Pomiar widma absorpcji barwników w roztworach za pomocą spektrofotometru

Wykonali:

xxx

xxx

Grupa 2a

Zespół 1

Kierunek: Inżynieria Środowiska

Wydział: Ochrony Środowiska i Rybactwa

Oddziaływanie światła z materią obejmuje szeroki wachlarz zjawisk zachodzących zarówno w organizmach żywych, jak i w substancji nieożywionej. W organizmach żywych z oddziaływaniem tym jest związane wiele istotnych dla organizmu procesów z zakresu fizjologii roślin, zwierząt i człowieka oraz fotobiofizyki.

Procesy oddziaływania światła z substancją mają bardzo zróżnicowany charakter, zachodzą według różnych mechanizmów i prowadzą do różnych efektów końcowych. Ta różnorodność pozwala wykorzystać światło zarówno jako źródło energii i sensybilizator procesów biologicznych, jak i w celach analitycznych do badania substancji na poziomie molekularnym. W pierwszym przypadku aktualnym zagadnieniem o randze światowej jest na przykład wykorzystanie energii słonecznej do produkcji biomasy, szeroko omawiane w monografiach z zakresu współczesnej biotechnologii. Nie można również pominąć różnego rodzaju reakcji fotochemicznych i fotobiochemicznych, które są istotne w hodowli roślin i zwierząt oraz w przetwórstwie i przechowalnictwie.

Druga grupa zagadnień to penetracja substancji na poziomie molekularnym za pomocą światła, co pozwala śledzić reakcje biochemiczne, łącznie z przebiegającymi bardzo szybko, w nano - i femtosekundach, oraz badać strukturę i skład chemiczny tych substancji. Służą do tego różnorodne tzw. optyczne metody badania substancji.

Rozpatrzmy od podstaw zjawiska towarzyszące oddziaływaniu światła z substancją, ze szczególnym uwzględnieniem procesów i mechanizmów fotofizycznych. Światło, czyli promieniowanie optyczne, w spektroskopii jest to przedział długości fal elektromagnetycznych widzialnych (Vis) oraz podczerwień (IR) i ultrafiolet (UV). Przez światło często rozumie się tę część promieniowania elektromagnetycznego, którą rejestruje nasze oko, czyli promieniowanie optyczne widzialne - Vis.

Oddziaływanie światła z substancją obserwuje się zazwyczaj jako zjawiska załamania, odbicia, rozpraszania i pochłaniania. Informacji o przebiegu tych zjawisk dostarczają pomiary natężenia światła.

Światło ulega na ogół osłabieniu podczas przejścia przez substancję. Jeżeli wiązka światła o natężeniu
pada na substancję, ta część energii może ulec odbiciu (natężenie
) i absorpcji (
), pozostała zaś ilość energii przechodzi (natężenie
),

Zjawiska odbicia, rozpraszania i absorpcji występują zazwyczaj jednocześnie. Jeżeli jednak w trakcie pomiarów używa się właściwy rozpuszczalnik i zastosuje odpowiednią technikę pomiarową, to
i możemy mówić, że zachodzi tylko zjawisko absorpcji światła.

Natężenie światła przechodzącego przez substancję absorbującą zależy od ilości centrów absorbujących.

Zmiana natężenia światła (-dI) podczas przejścia przez warstwę o dowolnie małej grubości dl w roztworze, w którym stężenie molowe substancji pochłaniającej wynosi c, wyraża się wzorem:

Gdzie:

- współczynnik absorpcji

Stąd względne osłabienie światła przechodzącego można zapisać wzorem:

Aby obliczyć natężenie I światła po przejściu przez kuwetę, należy dodać wszystkie przyczynki do osłabienia wiązki wzdłuż drogi l, czyli scałkować powyższe równanie, stąd:

Jest to prawo Lamberta-Beera, które mówi, że natężenie światła przechodzącego przez roztwór substancji absorbującej zależy od natężenia światłą padającego, stężenia roztworu i grubości warstwy oraz od współczynnika absorpcji substancji rozpuszczonej. Współczynnik absorpcji jest wielkością charakteryzującą właściwości absorpcyjne substancji. Współczynnik absorpcji jest funkcją długości fali (a więc również funkcją częstotliwości) światła pochłanianego.

