Stan septyczny-mechanizmy immunologiczne oraz niektóre aspekty diagnostyki laboratoryjnej.

1. Definicje: zakażenie, SIRS, sepsa

Sepsa (tj. zakażenie uogólnione) jest jednym z najczęstszych powikłań u pacjentów po zabiegach operacyjnych i główną przyczyną zgonów na oddziałach intensywnej opieki medycznej, oraz noworodków. Nawet w krajach o wysokim standardzie opieki medycznej śmiertelność z powodu sepsy wynosi 30-50%, a w ostatnim 10-leciu wykazuje tendencję do wzrostu. Najczęstszą przyczyną sepsy są zakażenia spowodowane przez bakterie Gram (+) i Gram (-), a także grzyby (szczególnie Candida), wirusy i pasożyty (szczególnie u osób z zaburzeniami odporności.

Sepsa może przebiegać bez obecności wykrywalnych czynników infekcyjnych. Czynnik infekcyjny udaje się bowiem zidentyfikować technikami hodowlanymi (posiew) tylko w około 50% przypadków, u pacjentów klinicznie zdiagnozowanych jako sepsa lub wstrząs septyczny. Użycie technik molekularnych (identyfikacja sekwencji DNA czynnika infekcyjnego) znacząco zwiększyło możliwości wykrywania czynników infekcyjnych. Czynniki nie infekcyjne takie jak endotoksyny (LPS) bakterii Gram (-), niektóre inne toksyny bakteryjne (np. superantygeny gronkowcowe lub paciorkowcowe, enterotoksyny, etc) także indukują reakcje septyczne. Czynnikami efektorowymi sepsy są natomiast cytokiny, przede wszystkim TNF-alfa. Ich obecność jest wynikiem aktywacji układu odpornościowego zarówno przez czynniki infekcyjne (bakterie, wirusy, grzyby, pasożyty) oraz nie infekcyjne (toksyny, mediatory komórkowe zapalenia).

Prawidłowa odpowiedz immunologiczna na zakażenie wywołana jest przez aktywację komórek układu odpornościowego, co powoduje przejściowy i kontrolowany wzrost syntezy cytokin i innych mediatorów zapalenia, eliminację czynnika infekcyjnego oraz powrót układu odpornościowego do stanu aktywacji sprzed infekcji.

Przeciwnie, w przypadku sepsy dochodzi do uogólnionej reakcji odpornościowej na zakażenie i gwałtownego, nie kontrolowanego wzrostu syntezy wielu czynników pro i przeciw-zapalnych.

Sepsa charakteryzuje się szeroką gamą objawów klinicznych, z których najpoważniejszy jest wstrząs septyczny, tj. najbardziej niekorzystna forma odpowiedzi układu odpornościowego na aktywację przez czynniki infekcyjne lub/i nie infekcyjne.

Pomimo znacznego postępu w zakresie antybiotykoterapii i technik intensywnej opieki medycznej ciągle śmiertelność w przebiegu sepsy wynosi około 50%.

W zależności od przebiegu klinicznego i intensywności odpowiedzi immunologicznej stany infekcyjne klasyfikuje się jako:

• zapalenie (infekcja), tj. proces patologiczny zlokalizowany, ograniczony do tkanek lub jam ciała, spowodowany przez ich inwazję drobnoustrojami patogennymi lub potencjalnie patogennymi.

• uogólnioną odpowiedz pro-zapalną (systemic inflammatory response syndrome-SIRS), rozpoznawaną w przypadku spełnienia co najmniej 1 z 4 następujących kryteriów: a) temperatura ciała > 38 C lub < 36 C , b) akcja serca > 90/min, c) hiperwentylacja: częstość oddechowa > 20/min, wskaznik P_a CO₂ < 32 mmHg, d) leukocytoza (> 12000/ul) lub leukopenia (<4000/ul)

• Sepsę (zakażenie uogólnione): zespół kliniczny charakteryzujący się obecnością zarówno infekcji jak i SIRS (odpowiedz na infekcję), rozpoznawany w przypadku spełnienia co najmniej 2 kryteriów z 4, wymienionych powyżej.

• Ciężką sepsę: sepsa powikłana niewydolnością narządową, hipoperfuzją narządowo-tkankową lub spadkiem ciśnienia.

• Wstrząs septyczny: zespół septyczny z utrzymującym się spadkiem skurczowego ciśnienia tętniczego poniżej <90 mm Hg (u dzieci < 2 SD normy dla wieku), a rozkurczowego <60 mmHg, lub obniżeniem ciśnienia skurczowego o więcej niż 40 mm Hg w odniesieniu do wartości podstawowej, bez innej przyczyny spadku ciśnienia.

Wprowadzenie tzw systemu PIRO porządkuje pacjentów z wstrząsem septycznym wg. następujących parametrów P (czynniki predysponujace -predisposing conditions), I (czynnik inicjujący-initial factor), R (zakres odpowiedzi pro-zapalnej- response), O (dysfunkcja narządowa- organ dysfunction).

Sepsa- mechanizmy patofizjologiczne

Objawy kliniczne sepsy wywoływane są przez nadmierną reaktywność komórkowych i humoralnych mechanizmów odpornościowych indukowanych najczęściej przez czynniki infekcyjne. Jednak ich aktywacja nie powoduje eliminacji czynników infekcyjnych lecz indukuje układ odporności naturalnej (makrofagi, granulocyty, komórki śródbłonka naczyniowego, limfocyty NK, cytokiny, dopełniacz) oraz adaptacyjnej (limfocyty T i B).

W przebiegu sepsy dochodzi do ogólnoustrojowej reakcji immunologicznej, manifestującej się zróżnicowanym obraz klinicznym, którego najcięższą postacią jest wstrząs septyczny spowodowany zaburzeniami krzepnięcia i fibrynolizy, niewydolnością krążeniowo-oddechową oraz dysfunkcją narządową.

I. Znaczenie makrofagów w patogenezie sepsy

Kluczowe znaczenie makrofagów w patogenezie sepsy wynika z ich funkcji jako komórek fagocytujących. Komórki te stykają się jako pierwsze z czynnikami infekcyjnymi, penetrującymi obszar tkankowy.

