2012-10-20

1

BADANIE PŁYNU

MÓZGOWO-RDZENIOWEGO

Analityka ogólna i techniki pobierania materiału

ZAGADNIENIA

Ocena właściwości chemicznych PMR.

Oznaczanie glukozy w PMR.

Ocena barwionych preparatów cytologicznych

PMR.

22-23.11.11

2012-10-20

2

B

IAŁKA W

PMR



Prawidłowe stężenie białka całkowitego w PMR:

-

0,15-0,4 g/l (15-40 mg/dl), przy czym wartości <45 mg/dl traktuje się
jako dopuszczalne (płyn z nakłucia lędźwiowego)

-

prawidłowy stosunek albumin/globulin: 2:1

Wzrost stężenia białka całkowitego:

-

krwawienie podpajęczynówkowe

-

ropne zapalenia mózgu

-

wirusowe zapalenie OMR (prawidłowe lub nieznacznie podwyższone)

-

guzy mózgu

ŹRÓDŁO BIAŁEK PMR:



Białka pochodzące z krwi (wyższe stężenie we krwi niż w PMR)

-

większość białek PMR

-

albumina, protrombina, IgG, IgA, IgM



Białka pochodzące z OUN (wyższe stężenie w PMR niż we krwi)

-

białko tau

-

białko S-100

-

NSE (enolaza neurospecyficzna)

-

cystatyna C



Białka pochodzące częściowo z krwi i częściowo z OUN

-

sICAM-1 (cząsteczka adhezyjna)

-

transtyretyna (prealbumina)

2012-10-20

3

I

MMUNOGLOBULINY



W warunkach fizjologicznych immunoglobuliny w PMR pochodzą tylko i
wyłącznie z krwi i dyfundują na drodze dyfuzji prostej.



W warunkach patologicznych (np. infekcje, SM, wrodzone zakażenia OUN):

- immunoglobuliny mogą być również syntetyzowane wewnątrzoponowo przez

limfocyty B i komórki plazmatyczne w OUN.

- dysfunkcja bariery krew-płyn również zwiększa dyfuzję Ig do płynu.

•

Dlatego informacja o współczynnikach immunoglobulinowych musi być
poparta informacją o Q

Alb

B

IAŁKO W

PMR-

ANALIZA JAKOŚCIOWA

We wstępnej ocenie białek w PMR pomocne są odczyny białkowe,

dające informację na temat zawartości białka i stosunku albumin/globulin:



Odczyn Pandy`ego

Do 1 ml odczynnika Pandy`ego (fenol) dodać 1 kroplę PMR.

- Powstanie zmętnienia świadczy o podwyższonej zawartości białka w płynie i jest

proporcjonalne do jego stężenia.



Odczyn Nonne-Apelta

Do 0,5 ml PMR dodać 0,5 ml odczynnika Nonne-Apelta (nasycony r-ór

(NH

4

)

2

SO

4

. Inkubować przez 3 min. Ocenić zmętnienie.

-

Zmętnienie świadczy o zwiększonej zawartości globulin do albumin.



Odczyn Weichbrodta

Do 0,3 ml PMR dodać 0,7 ml odczynnika Weichbrodta (0,1% r-ór sublimatu).

Inkubować 3 min. Ocenić zmętnienie.

-

Zmętnienie świadczy o podwyższonym stężeniu globulin.

2012-10-20

4

I

NTERPRETACJA I FORMUŁOWANIE WYNIKU

(

ODCZYNY BIAŁKOWE

)



Brak zmętnienia: odczyn ujemny (-)



Opalescencja: odczyn wątpliwy (+/-)



Lekkie zmętnienie: odczyn dodatni (+)



Średnie zmętnienie: odczyn dodatni (++)



Silne zmętnienie lub kłaczki: odczyn dodatni (+++)

BIAŁKO W PMR

-

ANALIZA ILOŚCIOWA

Metoda Extona

Zasada metody: Białko wytrąca się roztworem kwasu sulfosalicylowego

z siarczanem sodowym. Stopień zmętnienia próbki, proporcjonalny do

stężenia białka, określa się spektrofotometrycznie poprzez pomiar

absorbancji przy λ=445 nm.

