UNIWERSYTET GDAŃSKI
WYDZIAŁ CHEMII
Katedra Analizy Środowiska

METODY ANALIZY ILOŚCIOWEJ

Gdańsk, 2007

Metody analizy ilościowej

2

1. Analiza ilościowa

Ilościową zawartość składników w próbce oblicza się, wykorzystując to, że ilość tych

składników jest proporcjonalna do powierzchni lub wysokości pików im odpowiadających. Do

obliczeń zaleca się wykorzystywanie wysokości pików pod warunkiem, że są one symetryczne.

W analizie ilościowej pewne znaczenie ma rodzaj zastosowanego detektora. Najlepsze

wyniki uzyskuje się stosując detektor absorpcji w nadfiolecie. Przy szerokim zakresie liniowości

charakteryzuje się on wysoką czułością. Należy tak dobrać warunki detekcji, np. długość fali

odpowiadającą maksimum absorpcji, aby nie trzeba było wykorzystywać maksymalnej czułości

detektora.

Na wyniki analizy chromatograficznej wpływ ma jakość zastosowanego przyrządu oraz

stałość warunków prowadzenia analizy. W czasie analizy temperatura kolumny, skład fazy

ruchomej i wielkość próbek dozowanych do kolumny nie powinny ulegać zmianie.

W chromatografii cieczowej analizę można wykonać przez porównywanie powierzchni lub

wysokości piku składnika analizowanej próbki i powierzchni lub wysokości piku wzorca. Postępuje

się tak przy analizie sposobem wzorca wewnętrznego, normalizacji czy kalibracji bezwzględnej.

Inną metodą jest metoda dodawania (dodatku) wzorca.

1.1. Metoda wzorca wewnętrznego

Spośród różnych metod oceny ilościowej, w analizie chromatograficznej śladowych próbek

zanieczyszczeń środowiska, największe znaczenie ma metoda wzorca wewnętrznego. Powodem jest

przede wszystkim mnogość operacji wykonywanych na próbce (min. ekstrakcji i przeprowadzania

jej w pochodne odpowiednie do analizowania metodą GC), w czasie których może nastąpić pewna

utrata próbki. Inne przyczyny to: problemy z określeniem małych objętości rozpuszczalnika, w

którym rozpuszczamy badaną próbkę, niemożność uzyskania powtarzalnego dozowania przy

zastosowaniu dozownika z dzieleniem oraz to, że eliminujemy konieczność wykonania krzywej

kalibracyjnej.

W metodzie tej do badanej próbki dodaje się określoną ilość wzorca (substancji

standardowej), dobrze oddzielającego się w danych warunkach analizy od wszystkich badanych

składników. Wzorzec powinien mieć własności maksymalnie zbliżone do własności substancji

badanej, nie może znajdować się w analizowanej próbce, poza tym powinien być nielotny, trwały i

dostępny w postaci czystej. Ilość dodanego wzorca powinna być porównywalna z ilością badanej

substancji.

Metody analizy ilościowej

3

Sygnał większości detektorów zależy od rodzaju analizowanych związków i dlatego

stosunek powierzchni sygnałów dwu składników nie jest równy stosunkowi ich zawartości w

mieszaninie. Odpowiedź detektora płomieniowo-jonizacyjnego (FID) jest wprost proporcjonalna do

liczby atomów węgla niezwiązanych z tlenem a nie do masy związku. Trudności tej można uniknąć

stosując metodę standardu wewnętrznego i wyznaczając tzw. współczynniki detekcji (odpowiedzi).

W tym celu należy wyznaczyć zależność między stosunkiem stężeń badanej substancji i wzorca a

stosunkiem odpowiedzi detektora dla badanej substancji i wzorca zgodnie ze wzorem:

W

S

h

h

f

m

m

W

S

=

(1)

gdzie: ms, mw- masa oznaczanej substancji i wzorca,

hs, hw - wysokości pików (lub powierzchnie) odpowiadające sygnałom badanej

substancji i wzorca,

f- współczynnik detekcji (odpowiedzi).

1.2. Metoda dodawania wzorca

Procedura oznaczeń w metodzie dodawania wzorca jest następująca:

a) przygotowujemy próbkę analizowaną i przeprowadzamy dla niej pomiar, mierząc wartość

Y

0

(w naszym przypadku wielkość absorpcji promieniowania UV, która jest proporcjonalna do

wysokości lub powierzchni sygnału chromatograficznego),

b) do tej samej próbki dodajemy znaną ilość substancji oznaczanej (wzorca), roztwór

mieszamy i mierzymy wartość Y

i

. Wartość parametru mierzonego wzrasta, a wzrost jest

proporcjonalny do ilości dodanego wzorca.

Stężenie analitu można wyliczyć na podstawie równań:

Y

0

= ac

(2)

Y

i

= a(c+c

s

)

(3)

gdzie: Y

0

oznacza pole powierzchni lub wysokość sygnału chromatograficznego analitu

zmierzony dla próbki bez dodatku wzorca, Y

i

– pole powierzchni lub wysokość

sygnału chromatograficznego analitu zmierzony dla próbki po dodaniu wzorca,

c – stężenie analitu w próbce, c

s

– stężenie wzorca w próbce.