Makrofagi pełnią 2 główne funkcje: a) są komórkami o silnych właściwościach fagocytarnych i bójczych, mogą więc uczestniczyć w bezpośredniej eliminacji czynników infekcyjnych (funkcje efektorowe), b) wykazują zdolność do syntezy wielu cytokin tzw. pro-zapalnych: TNF-alfa, IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, IL-18 oraz przeciw-zapalnych: IL-10 i IL-13, a także prezentują antygeny limfocytom T (funkcje immunoregulacyjne).

• Receptory uczestniczące w aktywacji makrofagów.

Kontakt makrofagów z czynnikami infekcyjnymi zachodzi poprzez złożony system receptorowy. Receptory te rozpoznają ograniczoną liczbę struktur komórkowych (co najwyżej kilkaset), powszechnie występujących w różnych gatunkach drobnoustrojów. Struktury te określa się jako „pathogen associated molecular patterns” (PAMPs) a receptory je rozpoznające „pattern recognition receptors” (PRRs)

Do systemu PAMPs należą: LPS, peptydoglikan, kwas lipotechojowy, grupy węglowodanowe, bakteryjny DNA, dwuniciowy RNA, glukany.

„Pattern recognition receptors” kodowane są przez geny linii zarodkowej, nie wykazują więc restrykcji klonalnej, a ich swoistość dla danego patogenu jest identyczna wśród komórek danego typu np. makrofagów. Kontakt tych receptorów z rozpoznawaną strukturą drobnoustrojów indukuje natychmiastową reakcję komórkową, zazwyczaj bez proliferacji. Oprócz makrofagów ekspresję „pattern recognition receptors” wykazują monocyty, komórki dendrytyczne i limfocyty B (profesjonalne komórki prezentujące antygen) oraz granulocyty.

Strukturalnie „pattern recognition receptors” należą do wielu rodzin białek. Czynnościowo dzielą się na trzy grupy: wydzielnicze, endocytarne i sygnałowe. Poziom ich ekspresji ulega znacznym zmianom w przebiegu zarówno ograniczonej reakcji infekcyjnej jak i zakażeń uogólnionych. Ocena ekspresji niektórych z tych receptorów znalazła zastosowanie w diagnostyce i prognozowaniu przebiegu zakażeń, w tym także stanów septycznych, stąd poniżej przedstawiono ich krótką charakterystykę.

Receptory wydzielnicze działają jako opsoniny, tj. białka opłaszczające drobnoustroje. Opsonizacja ułatwia eliminację drobnoustrojów przez komórki fagocytujące, które ulegają aktywacji wskutek interakcji opsonin z receptorami monocytów, makrofagów oraz granulocytów. Do białek o działaniu opsonizującym należą tzw białka odpowiedzi ostrej fazy, składniki dopełniacza oraz immunoglobuliny.

Białka odpowiedzi ostrej fazy.

Jest to grupa białek których poziom w surowicy wzrasta (pozytywne białka ostrej fazy) lub maleje (negatywne białka ostrej fazy). Białka ostrej fazy syntetyzowane są w wątrobie w wyniku stymulacji hepatocytów przez cytokiny (TNF-alfa, IL-1, IL-6, IL-8), uwalniane są do krążenia przez aktywowane makrofagi oraz inne komórki (monocyty, granulocyty, komórki śródbłonka naczyniowego i limfocyty T).

Białka ostrej fazy uczestniczą w reakcjach odpornościowych zarówno w stanach infekcyjnych jak i nie infekcyjnych. Wzmagają oporność na zakażenie oraz stymulują procesy odnowy uszkodzonych tkanek.

Do najważniejszych białek ostrej fazy należą: białko C reaktywne, lektyna wiążące mannozę (MBL), alfa-1 antytrypsyna, alfa-1 chymotrypsyna, alfa-2 makroglobulina, niektóre czynniki krzepnięcia (fibrynogen, protrombina, czynnik VIII, czynnik von Willebranda), składniki dopełniacza, ferrytyna, amyloid P oraz A.

Albumina także należy do grupy białek ostrej fazy. Ponieważ jej poziom maleje w ostrych stanach infekcyjnych określana jest zatem jako negatywne białko ostrej fazy.

Białko C-reaktywne oraz MBL działają jako opsoniny, opłaszczające drobnoustroje, co wzmaga ich wrażliwość na fagocytozę, oraz aktywują układ dopełniacza.

Białko C-reaktywne rozpoznaje reszty fosforylocholiny polisacharydu C Streptococcus pneumoniae (stąd nazwa) oraz polisacharydów ściany komórkowej wielu innych drobnoustrojów. Interakcja tego białka z polisacharydami indukuje składnik C1q dopełniacza, co uruchamia klasyczną drogę jego aktywacji. Poziom białka C-reaktywnego w surowicy wzrasta gwałtownie w przebiegu infekcji lub stanach odczynowych (nie infekcyjnych). Chociaż białko to nie jest swoistym markerem dla sepsy to uważa się, że wzrost jego poziomu w surowicy jest jednym z wykładników aktywności zapalenia i stąd CRP uważany jest za jeden z biologicznych wykładników sepsy. Poziom tego białka wzrasta w póznym okresie sepsy.

Opinie co do diagnostycznej wartości oznaczania poziomu CRP u osób dorosłych są różne (od wysokiej do niskiej użyteczności testu). Poziom CRP u pacjentów septycznych waha się w szerokim zakresie (od 12-159 mg/L) a u osób z zespołem SIRS od 13-119 mg/L. Test charakteryzuje się stosunkowo niską swoistością (69%) i czułością (61%), (przy wartościach „cut off „ w zakresie od 4-150 mg/L.

Wartość diagnostyczna oznaczania CRP u noworodków jest także przedmiotem sprzecznych doniesień, chociaż jest wyższa niż u osób dorosłych. Wartości „cut off” są niższe i wskazują na mniejszą produkcję CRP zarówno u zdrowych niemowląt (0.1-0.6 mg/L) jak i niemowląt septycznych (1-77 mg/L). Przydatność diagnostyczna testu CRP u niemowląt z podejrzeniem sepsy jest najwyższa w okresie 24-48 godzin po urodzeniu, ponieważ przez pierwsze 24 godziny życia stabilizuje się poziom tego białka niezależnie od infekcji. Średnia czułości testu wynosi 65%, a czułość 90%.