2012-10-20

5

B

IAŁKO W

PMR



Współczynniki stężeń płyn/surowica

-

Białko w PMR i w surowicy (mg/dl)

-

eliminacja wpływu wahań dobowych stężeń białek we krwi na ich stężenia w PMR

-

eliminacja błędów analitycznych

-

Wartość prawidłowa: dla Qalb <9

-

9<Q

x

<14- lekkie upośledzenie bariery krew-mózg

-

14<Q

x

<30- umiarkowane upośledzenie bariery

-

30<Q

x

<100- poważne upośledzenie bariery

-

Q

x

>100- całkowite złamanie bariery

W

SKAŹNIKI PŁYN

/

SUROWICA C

.

D

.



Współczynnik albuminowy (Q

Alb

)- ocena sprawności bariery

krew-płyn

Im wyższy stopień dysfunkcji bariery krew-płyn, tym bardziej
nasilona dyfuzja albuminy z krwi do płynu, czego efektem jest
wzrost stężenia albuminy w płynie i wyższa wartość Q

alb

Górna granica wartości prawidłowej Q

Alb

w zależności od wieku dla

osób dorosłych:

*Prawidłowy Qalb w płynie pobranym z komór bocznych jest 3-krotnie niższy w

stosunku do płynu z worka lędźwiowego

Q

alb= [(wiek w latach)/15] +4

2012-10-20

6

W

SPÓŁCZYNNIKI PŁYN

/

SUROWICA



Współczynniki Q

IgG

, Q

IgA

, Q

IgM

(ocena wewnątrzoponowej syntezy immunoglobulin)

Zależność w warunkach prawidłowych:

Q

Alb

> Q

IgG

> Q

IgA

> Q

IgM (

uwarunkowane masą cząsteczkową białek)

-

oznaczenie stężenia Ig w surowicy i PMR

-

obliczenie górnej granicy wartości prawidłowej w zależności od Q

alb

wg.

wzorów:

- interpretacja wyników w oparciu o położenie na Reibergramach

W

SKAŹNIK

L

INKA I

T

IBLINGA



Wartości referencyjne: 0,3-0,7



Wzrost > 0,7: wewnątrzoponowa synteza IgG (np. SM)



Wartość < 0,3: uszkodzenie bariery krew-mózg

2012-10-20

7

I

NNE METODY STOSOWANE DO OZNACZANIA

BIAŁEK SPECYFICZNYCH



Metody immunochemiczne:

-

Immunoturbidymetryczne

-

Immunonefelometryczne

-

Immunoenzymatyczne

-

Radioimmunologiczne

-

Immunodyfuzja radialna

-

Immunochemiluminescencyjne

I

NNE METODY STOSOWANE DO OZNACZANIA

BIAŁEK SPECYFICZNYCH



Elektroforeza białek PMR

-

Płyn 100-200x zagęszczony (kondensatory kolodionowe)

-

pasmo prealbuminy (nieobecna w surowicy)

-

Białko tau - desjalizowana transferyna (pomiędzy frakcją beta i
gamma)



Większa zawartość β- globulin i mniejsza γ- globulin w stosunku do
surowicy



Brak fibrynogenu

•

Elektroforeza PMR wykonywana jest łącznie z elektroforezą

surowicy!

2012-10-20

8

F

RAKCJE ELEKTROFORETYCZNE

Frakcja białkowa

% białka całkowitego

Prealbuminy (transtyretyna)

2-3

albuminy

55-65

alfa 1- globuliny

5-7

alfa 2- globuliny

8-10

beta-globuliny

9-11

białko tau

3-4

gamma-globuliny

5-7

R

EIBERGRAMY

Interpretacja:

2012-10-20

9

JAKOŚCIOWA OCENA WEWNĄTRZOPONOWEJ SYNTEZY

IMMUNOGLOBULIN



Równolegle do badania ilościowego, należy przeprowadzić ocenę
jakościową w oparciu o ogniskowanie izoelektryzne