Z równania (2) obliczymy a:

a = Y

0

/ c

(4)

Po podstawieniu do równania (3) otrzymamy :

Y

i

= Y

0

/ c · (c + c

s

)

(5)

Metody analizy ilościowej

4

Po rozwiązaniu równania (5) względem c otrzymamy:

c = Y

0

·c

s

/ (Y

i

– Y

0

)

(6)

Wynikiem dodania wzorca jest zmiana objętości roztworu próbki badanej, stąd należy

skorygować stężenia. W przypadku stosowania mikrostrzykawek i dozowania mikrolitrowych ilości

wzorca do analizowanej próbki, które nie wpływają w zasadniczy sposób na zmianę objętości

próbki, taka korekta objętości nie jest konieczna.

1.3. Metoda krzywej kalibracyjnej

W przeważającej części metod detekcji mierzony parametr jest funkcją liniową stężenia

agalitu:

Y = ac + b (7),

gdzie: Y - wielkość mierzona, c – stężenie analitu, a – współczynnik proporcjonalności,

a = BC/AB = tg α, b – wartość stała, jest często wartością eksperymentalną ślepej

próby.

którą można przedstawić graficznie (Rys. 1a)

Rys. 1a. Krzywa kalibracyjna Y = ac + b

Współczynnik proporcjonalności a określa czułość metody; im większe zmiany wartości mierzonej

Y na jednostkę stężenia c, tym większa jego wartość i tym wyższa czułość metody. Metody o małym

kącie nachylenia krzywych kalibracyjnych nie są przydatne do celów analitycznych. Parametr b

może przyjmować wartości dodatnie, ujemne lub zero.

W metodzie krzywej kalibracyjnej przygotowuje się szereg roztworów o znanych stężeniach

substancji analizowanych oraz tzw. ślepą próbę – roztwór, w którym są wszystkie składniki

roztworów wzorcowych z wyjątkiem analitu i dla każdego roztworu mierzy się wartość Y.

Zależność Y od c wzorców wykreśla się (Rys. 1b) lub wylicza równanie prostej. Wartość Y mierzy

Metody analizy ilościowej

5

się również dla próbki badanej, nanosi na krzywą kalibracyjną i odczytuje stężenie lub oblicza z

równania prostej.

Rys. 10. Krzywa kalibracyjna Y = a c

Przed przystąpieniem do oznaczeń metodą krzywej kalibracyjnej należy zbadać zakres

prostoliniowej zależności wartości mierzonej od stężenia analitu (Rys. 1c).

Rys. 1c. Krzywa kalibracyjna o ograniczonym zakresie stosowania

Na przedstawionej na Rys. 1c krzywej kalibracyjnej do celów analitycznych nadaje się zakres

stężeń od 0 do 5 (odcinek krzywej 0D). Krzywą kalibracyjną należy wykonywać w dniu pomiarów,

zmiana warunków pomiarów (np. temperatury) czy użycie innej partii odczynników może

powodować przesunięcie krzywej kalibracyjnej na osi Y lub zmianę nachylenia prostej Y = f(c).

Na wartość wielkości mierzonej może mieć duży wpływ matryca, czyli to wszystko, co

wprowadzamy do układu pomiarowego poza substancją oznaczaną. Udział matrycy należy

uwzględnić przy sporządzaniu roztworów wzorcowych, dbając by roztwory wzorcowe miały skład i

właściwości fizyko-chemiczne jak najbardziej zbliżone do właściwości roztworu analitu.

Zmniejszenie wpływu matrycy na wartość wielkości mierzonej można niekiedy uzyskać przez

wprowadzanie do próbki substancji maskujących. Ograniczenie wpływu matrycy może być trudne

D

Metody analizy ilościowej

6

lub niemożliwe, jak często bywa w przypadku próbek środowiskowych, należy wtedy zastosować

metodę dodawania wzorca lub zmienić sposób przygotowania próbki do pomiarów.

2. Wybrane wielkości w statystycznej analizie wyników

Analiza statystyczna pozwala na ocenę uzyskanych wyników w kategoriach

matematycznych. Poniżej przedstawione zostaną tylko wybrane, podstawowe wzory.

•

Średnia arytmetyczna z n wyników wyrażana jest wzorem:

n

x

x

i

∑

=

(8)

gdzie x

i

oznacza pojedynczy wynik.

•

Odchylenie standardowe pojedynczego wyniku (SD, standard deviation), które jest

miarą rozrzutu wartości indywidualnych wokół średniej, obliczamy ze wzoru:

(

)

1

2

−

−

=

∑

n

x

x

SD

i

(9)

•

Błąd standardowy, zwany odchyleniem standardowym średniej arytmetycznej (SE,

standard error

), wyraża się wzorem:

(

)

(

)

1

2

−

−

=

=

∑

n

n

x

x

n

SD

SE

i

(10)

•

Względne odchylenie standardowe średniej arytmetycznej (RSE, relative standard

error

) określa wielkość błędu standardowego wobec wartości średniej i wyrażane jest w

%:

100

x

SE

RSE

=

(11)