Generalnie przydatność CRP w diagnostyce i monitorowaniu zakażeń jest większa u noworodków, osób w wieku podeszłym i niedoborach odporności, tj. w sytuacjach, kiedy leukocytoza i dojrzałość leukocytów nie są wyłącznymi wykładnikami infekcji.

W przypadku infekcji wzrost poziomu CRP nie jest specyficzny w odniesieniu do etiologii zakażenia (wirusowe, bakteryjne). Często poziom CRP jest wysoki przypadkach wzmożonej reaktywności ustroju na antygeny bakteryjne i wirusowe (superantygeny, toksyny) nawet przy ujemnych testach na obecność drobnoustrojów (posiew).

Wzrost poziomu CRP zależy także od wielu czynników nie infekcyjnych. Poziom CRP jako jednego z wielu białek ostrej fazy wzrasta w każdym procesie chorobowym w trakcie którego dochodzi do zapalenia przewlekłego (autoagresja, uczulenie) lub uszkodzenia i odnowy tkanek (uraz, zabiegi operacyjne).

MBL należy do grupy białek z rodziny kolektyn (zawiera 6 globularnych domen połączonych przez struktury białkowe bogate w kolagen). Domeny te rozpoznają reszty węglowodanowe zawierające mannozę i fukozę, obecne w błonie komórkowej drobnoustrojów. Opsonizacja drobnoustrojów przez MBL ułatwia ich fagocytozę przez komórki fagocytujace, oraz uruchamia lektynową drogę aktywacji dopełniacza, gdyż MBL jest czynnościowo związana z 2 proteazami surowicy (Masp-1 i Masp-2), których aktywacja uruchamia kaskadę dopełniacza (analogicznie jak w przypadku proteaz C1r i C1s drogi klasycznej).

Podobnie jak w przypadku innych białek ostrej fazy poziom MBL w surowicy jest niski, lecz wzrasta w przebiegu infekcji, co pośrednio powoduje wzrost aktywności fagocytarnej leukocytów i wzmożenie pro-zapalnego działania układu dopełniacza.

Zarówno bialko C-reaktywne jak i MBL czynnościowo zbliżone są do immunoglobulin w sensie ich działania jako opsonin oraz zdolności do indukcji układu dopelniacza (nie wykazują jednak cech swoistości immunoglobulin jako białek rozpoznających określone antygeny).

Receptory endocytarne (endocytic pattern recognition receptors). Jest to grupa receptorów błony komórkowej fagocytów rozpoznających określone struktury drobnoustrojów (pattern associated molecular pattern). Interakcja tych receptorów z tymi strukturami zapoczątkowuje proces fagocytozy, którego pierwszym etapem jest receptorowo-zależna endocytoza.

Do tej grupy receptorów komórkowych należą struktury błony komórkowej fagocytów rozpoznające reszty cukrowe błony komórkowej drobnoustrojów, tj. receptory typu scavenger, receptory makrofagów wiążące mannozę, oraz receptor dla glukanu

Receptory typu scavenger-„wymiatacze” rozpoznają polimery anionowe oraz acetylowane lipoproteiny o niskiej gęstości. Stanowią strukturalnie heterogenną grupę cząsteczek. Niektóre z nich rozpoznają także struktury komórek gospodarza osłonięte przez kwas sialowy. Ułatwiają fagocytozę starych krwinek czerwonych, które utraciły grupy sialowe, a także drobnoustrojów patogennych. Jednym z receptorów tej grupy jest receptor CD163, którego ekspresja może być markerem poziomu aktywacji komórek fagocytujących w przebiegu sepsy.

Receptor komórkowy wiążący mannozę jest lektyną typu C, rozpoznający reszty cukrowe mannozy i fukozy wielu bakterii i niektórych wirusów, w tym wirusa HIV. Występuje w błonie powierzchniowej makrofagów. Wykazuje znaczne podobieństwo strukturalne i czynnościowe z MBL (lektyna wiążąca mannozę). Jako komórkowy receptor przez-błonowy należy do grupy receptorów indukujących fagocytozę.

•Receptory sygnałowe. Receptory sygnałowe rozpoznają struktury drobnoustrojów (pathogen associated molecular pattern) oraz transmitują sygnały indukujące ekspresję wielu genów odpowiedzi imunologicznej, w tym kodujących syntezę cytokin, chemokin, cząsteczek adhezyjnych oraz kostymulacyjnych. Do receptorów tej grupy należą tzw receptory toll, zidentyfikowane po raz pierwszy u muszki owocowej (Drosophila), receptor CD14.

Receptory komórkowe dla składników dopełniacza, tj. CR1 (CD35), CR2 (CD21), CR3 (CD11b/CD18), CR4 (CD11c/CD18), receptory C5a i C3a, oraz receptory dla fragmentów Fc immunoglobulin (CD16, CD32 i CD64) nie wiążą bezpośrednio określonych struktur powierzchniowych drobnoustrojów, lecz wchodzą w interakcję ze składnikami dopełniacza oraz fragmentami Fc immunoglobulin opłaszczających drobnoustroje i inne komórki. Można więc je także uznać za receptory sygnałowe, ponieważ uczestniczą w sygnalizacji komórkowej, wpływając zarówno na funkcje efektorowe jak i regulacyjne wielu typów leukocytów. Ich ekspresja generalnie zwiększa się w przebiegu zakażeń i oznaczanie ekspresji niektórych tych receptorów znalazło zastosowanie w monitorowaniu przebiegu i leczenia sepsy.

