1

ELEKTROFOREZA

Jest techniką analityczną, rzadko preparatywną, używana przede wszystkim do wizualizacji

produktów PCR. Polega na rozdzielaniu mieszaniny związków chemicznych, najczęściej białek

lub DNA, na możliwie jednorodne frakcje poprzez wymuszanie wędrówki ich cząsteczek

w polu elektrycznym wykorzystując ujemny ładunek tych cząsteczek (wędrówka do ANODY).

Elektoforezę można przeprowadzić w warunkach denaturujących (żele poliakrylamidowe,

el. pionowa), w których wyższe struktury zostają zniszczone, lub nie-denaturujących (żele

agarozowe, el. pozioma), które nie niszczą tych struktur. Innym wariantem jest elektroforeza

kapilarna, w której wykorzystuje się rozdział substancji w bardzo cienkich rurkach o średnicy

20-150µm i długości do 100cm. Efekt rozdziału analizujemy wykorzystując odczyty czułego

detektora umieszczonego na końcu rurki w okolicy anody.

Ryc. 1 Schemat elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.

Ryc. 2. Schemat elektroforezy w żelu agarozowym.

2

Ryc. 3. Schemat elektroforezy kapilarnej.

Agaroza (pochodna agaru) – polisacharyd o temp. topnienia 80

o

C. W postaci handlowej

zwykle ma postać białego proszku. Po zastygnięciu tworzy strukturę działającą jak „sito

molekularne” (ang. molecular sieve); małe i zwarte struktury przemieszczają się szybciej niż

większe, bardziej rozgałęzione. Stężenie agarozy dobierane jest do długości rozdzielanych

cząsteczek DNA:

Migracja cząsteczek w żelu zależy od wielu czynników:

•

Wyższe stężenie agarozy w żelu (gęstsze usieciowienie) – spowolnienie migracji.

•

Duże cząsteczki – wolna migracja („superzwinięte” (ang. supercoiled) i koliste

cząsteczki DNA migrują w innym tempie niż formy liniowe DNA; jednoniciowe DNA

i RNA migrują w podobnym tempie, szybciej niż dwuniciowe DNA o tej samej

długości).

•

Mały prąd – spowolnienie migracji (przy niskich napięciach migracja jest liniowo

proporcjonalna do przyłożonego napięcia; Migracja jest odwrotnie proporcjonalna do

logarytmu długości rozdzielanego fragmentu).

•

Dodanie związku interkalującego do DNA – spowolnienie tempa migracji DNA

o ok. 15%.

•

Bufor - przewodnik prądu elektrycznego; nie może niekorzystnie wpływać na kwasy

nukleinowe; zwykle zawiera EDTA, związek zapobiegający uaktywnieniu się nukleaz.

3

•

Stałe napięcie lub natężenie (najczęstsze napięcie: 20 – 150 V). Przy wyższym

napięciu, fragmenty dłuższe zaczną migrować proporcjonalnie szybciej niż krótsze.

Wyższe napięcie jest ograniczone ze względu na zwiększone wydzielanie ciepła, co

niekorzystnie wpływa na jakość rozdziału DNA.

Wizualizacja prążków na żelu odbywa się w świetle UV przy udziale barwnika fluoryzującego:

bromku etydyny (EtBr) – interkaluje pomiędzy sąsiednie pary zasad w dwuniciowym

DNA (powinowactwo EtBr do jednoniciowego DNA jest znacznie słabsze); ma silne

właściwości mutagenne i kancerogenne !!!

SYBR/MIDORI Green - 25- krotnie wyższa czułość barwienia dwuniciowego DNA

w stosunku do EtBr. Nietoksyczny.

Po wzbudzeniu światłem nadfioletowym barwnik intensywnie fluoryzuje, emitując światło

o fioletowym / zielonkawym / pomarańczowym zabarwieniu. Umożliwia to wykrywanie

bezpośrednio w żelu w świetle lampy UV nawet kilkudziesięciu ng DNA.

MARKERY MASY MOLEKULARNEJ (drabinki) służą określaniu wielkości cząstki DNA/RNA/białka

rozdzielanej na żelu. Są to preparaty zawierające fragmenty cząsteczek (białek, RNA lub

DNA) o znanych wielkościach. Stosuje się różne markery w zależności od gęstości żelu oraz

wielkości poszukiwanej cząsteczki (pz).

BARWNIK OBCIĄśAJĄCY PRÓBKI – dodawany do produktu PCR, zwykle w proporcji 1:3,

ułatwia obserwację migracji próby w żelu oraz uniemożliwia wypływanie próbek ze

studzienek.

Problemy mogące wystąpić podczas elektroforezy żelowej:

1. Nanoszony roztwór DNA wycieka ze studzienki

•

DNA jest zanieczyszczone etanolem lub olejem mineralnym albo żel nie jest

kompletnie zatopiony w buforze. Użyć więcej barwnika obciążającego, albo

przygotować barwnik obciążający z TAE zamiast wody.

•

Zapomniano o obciążniku lub nie dodano go w ogóle. Dodać obciążnik.

2. Widoczne bardzo słabe lub niewidoczne prążki DNA w żelu

•

Niewystarczająca ilość albo stężenie DNA nałożonego na żel. Zwiększyć zawartość

DNA, ale pamiętać, aby nie przekraczać 50 ng DNA na ścieżkę.

•

DNA zdegradowało. Możliwa kontaminacja nukleazami.

•

DNA „uciekło” z żelu; przeprowadzić elektroforezę przez krótszy okres czasu,

zastosować niższe napięcie, albo użyć wyższe stężenie żelu.

•

Użyć światła UV o krótszej długości fali (254 nm), aby znacznie zwiększyć czułość.

•

Jeśli chcemy izolować DNA z żelu do dalszych analiz (ligacja) zastosować światło UV

o długości 312 nm (zminimalizowanie degradacji DNA).

4

3. Widoczne rozmazane prążki DNA

•

DNA zdegradowało. Możliwa kontaminacja nukleazami.

•

Nałożono za dużo DNA na żel. Zmniejszyć ilość DNA.

•

Udoskonalić warunki elektroforezy; nie przykładać napięcia powyżej 20 V/cm

•

W czasie elektroforezy utrzymywać temperaturę poniżej 30ºC.

•

Skontrolować pojemność buforową (sprawdzić pH buforu przy anodzie i katodzie).

•

Zanieczyszczenie DNA białkiem. Zastosować ekstrakcje fenolem, przed elektroforezą,

w celu usunięcia nadmiaru białka.

4. Nieprawidłowa migracja prążków

•

Udoskonalić warunki elektroforezy; nie przykładać napięcia powyżej 20 V/cm

•

W czasie elektroforezy utrzymywać temperaturę poniżej 30ºC.

•

Skontrolować pojemność buforową (sprawdzić pH buforu przy anodzie i katodzie).

•

DNA zdenaturowało.

Ryc. 4. Przykładowy żel z opisem (DNA z kleszczy, PCR ze starterami na Borrelia burgdorferi

sensu lato). Widoczne ślady po za dużej ilości dodanych starterów.

dorosłe
kleszcze

nimfy
kleszczy

kontrola pozytywna

marker masy
molekularnej

kontrola negatywna

próby Borrelia dodatnie