Prostszy zapis matematyczny prawa absorpcji otrzymuje się po logarytmowaniu wzoru
:

Czyli:

Wprowadzając oznaczenia:

(absorbancja)

Oraz

(molowy współczynnik absorpcji)

Należy zapisać:

W spektroskopii wielkość fizyczna zdefiniowana wzorem
nosi nazwę absorbancji (A), ekstynkcji (E) lub gęstości optycznej (D). W dostępnych podręcznikach i monografiach używa się zarówno symbolu A jak i E. Stosunek natężeń wiązek świetlnych można łatwo zmierzyć, dlatego absorbancja jest podstawową wielkością optyczną, którą wyznacza się doświadczalnie. Molowy współczynnik absorpcji (
) ma taki sam sens fizyczny jak współczynnik absorpcji (
). Współczynnik absorpcji liczbowo jest równy absorbancji warstwy roztworu o jednostkowej grubości i jednostkowym stężeniu.

Inną wielkością używaną w spektroskopii jest transmitancja T, wyrażona w %.

Związek między transmitancją, a absorbancją jest następujący:

Substancje w różny sposób absorbują światło o różnej częstotliwości, dlatego współczynnik ekstynkcji
jest funkcją częstotliwości
lub, inaczej długości fali
:

Gdzie:

c - prędkość światła.

Zależność współczynnika absorpcji od długości fali lub częstotliwości nazywa się widmem absorpcji. Widmo absorpcji jest charakterystyczne dla danej substancji w danych warunkach fizycznych.

Podany uprzednio związek między absorbancją (A) i molowym współczynnikiem absorpcji (
):

Jest znany jako prawa Bouguera-Lamberta-Beera.

Widmo absorpcji substancji zależy od struktury cząsteczek tej substancji. Za pochłanianie fal optycznych w zakresie widzialnym i ultrafiolecie są odpowiedzialne głównie elektrony walencyjne, czyli tzw. elektrony
i
. Widma te w spektroskopii nazywa się widmami elektronowymi.

Aby zrozumieć mechanizm pochłaniania światła przez substancję należy prześledzić zjawisko na poziomie molekularnym z punktu widzenia teorii kwantowej. W spektroskopii molekularnej, oprócz czterech liczb kwantowych (n, l, m, s), wprowadza się nową liczbę kwantową
- opisującą elektron w cząsteczce. Weźmy pod uwagę cząsteczkę dwuatomową. W takiej cząsteczce wektor całkowitego momentu pędu elektrony walencyjnego może ustawić się pod różnymi kątami do prostej łączącej jądra atomów. Rzut momentu pędu na tę prostą jest kwantowany zgodnie z zasadami mechaniki kwantowej. Wynikająca z tego kwantowania liczba kwantowa
może przybierać wartości 0, 1, 2, … Jeżeli stan elektronu jest opisany liczbą kwantową
= 0, nazywa się go elektronem
, dla
= 1 mamy elektron
.

Aby wyjaśnić charakter absorpcyjnych widm elektronowych i ich związek ze strukturą cząsteczki należy wziąć pod uwagę dozwolone stany energetyczne cząsteczki i rozpatrzyć zmiany energii cząsteczki, jakie mogą zachodzić pod wpływem energii dostarczonej z zewnątrz. Pod wpływem kwantów świetlnych ulega zmianie energia elektronów
i

cząstki, energia oscylacji
atomów w cząsteczce i energia rotacji cząsteczki bądź grup atomów w cząsteczce
. Energie te kwantowane, czyli mogą przyjmować tylko ściśle określone wartości. Zbiór tych wartości można przedstawić na schemacie w postaci poziomów energetycznych cząsteczki.