(rozdział białek w polu elektrycznym w zależności od ich
punktów izoelektrycznych. pH buforu zmienia się w sposób
ciągły od najwyższego przy katodzie do najniższego przy
anodzie)

np. w warunkach fizjologicznych frakcja IgG stanowi mieszaninę

białek pochodzących od różnych klonów. W stanach choroby (np.
infekcje wirusowe) zwiększa się produkcja IgG od jednego klonu,
skierowanych przeciwko jednemu lub kilku Ag tego patogenu
lub przeciw własnym Ag (choroby z autoagresji).



należy porównać obraz elektroforetyczny z rozcieńczonej
surowicy oraz PMR i zinterpretować badanie.

I

NTERPRETACJA WYNIKÓW OGNISKOWANIA

IZOELEKTRYCZNEGO

I

G

G

Ty
p

Prążki w
surowicy

Prążki w płynie

Interpretacja

1

brak

brak

obraz prawidłowy

2

brak

obecne

wewnątrzoponowa synteza IgG
(Choroby zapalne OUN)
Stwardnienie rozsiane

3

obecne

prążki identyczne
jak w surowicy +
prążki dodatkowe

zapalenie ogólnoustrojowe z
zajęciem OUN
(Neurosarkoidoza)

4

obecne

prążki wyłącznie
identyczne jak w
surowicy

zapalenie ogólnoustrojowe,
bierna dyfuzja IgG z krwi do
płynu
(Zespół Guillaina-Barre)

5

jeden lub kilka
silnie wysyconych
prążków
(monoklonalne)

obraz identyczny
jak w surowicy

gammapatie, np. szpiczak
bierna dyfuzja z krwi do płynu

2012-10-20

10

O

CENA WEWNĄTRZOPONOWEJ SYNTEZY PRZECIWCIAŁ

-

INDEKSY PRZECIWCIAŁ SPECYFICZNYCH

(

WSKAŹNIK HAGEDRONA

)



Ocena stężenia przeciwciał przeciwko poszczególnym
czynnikom patogennym (antygenom)



Oznaczenie stężenia danego przeciwciała w surowicy i
płynie metodami immunochemicznymi (wysoka czułość)



Obliczenie współczynników dla danego przeciwciała



Obliczenie indeksu przeciwciała (AI):

np.

AI

IgGpatogen

= Q

IgGpatogen

/Q

IgG

* w zależności która wartość jest niższa Q

IgG

czy Q

lim

(IgG), tę wartość należy

wstawić do wzoru.

WARTOŚĆ PRAWIDŁOWA: AI=0,7-1,3

Wartości ≥ 1,4 (wewnątrzoponowa synteza immunoglobulin danej klasy

Wartość < 0,7 (błąd analityczny)

B

ADANIA PODSTAWOWE



Glukoza w PMR

-

podstawowy substrat energetyczny neuronów

-

stężenie prawidłowe w PMR: 50-60% stężenia w surowicy ok. 40-75
mg/dl

Podwyższone stężenie:

-

brak znaczenia diagnostycznego w przypadku prawidłowego
stężenia we krwi

-

Cukrzyca

-

Urazy i udary mózgu

Obniżone stężenie:

-

Bakteryjne, grzybicze i gruźlicze zapalenia OMR

-

procesy nowotworowe w OUN

-

- hipoglikemia

*

krew i surowica powinny być pobrane do badania co najmniej po 4 godzinach od posiłku!

2012-10-20

11

GLUKOZA

W

PMR

Metoda heksokinazowa- Glukoza pod wpływem heksokinazy zostaje

ufosforylowana do glukozo-6-fosforanu, który pod wpływem dehydrogenazy jest
specyficznie utleniany do 6-fosfoglukonianiu, redukując NADP

+

do NADPH

2

.

Pomiaru absorbancji dokonuje się przy 340 nm. Obserwuje się wzrost absorbancji
proporcjonalny do stężenia glukozy.

heksokinaza

glukoza + ATP glukozo-6-P + ADP

dehydrogenza glukozo-6-P

glukozo-6-P + NADP

+

6-fosfoglukonian + NADPH + H

+

Interferencja: hemoliza próbki

BADANIA PODSTAWOWE

Chlorki w PMR

-

stężenie prawidłowe: 112-130 mmol/l

Metoda Zall’a, Fisher’a i Garner’a.