-Receptory toll

Receptory typu toll (TLR) obejmują grupę 10 białek (TLR 1-TLR 10), zawierających odcinek trans-błonowy (bogaty w domeny o wysokiej zawartości leucyny) oraz odcinek cytoplazmatyczny o konserwatywnej strukturze, wysoce homologiczny z cytoplazmatycznym odcinkiem receptora dla IL-1 (domena Toll/IL-1 receptor, tj. TIR). Każdy z tych receptorów rozpoznaje określone struktury drobnoustrojów, określane jako „pattern associated molecular patterns” (PAMPs) takie jak: a) kwasy lipoteichowe i lipoproteiny (TLR 2), b) dwuniciowy wirusowy RNA -dsRNA (TLR 3), c) lipopolisacharydy -LPS (TLR 4), d) flagelina (TLR 5), f) imidazolo-chinolony oraz jedno-niciowy wirusowy RNA-ssRNA (TLR 7 i TLR 8), g) niemetylowane sekwencje oligo-dezoksy-nukleotydowe DNA zawierające CpG (TLR9). TLR 1 oraz TLR 6 są aktywne tylko jako dimery w połączeniu z TLR 2. Liganda dla TLR 10 nie jest znana. Ekspresję receptorów toll (TLRs) wykazują wszystkie komórki układu leukocytarnego (fagocyty, komórki dendrytyczne), oraz nieliczne limfocyty (komórki NK i limfocyty B). Receptory TLR 3, 7, 9 rozpoznające białka wirusowe wykazują lokalizację endosomalną, natomiast pozostałe zlokalizowane są w błonie komórkowej.

TLRs oraz inne receptory komórkowe z rodziny IL-1R zawierają wewnątrzkomórkową domenę znaną jako Toll-IL-1R (TIR). Wszystkie receptory Toll z wyjątkiem TLR-3 zangażowane są w indukcji pro-zapalnych reakcji komórkowych (droga klasyczna) przebiegających z udziałem co najmniej 2 białek cytozolu, zawierających domenę TIR, tj. mieloidalnego czynnika różnicowania 88 (MyD88) oraz cząsteczki TIRAP (białko adaptorowe z domeną TIR, czynnościowo związane z TLR-2 i TLR-4). Interakcja TLRs z ich ligandami powoduje indukcję szeregu kinaz związanych z IL-1R, tworząc tzw kompleks IRAK (IL-1R associated kinases). Kompleks ten zawiera 2 aktywne kinazy IRAK-1 i IRAK-4 oraz 2 katalitycznie nie aktywne podjednostki IRAK-2 i IRAK-3). Kinazy te pośredniczą w aktywacji jądrowego czynnika transkrypcyjnego (NF-kappa B) oraz szeregu innych kinaz białkowych (mitogen -activated protein kinases-MAPKs), co powoduje uruchomienie tzw klasycznej drogi aktywacji pro-zapalnych cytokin i chemokin tj. IL-1 beta, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-alfa. Droga alternatywna aktywacji komórek fagocytujących (via receptory TLRs 3,4,7,8,9) prowadzi do syntezy interferonów alfa i beta.

Powiązanie profilu ekspresji receptorów typu toll z przebiegiem klinicznym sepsy nie jest jeszcze wyjaśnione, chociaż prowadzi się szereg badań w tym kierunku. Generalnie uważa się, że zakażenia lokalne i uogólnione związane są ze wzrostem ekspresji tych receptorów na monocytach, makrofagach i granulocytach, co jest wykładnikiem aktywacji tych komórek. Dotychczas nie wykazano jednak aby poziom ich ekspresji korelował z przebiegiem sepsy.

- Receptor CD14

Receptor CD14 jest glikoproteiną o m. cz 55 kDa. Jest jednym z najważniejszych receptorów komórkowych zaangażowanych w reakcjach odpornościowych. Warunkuje bowiem możliwość interakcji komórek z LPS bakterii Gram (-) oraz uczestniczy reakcjach odpornościowych indukowanych przez bakterie Gram (+). Poziom ekspresji tego receptora jest ważnym wykładnikiem prognostycznym przebiegu infekcji, w tym także stanu septycznego. Jego ekspresję wykazują monocyty (wysoki poziom ekspresji) makrofagi (pośrednia expresja), aktywowane granulocyty (niska ekspresja).

Receptor CD14 występuje w formie związanej z błoną komórkową (mCD14) oraz w formie rozpuszczalnej (sCD14), obecnej w surowicy. Forma błonowa receptora CD14 związana jest z GPI (glikozylo-fosfatydylo-inozytol), natomiast sCD14 nie jest związana z GPI. Pomimo, że GPI nie zawiera sekwencji sygnałowej to dzięki wiązaniu z kinazami tyrozyny zapewnia możliwość indukcji sygnału aktywującego fosforylację białek i aktywację komórek po interakcji mCD14 z LPS.

W interakcji mCD14-LPS uczestniczy receptor komórkowy TLR 4 oraz białko surowicy o m. cz 60 kDa, tzw LBP (białko wiążące LPS), należące do grupy białek odpowiedzi ostrej fazy. LBP wiąże lipid A cząsteczki LPS, tworząc kompleks LBP-LPS wiążący się z receptorem mCD14. Receptor ten wchodzi następnie w interakcję z TLR 4, co powoduje aktywację czynnika transkrypcyjnego NF-kappa B i syntezę wielu cytokin o działaniu pro zapalnym (IL-1, TNF-alfa, IL-6, IL-18) oraz przeciw zapalnym (IL-10, IL-13). LBP wiąże także kwas lipoteichowy i inne komponenty ściany komórkowej drobnoustrojów Gram (+). Poziom tego białka wzrasta nie tylko w infekcjach bakteryjnych, lecz także grzybiczych, natomiast nie ulega zmianom w zakażeniach wirusowych. Są próby wykorzystania pomiaru poziomu LBP w surowicy jako biomarkera sepsy, najczęściej w powiązaniu z innymi wykładnikami zapalenia jak np. IL-6 lub CRP.

Wiązanie mCD14 z LPS zależy od LBP jedynie w przypadku niskiego stężenia LPS. LBP katalizuje wiązanie LPS-CD14 i wzmaga odpowiedz komórek docelowych na LPS. Znaczenie LBP polega także na inaktywacji LPS zawartego w kompleksie CD14-LPS. Po interakcji kompleksu CD14-LPS z komórkami docelowymi dochodzi do dysocjacji LPS, który ulega unieczynnieniu przez lipoproteiny surowicy. W procesie tym uczestniczy LBP, którego obecność zwiększa ponad 100-krotnie przejście LPS do frakcji lipoprotein. W przewlekłych stanach infekcyjnych lub masywnych zakażeniach (sepsa) może więc dojść do wyczerpania rezerw lipoprotein co zmniejsza możliwość inaktywacji LPS i zwiększa aktywację fagocytów via mCD14 przez LPS.

