi w kilku etapach. Na początku wirus dostaje się do komórki, następnie jedna z nici RNA jest odwrotnie transkrybowana w ssDNA które zostaje przekształcone w liniowe dsDNA przez odwrotną transkryptazę. Kolejnym etapem jest wintegrowanie powstałego dsDNA retrowirusa w genom komórki gospodarza. Potem zachodzi transkrypcja DNA wirusowego, powstajemRNA i "potomne" wirusowe RNA, które zostaje upakowane w kapsydzie na terenie cytoplazmy. W końcu nowe cząsteczki wirusa są odpączkowywane z błony cytoplazmatycznej i uwalniane z komórki. FIG 6.48.49.50.
Pierwszym etapem po wejściu wirusa do komórki jest transkrypcja RNA na DNA przy zastosowaniu odwrotnej transkryptazy. Enzym ten wykazuje kilka rodzajów aktywności; synteza DNA z wykorzystaniem RNA jako matrycy (odwrotna transkryptaza), synteza DNA z wykorzystaniem DNA jako matrycy (polimeraza DNA) oraz degradowanie nici RNA w hybrydzie RNA-DNA (rybonukleaza H). Jak wszystkie polimerazy DNA enzym ten wymaga primeru do syntezy DNA.
W reakcji przeprowadzanej przez odwrotną transkryptazę primerem jest specyficzne tRNA komórkowe. Rodzaj użytego tRNA jest związany z typem wirusa i pochodzi z ostatniej komórki gospodarza. Przy użyciu danego tRNA jako primeru około 100 nukleotydów RNA z
5'końca jest odwrotnie transkrybowanych na DNA. Gdy transkrypcja dojdzie do 5' końca, zostaje ona zatrzymana.
W celu skopiowania pozostałej większości RNA stosowany jest inny mechanizm. Najpierw usuwane jest RNA już skopiowane przez RT (reverse transcriptase - odwrotna transkryptaza) dzięki jej aktywności rybonukleazowej co powoduje pozostawienie małego odcinka jednoniciowego DNA komplementarnego do 3' końca RNA. Ten odcinek DNA jest transferowany na drugą stronę nici RNA i hybrydyzuje z 3' końcem i następnie dokończona zostaje synteza DNA(-) na matrycy RNA.
Działanie RT jako rybonukleazy prowadzi do usunięcia RNA z wyjątkiem małego fragmentu, który zostaje użyty jako primer do syntezy pozytywnej nici DNA. Ostatecznie zostaje utworzona dsDNA z LTR (long terminal repeats) na obu końcach.
LTR zawierają silne promotory transkrypcji i biorą udział w procesie integracji, który może zajść w dowolnym punkcie DNA komórkowego. Wintegrowany fragment wirusa nazywany jest prowirusem i staje się stabilnym elementem genetycznym. Prowirusowe DNA jest transkrybowane przez komórkową RNA polimerazę w RNA które zostaje opatrzone ogonem poly(A) i czapeczką cap, a następnie może zostać upakowane w cząsteczki wirusa lub może ulec translacji w białka wirusowe.
WIROIDY
Wiroidy są to małe, koliste cząsteczki jednoniciowego RNA. Wiroidy są najmniejszymi znanymi patogenami w postaci kwasu nukleinowego. Cząsteczki te atakują rośliny wyższe. Pozakomórkowo występują one w postaci "nagiego" RNA pozbawionego nawet kapsydu. Wiroidy nie zawierają genów kodujących białka strukturalne i są całkowicie zależne od komórki gospodarza.