Jon chlorkowy (Cl-) zmieszany z roztworem niezdysocjowanego rodanku rtęciowego

preferencyjnie wiąże się z rtęcią tworząc chlorek rtęciowy. Uwalniany jon rodankowy SCN-

łączy się z jonami żelazowymi dając silnie zabarwiony rodanek żelazowy absorbujący

światło o długości fali 500 nm. Intensywność zabarwienia jest wprost proporcjonalna do

stężenia jonów chlorkowych w badanej próbce.

Stężenie podwyższone:

-

stany zapalne mózgu i rdzenia kręgowego

-

guzy mózgu

Stężenie obniżone:

-

gruźlicze zapalenie OMR

-

kiła układu nerwowego

-

Pląsawica

-

grzybicze zapalenie

2012-10-20

12

B

ADANIA UZUPEŁNIAJĄCE



Mleczany

-

reszty kwasu mlekowego powstające z komórkach na skutek
niedoboru tlenu;

-

stężenie mleczanów w PMR jest niemal niezależne od
stężenia w surowicy (produkcja w OUN)

-

parametr oceny procesów zapalnych w OUN



Stężenie prawidłowe: < 2,1 mmol/l

Wzrost stężenia:

-

choroby z dysfunkcją bariery krew-płyn

-

hipoksemiczne uszkodzenia mózgowo-rdzeniowe

-

krwawienie podpajęczynówkowe

-

obrzęk mózgu

-

zwiększona granulocytoza płynu

-

procesy nowotworowe w OUN

-

zakażenia bakteryjne > 3,5 mmol/l

-

zakażenia wirusowe < 3,5 mmol/l

-

Zakażenie grzybicze, gruźlica OUN,

B

ADANIA UZUPEŁNIAJĄCE



Białko tau



99% białka w PMR pochodzi z komórek OUN



stężenie prawidłowe: < 300 pg/ml

Podwyższone stężenie:

-

choroba Alzheimera

Obniżone stężenie:

-

neuroborelioza i inne choroby zapalne



Białko S-100b

-

izoforma ważna diagnostycznie w monitorowaniu
uszkodzeń w OUN, np. po urazach

-

Stężenie prawidłowe: < 1,4 ng/ml

2012-10-20

13

B

ADANIA UZUPEŁNIAJĄCE



Białko 14.3.3

-

białko produkowane w komórkach nerwowych.

-

nie występuje w prawidłowym PMR

Występowanie:

-

Choroba Creutzfeldta-Jakoba



NSE (enolaza neurospecyficzna)

produkowana przez kom. nerwowe i neuroendokrynne.

Stężenie prawidłowe: < 12,5 ng/l

Wzrost stężenia:

-

uszkodzenie neuronów, np. przy udarach



Inne: β-amyloid > 500 pg/ml

LITERATURA

1.

Mantur M, Lewczuk P. Płyn mózgowo-rdzeniowy. Badanie i
interpretacja wyników. Wydawnictwo Ekonomia i Środowisko,
Białystok, 2002.

2.

Dembinska-Kieć A, Naskalski JW. Diagnostyka laboratoryjna z
elementami biochemii klinicznej. Urban & Partner, Wrocław, 2010.

3.

Uszyński M (red.). Płyny z jam ciała. Powstawanie i badania
laboratoryjne. PZWL, Warszawa, 1998.

4.

Guder WG i wsp. Próbki: od pacjenta do laboratorium. MedPharm
Polska, Wrocław, 2009.

5.

Angielski S (red.). Biochemia kliniczna i analityka. PZWL, Warszawa,
1980.

6.

Brunzel NA. Diagnostyka laboratoryjna. Płyn mózgowo-rdzeniowy i
inne płyny ustrojowe. Kemona H, Mantur M (red.). Elsevier U&P,
Wroclaw, 2010.