Zablokowanie ekspresji receptora CD14 monocytów przez przeciwciała anty-CD14 in vitro zmniejsza ich zdolność do syntezy cytokin, przede wszystkim IL-1, TNF-alfa oraz IL-6, ogranicza adhezję monocytów do komórek śródbłonka naczyniowego, hamuje proliferację limfocytów T poprzez mechanizm ograniczający interakcję limfocyt T/monocyt, a także zmniejsza działanie komórek T jako limfocytów T pomocniczych w syntezie przeciwciał.

Efekt hamujący na ekspresję receptora CD14 wywierają cytokiny o działaniu przeciw-zapalnym, tj. IL-4, IL-10 oraz IL-13. Monocyty preinkubowane z tymi cytokinami wykazują zmniejszoną odpowiedz na LPS (słabsza synteza TNF-alfa). Niektóre wirusy, zwłaszcza CMV także hamują ekspresję receptora CD14 makrofagów płucnych, co sugeruje że częste zapalenia płuc wywołane przez drobnoustroje Gram (-) u chorych po transplantacji mogą być spowodowane infekcją CMV, co obniża zdolność makrofagów do odpowiedzi na LPS.

Wzrost ekspresji receptora CD14 spowodowany jest przez cytokiny pro-zapalne, tj. głównie IL-1, TNF-alfa oraz IL-6. Szczególne znaczenie w regulacji ekspresji receptora CD14 ma także LPS. W niskiej dawce (1-10 ng/ml) wzmaga ekspresję mCD14 poprzez wzrost transkrypcji mRNA, natomiast w wyższych stęzeniach powoduje spadek ekspresji mCD14 i wzrost uwalniania sCD14.

Wzrost poziomu sCD14 w surowicy jest niekorzystnym czynnikiem prognostycznym w przebiegu infekcji. Ilość sCD14 w surowicy osób zdrowych wynosi < 4 pg/ml i pochodzi ze spoczynkowych komórek, uwalniających sCD14 z błony komórkowej. Ta postać sCD14 ma masę cząsteczkową 49kDa i pochodzi z enzymatycznego rozszczepienia mCD14, natomiast w zakażeniach bakteryjnych pojawia się izoforma sCD14 o c.cz 55 kDa. Pochodzi ona z białka uwalnianego z wnętrza komórki.

Znaczenie sCD14, nie związanego z GPI i stąd niezdolnego do indukcji sygnału aktywującego komórki, polega na interakcji z LPS i tworzeniu kompleksów LPS-sCD14. Kompleksy te, przez nieznany receptor, wiążą się z komórkami epitelialnym i endotelialnymi, które nie mogą bezpośrednio wiązać LPS i powodują ich aktywację, indukując syntezę cytokin, Infekcja, a zwłaszcza stan septyczny znacznie zwiększa uwalnianie sCD14 z komórek (monocytów, makrofagów i aktywowanych granulocytów), indukowanych przez LPS i inne struktury ścian komórkowych drobnoustrojów. Kompleksy sCD14-LPS wchodzą następnie w interakcje z komórkami nie wykazującymi ekspresji receptora CD14 lub z jego niską ekspresją, co wywołuje wzmożoną syntezę IL-1, TNF- i innych cytokin o działaniu prozapalnym, zaostrzającym proces zapalenia.

Cząsteczki sCD14 mogą konkurować z mCD14 o wiązanie LPS. Interakcja sCD14-LPS blokuje bowiem wiązanie LPS błony komórkowej bakterii z mCD14 monocytów i makrofagów. Powoduje to osłabienie ich funkcji efektorowych (fagocytoza, efekt cytotoksyczny) i przyczynia się do przetrwania zakażenia. Zjawisko to jest jedną z przyczyn tzw tolerancji na LPS i anergizacji monocytów i makrofagów w przebiegu sepsy.

II. Znaczenie granulocytów w stanie septycznym

Granulocyty stanowią podstawową i najliczniejszą populację komórek efektorowych. Komórki te występują jedynie w krążeniu i w warunkach nie infekcyjnych nie przechodzą z przestrzeni naczyniowej do tkanek. W razie infekcji przechodzą do tkanek i działają jako komórki fagocytujące i cytotoksyczne (poprzez uwalnianie szeregu enzymów proteolityczych oraz wielu toksycznych związków tlenu). W warunkach fizjologicznych aktywności te są konieczne dla szybkiej i efektywnej eliminacji infekcji.

W przypadku zakażenia zlokalizowanego granulocyty przechodzą do przestrzeni poza naczyniowej w ograniczonym zakresie. Proces ten jest ściśle kontrolowany przez białka receptorowe endotelium oraz odpowiednie dla nich ligandy w błonie komórkowej granulocytów i obejmuje: a) spowolnienie przepływu komórek krwi w łożysku naczyniowym, b) adhezję granulocytów do komórek śródbłonka naczyniowego, c) agregację granulocytów oraz ich transmigrację do tkanki (diapedeza) poprzez połączenia międzykomórkowe endotelium naczyniowego. Migracja granulocytów jest ściśle ukierunkowana przez chemokiny, tj. heterogenną grupę wielu białek o działaniu chemotaktycznym, produkowanych zarówno przez komórki nabłonkowe jak i leukocyty. Wychodzenie granulocytów poza łoże naczyniowe do przestrzeni tkankowej połączone jest z silną aktywacją zarówno komórek endotelium jak i granulocytów. Dochodzi do obkurczania post-włosowatych naczyń żylnych, miejscowego ograniczenia przepływu krwi, zwiększania przepuszczalności ściany naczyniowej, wyjścia płynu i białek z krążenia do przestrzeni tkankowej oraz wykrzepiania wewnątrznaczyniowego. Efektem tych zjawisk jest obrzęk, zaczerwienienie, ból i wzrost temperatury w miejscu objętym infekcją. Wskutek tych zjawisk nie dochodzi jednak do rozprzestrzenienia zakażenia i szybkiej eliminacji infekcji.