Typowymi przyrządami do pomiaru absorpcji są różnego rodzaju spektrofotometry, za pomocą których można zmierzyć absorbancję badanej substancji w zależności od długości fali (lub częstotliwości) światła absorbowanego. Widmo absorpcji można również badać dowolnym zestawem pomiarowym, który pozwoli wyznaczyć
.

Absorpcję światła widzialnego i ultrafioletu przez cząstki wykorzystuje się w badaniach biologicznych i technologicznych do:

1. Analizy jakościowej substancji - na podstawie położenia maksimum pasm absorpcji można identyfikować substancję absorbującą oraz wnioskować o tych parametrach określających strukturę substancji, które są związane z elektronami
i
.
2. Analizy ilościowej - z wartości absorbancji A wyznacza się stężenie substancji, co stanowi podstawę analizy ilościowej. Jest to metoda zwana spektrofotometrią absorpcyjną. Jeżeli w metodzie tej stosuje się światło widzialne, to często nazywa się ją metodą kulometryczną.

Widmem absorpcji nazywa się w spektroskopii zależność współczynnika absorpcji
od długości fali
,
. Jak wynika ze wzoru:

Wartość absorbancji A dla danej długości fali
jest iloczynem wartości współczynnika
dla tej samej długości fali i stałej wartości c l, która nie zależy od
. Stąd wniosek, że wykres zależności
ma taki sam charakter (ilość pasm absorpcji, ich kształt) i dostarcza podobnych informacji jak wykres funkcji
. Wykres zależności
można również traktować jako widmo absorpcji.

Pomiaru widma absorpcji dokonuje się za pomocą spektrofotometru. Kolejno dla poszczególnych długości fal
odczytujemy na skali spektrofotometru absorbancję A i transmiatację T w zakresie ultrafioletu i w dziedzinie widzialnej lub tylko w dziedzinie widzialnej. Podczas pomiaru absorbancji roztworów jako natężenie światła
przyjmuje się natężenie światła przechodzącego przez kuwetę z rozpuszczalnikiem. W ten sposób eliminuje się osłabienie wiązki w wyniku załamania i rozpraszania światła w kuwecie i rozpuszczalniku.

Widmo absorpcji mierzymy punktowo za pomocą spektrofotometru VSU2P lub w sposób ciągły, z automatycznym zapisem za pomocą spekordu UV-VIS oraz spektrofotometru M40 z automatycznym wydrukiem wartości absorbancji.

Natężenie światła
przechodzącego przez kuwetę jest proporcjonalne do powstałego fotoprądu i. Dla danej długości fali, przy przejściu światła przez odnośnik można więc zapisać:

Natomiast przy przejściu światła przez próbkę badaną:

Stąd:

Wykonanie pomiaru:

1. Włączyć spektrofotometr do sieci,
2. Przesłonę zamknąć, ustawiając pokrętło w pozycji 0,
3. Wskazówkę miernika sprowadzić do pozycji 0% za pomocą potencjometru. Odczekać około 2 min i ponownie wykonać „zerowanie” miernika,
4. Nastawić długość fali na wybraną wartość. Pomiary wykonujemy kolejno dla długości fal w przedziale widma absorpcji badanej substancji co 5 lub 10 nm,
5. Ustawić koszyczek tak, by kuwetę z odnośnikiem wprowadzić w bieg wiązki świetlnej,
6. Otworzyć przesłonę,
7. Za pomocą potencjometru ustawić wskazówkę miernika na wartość = 100%,
8. Roztwór ryboflawiny o stężeniu
M/l wprowadzić w bieg promieni i odczytać wskazania ekstynkcji i transmisji,
9. Potencjometr „100” cofnąć o kilka obrotów w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara (w lewo),
10. Dla każdej długości fali powtarzać czynności od punktu 5,
11. Wyniki zestawić w tabelce,
12. Wykreślić zależność
i
.

---