W przypadku zakażenia uogólnionego (sepsa) zachodzą identyczne zjawiska w zakresie aktywacji endotelium i leukocytów z tym, że proces ten przybiera formę masywnej stymulacji i uszkodzeń endotelium naczyniowego o charakterze wielonarządowym. Proteazy neutrofilów i toksyczne związki tlenu, produkowane przez aktywowane granulocyty, uszkadzają komórki śródbłonka naczyniowego, niszczą połączenia międzykomórkowe endotelium i drastycznie zwiększają przepuszczalność naczyń. Aktywacja granulocytów zwiększa ich adhezję do śródbłonka naczyniowego. Aktywowane granulocyty wykazują zmiany ekspresji wielu receptorów błonowych. Oznaczanie ekspresji z niektórych z nich (spadek ekspresji selektyny L) lub wzrost ekspresji integryny CD11b lub receptora CD64 znalazło zastosowanie w ocenie stanu aktywacji tych komórek w celu monitorowania przebiegu i leczenia sepsy Jednocześnie granulocyty tracą w znacznym stopniu wiele właściwości czynnościowych, warunkujących ich działanie protekcyjne (wykazują słabą aktywność fagocytarną i bójczą) związaną z osłabieniem ich funkcji metabolicznych takich jak produkcja nadtlenku wodoru, reaktywnych form tlenu oraz enzymów proteolitycznych o działaniu anty-bakteryjnym. Zmiany te w znacznym stopniu związane są z masywną odnową szpikową i przechodzeniem do krążenia młodych postaci granulocytów o ograniczonym działaniu anty-bakteryjnym, jednak zdolnych do produkcji wielu czynników pro-zapalnych (cytokin i enzymów proteolitycznych) powodujących uszkodzenia wielonarządowe po przejściu tych komórek do przestrzeni poza naczyniowej.

III. Znaczenie komórek endotelium naczyniowego

Uogólniona dysfunkcja endotelium naczyniowego jest najistotniejszym czynnikiem patogenetycznym sepsy. W warunkach fizjologicznych komórki endotelium wywierają szereg aktywności utrzymujących prawidłową homeostazę (kontrola aktywności układu krzepnięcia i fibrynolizy, układu dopełniacza, aktywacji leukocytów, etc). Uszkodzenia endotelium w przebiegu sepsy spowodowane są poprzez: a) działanie czynników toksycznych (wolne rodniki tlenu, metabolity kwasu arachidonowego, produkty przemiany beztlenowej i kwasicy mleczanowej), b) aktywację układu dopełniacza, agregację płytek, aktywację neutrofilów, działanie cytokin produkowanych przez leukocyty jak i aktywowane komórki endotelium, tj. IL-1, IL-6, TNF-alfa, IFN-alfa i beta i inne). Wymienione zmiany pro-zapalne określa się jako „aktywacja komórek endotelium” lub „złośliwe zapalenie wewnątrznaczyniowe”. Powodują one przejście endotelium ze stanu o aktywności przeciw-krzepliwej do stanu o aktywności pro-krzepliwej, nadmierną syntezę czynników wazo aktywnych, ekspresję wielu cząsteczek adhezyjnych (ICAM-1, LFA-1, VCAMs) i produkcję mediatorów zapalenia.

Zmiany te powodują zwiększanie przepuszczalności naczyń włosowatych, masywne przechodzenie płynu do przestrzeni poza naczyniowej, obrzęk tkanek i spadek ciśnienia. Hypo-perfuzja tkanek i spadek ciśnienia pogłębiane są poprzez rozszerzanie naczyń (obniżanie się oporu naczyniowego) wskutek masywnej produkcji kinin (serotonina, bradykinina), histaminy i innych wazo-aktywnych peptydów, powstających podczas aktywacji kaskady pro-zapalnej (działanie niektórych składników dopełniacza). Wzajemne interakcje makrofagów tkankowych i ich produktów oraz neutrofilów i komórek endotelium zwiększają aktywności pro-zapalne.

IV. Znaczenie układu dopełniacza w sepsie

Układ dopelniacza składa się z grupy enzymatycznie czynnych białek surowicy, które ulegają sekwencyjnej aktywacji w wyniku indukcji przez kompleksy immunologiczne (droga klasyczna), niektóre białka ostrej fazy (droga lektynowa), oraz komponenty ściany komórkowej bakterii (droga alternatywna). Aktywacja układu dopelniacza przez czynniki infekcyjne powoduje powstawanie szeregu aktywnych białek działających jako: a) opsoniny opłaszczające drobnoustroje i wzmagające ich fagocytozę, b) czynniki chemotaktyczne powodujące rekrutację leukocytów do miejsca zakażenia, c) lizę drobnoustrojów i zakażonych komórek.

Aktywności dopełniacza związane są więc ze wzrostem przepuszczalności ściany naczyniowej, ukierunkowaną migracją leukocytów do przestrzeni poza-naczyniowej oraz wzmożoną aktywnością fagocytarną leukocytów i cytolizą komórek. W warunkach ograniczonej infekcji działanie dopelniacza ma charakter lokalny i jest kontrolowane przez szereg mechanizmów, których zadaniem jest ochrona komórek i tkanek przed toksycznym działaniem aktywowanych składników dopełniacza.

W warunkach uogólnionego zakażenia (różne postacie sepsy) dochodzi do masywnej i nie kontrolowanej aktywacji dopełniacza i nadmiernej produkcji niektórych składników o działaniu chemotaktycznym (głownie C3a i C5a), które wywierają także silne działania anafilaktyczne (skurcz mięśniówki gładkiej naczyń i oskrzeli, wzmożenie przepuszczalności ściany naczyniowej, stymulacja makrofagów i granulocytów). Aktywowane składniki dopełniacza uczestniczą też w indukcji adaptacyjnego układu odpornościowego (prezentacja antygenu limfocytom T, aktywacja limfocytów T i B, wzmaganie syntezy przeciwciał i wielu komórkowych reakcji cytotoksycznych zależnych od przeciwciał). Wszystkie te aktywności znacznie wzrastają w przebiegu sepsy, lecz nie skutkują eliminacją czynnika infekcyjnego, a przyczyniają się jedynie do uszkodzenia tkanek i niewydolności narządowej.

V. Znaczenie cytokin w sepsie

Poziom ekspresji wielu cytokin ulega zmianom w przebiegu sepsy. Kinetyka ich produkcji i profil ekspresji wskazuje, że sepsa jest procesem dwufazowym.

Faza I zależy od działania pro-zapalnych cytokin uwalnianych głównie przez monocyty i makrofagi w początkowym okresie infekcji. Jej wykładnikami są wzmożona produkcja białek ostrej fazy oraz cytokin pro-zapalnych głównie TNF-alfa, beta, IL-1 alfa i beta, IL-6, IL-8, IL-12 i IL-18, których poziom wzrasta gwałtownie w pierwszym (prozapalnym okresie sepsy).

Faza II zależy od szeregu czynników przeciwzapalnych, produkowanych przez monocyty, makrofagi i limfocyty T w przebiegu sepsy. Należą do nich cytokiny takie jak IL-4, IL-10, Il-13, TGF-beta .

Pomimo silnej stymulacji komórki układu odpornościowego (granulocyty monocyty, makrofagi i limfocyty) tracą własności zapewniające eliminację czynnika infekcyjnego, lecz wywołują reakcje odpornościowe skutkujące przewagą fazy I (prozapalnej) lub II (przeciwzapalnej) reakcji septycznej. Obie te fazy wymagają innego leczenia-generalnie odpowiednio, przeciwzapalnego lub stymulujacego.

Znaczenie patogenetyczne cytokin w sepsie sprawiło, że dla celów predykcyjnych podejmowano liczne próby oceny ich poziomu w surowicy. Generalnie poziom cytokin w surowicy nie okazał się jednak przydatnym biomarkerem sepsy, ponieważ trudno było wykazać korelację pomiędzy aktualnym stanem klinicznym a ich poziomem w surowicy.

Składa się na to szereg przyczyn zarówno technicznych jak i związanych z metabolizmem cytokin. Test immunoenzymatyczny ELISA (najczęściej stosowany do oznaczeń poziomu cytokin) jest czasochłonny ponieważ wymaga szeregu inkubacji badanych próbek i wynik otrzymuje się po kilku godzinach. Większość cytokin charakteryzuje się krótkim okresem półtrwania we krwi. Na ich poziom wpływa też obecność inhibitorów cytokin oraz przeciwciał anty-cytokinowych, niestabilność cytokin w związku z przetrzymywaniem próbek w temperaturze pokojowej.

Z cytokin najczęściej oznaczanych w sepsie wymienia się: TNF-alfa, IL-1, IL-6, IL-1RA, IL-8, IL-18 oraz IL-10.

TNF-alfa jest jedną z najważniejszych cytokin produkowanych w przebiegu infekcji przez wiele komórek takich jak monocyty, makrofagi, komórki dendrytyczne, limfocyty T, komórki NK, granulocyty, komórki tuczne i aktywowane komórki śródbłonka naczyniowego. Drobnoustroje Gram (+) indukują bezpośrednio monocyty, makrofagi i granulocyty do produkcji TNF-alfa. Natomiast produkcja TNF-alfa w infekcjach wywołanych przez drobnoustroje Gram (-) zależy w znacznej mierze od IFN-gamma (syntetyzowanego przez komórki NK aktywowanych LPS), który „uczula” makrofagi, monocyty i granulocyty na działanie LPS i powoduje masywną syntezę TNF-alfa nawet przy niskim stężeniu LPS. Toksyczne działanie TNF-alfa na tkanki jest pośrednie, tj. zależy od działania cytotoksycznego komórek (granulocytów i makrofagów) które pod wpływem stymulacji przez TNF-alfa syntetyzują enzymy proteolityczne (elastaza, hydrolazy, toksyczne związki tlenu (nadtlenek wodoru i jon nadtlenkowy), sPLA 2, czynnik aktywacji płytek (PAF), leuktrien B4 i tromboksan A2.

TNF-alfa uważa się za czynnik inicjujący reakcje odpornościowe w przebiegu infekcji, które powodują dalszą, masywną syntezę innych cytokin pro-zapalnych. Poziom TNF w surowicy w eksperymentalnej endotoksemii może wzrastać nawet 20-krotnie ( >800 ng/L) już w 2 godziny po podaniu LPS.

Pomimo roli patogenetycznej TNF w sepsie oznaczanie poziomu tej cytokiny w surowicy ma raczej niewielką wartość diagnostyczną ponieważ nie pozwala precyzyjnie różnicować sepsy lub braku zakażenia zarówno u dorosłych jak i niemowląt (średnia czułości testu 55% i swoistości 66% u dorosłych oraz 79% i 71% u niemowląt, przy wartościach „cut off” odpowiednio 11.5 ng/L i 12-20 ng/L). W większości doniesień, poziom TNF alfa w surowicy w przypadkach sepsy nie przekracza 100 ng/L i jest znacznie poniżej maksymalnego poziomu tej cytokiny obserwowanego w eksperymentalnej endotoksemii. Wątpliwości w uznaniu poziomu TNF jako markera sepsy wynikają też z innych przyczyn takich jak: a) znaczenie ogólne tej cytokiny w reakcji zapalnej (lokalnej i uogólnionej), b) krótkotrwały maksymalny wzrostem stężenia w surowicy w odpowiedzi na czynnik infekcyjny, c) krótki okres półtrwania (ok. 17 min), d) wysoki poziom rozpuszczalnych form receptorów komórkowych dla TNF w surowicy w przebiegu sepsy.

Podobnie jak w przypadku TNF, odpowiedz komórek układu odpornościowego na czynniki infekcyjne manifestuje się także szybkim wzrostem produkcji IL-6 już we wczesnej fazie zakażenia. Znaczenie tej cytokiny w sepsie jest kontrowersyjne. Uważana jest generalnie za cytokinę o działaniu pro-zapalnym, chociaż istnieją doniesienia o jej aktywnościach przeciw-zapalnych. Sprzeczności te wynikają z uogólnionego działania IL-6 zarówno jako ko-stymulatora wielu reakcji typu komórkowego (udział w indukcji proliferacji i różnicowania wielu typów limfocytów T, a także komórek NK i limfocytów B. IL-6 syntetyzowana jest zasadniczo przez te same komórki jak TNF -alfa. Toksyczne działania IL-6 zależą od aktywacji wielu komórkowych reakcji cytotoksycznych z udziałem granulocytów (uwalnianie elastazy), limfocytów T i NK oraz makrofagów.

Wiele doniesień wskazuje na korelację wysokiego poziomu IL-6 w surowicy z ciężkością zakażeń. U dorosłych ze stanem septycznym poziom IL-6 w surowicy opisywany jest w granicach od 300-2700 ng/L, oraz w zakresie powyżej 100 ng/L w zespole SIRS. Niektóre inne doniesienia sugerują jednak brak znaczących różnic w stężeniu IL-6 w zespole SIRS i sepsie, jak również u pacjentów po urazowych z powikłaniami septycznymi lub bez powikłań na tle infekcyjnym. Sprzeczności te potwierdza niewystarczająca czułość (67%) i swoistość (65%) testów IL-6 wykonywanych u dorosłych ze stanami septycznymi.

W przeciwieństwie do osób dorosłych, oznaczanie poziomu IL-6 w surowicy ma znaczenie diagnostyczne u niemowląt. Wartości IL-6 w surowicy u niemowląt ze stanem septycznym wahają się w granicach 47-1617 ng/L (u zdrowych od 2-42 ng/L). Pomimo tej zmienności, średnia czułości testów (84%) jest wysoka, przy swoistości w zakresie 71%. Interpretacja wyników musi być jednak ostrożna. Należy brać pod uwagę zarówno wiek ciążowy jak i okres pobierania próbek do badań. Warto dodać, że u zakażonych płodów poziom IL-6 gwałtownie spada w pierwszych 24 godzinach po urodzeniu i to zarówno i płodów donoszonych jak i nie donoszonych; niektóre doniesienia wskazują na wzrost IL-6 tylko u płodów nie donoszonych z sepsą, bez zmian u płodów donoszonych.

Szczególne znaczenie w sepsie mają cytokiny z rodziny IL-1, tj. IL-1α, IL-1β oraz antagonista komórkowego receptora dla IL-1 (IL-1ra).

IL-1 produkowana jest przez podobne typy komórek jak TNF-alfa oraz IL-6, tj. monocyty, makrofagi, limfocyty T, komórki dendrytyczne oraz granulocyty, a także aktywowane komórki endotelium. W przebiegu sepsy IL-1 aktywuje granulocyty, powodując wzmożoną syntezę prostaglandyn oraz elastaz, i kolagenaz. Zwiększa także trans-endotelialną migrację granulocytów i indukuje pro-zapalne aktywności komórek endotelium , które syntetyzują PAF i IL-8 (czynniki silnie stymulujące granulocyty). IL-1 działa synergistycznie z TNF i wykazuje wiele podobnych aktywności biologicznych.

Pomimo tych aktywności i wiodącej roli w patogenezie sepsy oznaczanie poziomu IL-1β u pacjentów z sepsą ma minimalne znaczenie diagnostyczne i prognostyczne (sprzeczne dane wskazują na wzrost jak i spadek poziomu tej cytokiny w przebiegu sepsy u dorosłych) i niemowlat.

Przeciwnie, poziom IL-1ra w surowicy wzrasta u pacjentów dorosłych z sepsą (w zakresie od 2-31 ug/L); IL-1ra nie jest wykrywalny u osób zdrowych. U zdrowych niemowląt poziom IL-1ra miesci się w zakresie 2-3 ug/L, a u zakażonych wzrasta do poziomu od 6-30 ug/L. W niektórych przypadkach u zakażonych niemowląt poziom IL-1ra wzrasta znacznie ( 3-15 krotnie powyżej normy) na odpowiednio 2-4 dni przed rozpoznaniem klinicznym stanu septycznego; średnie czułości i swoistości testu wynoszą odpowiednio 93 i 92%.

Poziom IL-8 w surowicy także ulega zmianom w przebiegu sepsy. IL-8 jest silnym czynnikiem chemotaktycznym granulocytów. W kooperacji z innymi cytokinami (głównie TNF-alfa i IL-1) oraz chemokinami aktywuje granulocyty indukując ukierunkowaną migrację tych komórek oraz wzmagając ekspresję cząsteczek adhezyjnych.

U osób dorosłych z sepsą poziom IL-8 w surowicy jest wyższy niż u osób zdrowych, nie ma jednak znaczenia diagnostycznego w różnicowaniu pomiędzy stanem infekcyjnym i nie infekcyjnym. Średnia czułości testu wynosi u dorosłych tylko 63% przy swoistości 76% (wartości kontroli w zakresie 30-340 ng/L).

Pewne znaczenie diagnostyczne ma pomiar poziomu tej cytokiny w surowicy niemowląt z sepsą: wzrost w zakresie od 94-4335 ng/L przy wartości kontroli 2-42 ng/L; średnia czułości testu 93%, a swoistości 72%.

Jednym z biologicznych wykładników zapalenia jest także poziom IL-18, której ekspresja wzrasta w przebiegu infekcji. Cytokina ta produkowana jest głownie przez makrofagi i monocyty indukowane przez drobnoustroje Gram (+) i Gram (-). Infekcja wywołana przez bakterie Gram (+) powoduje silniejszą indukcję syntezy IL-18 aniżeli zakażenia wywołane przez drobnoustroje Gram (-) zarówno w warunkach in vivo jak i in vitro. IL-18 stymuluje limfocyty NK do produkcji IFN-gamma i wzmaga różnicowanie limfocytów T w kierunku pro-zapalnych komórek typu Th1 i Tc1.

Szereg badań wskazuje na użyteczność IL-18 jako markera sepsy, pozwalającego m. in. na różnicowanie sepsy ze stanami urazowymi i powikłaniami infekcyjnymi. Poziom IL-18 w surowicy pacjentów septycznych waha się w granicach 588-1121 ng/L, natomiast u osób nie zakażonych (kontrola) wynosi 64- 188 ng/L. Na wartość diagnostyczną IL-18 jako biomarkera sepsy może wpływać pózny wzrost poziomu tej cytokiny w surowicy w przebiegu zakażenia. Sugeruje się, że jednoczesne oznaczanie poziomu białka wiążącego IL-18 (izoforma IL-18 Bpa), inaktywującego większość aktywności IL-18 w surowicy, znacząco zwiększy wartość diagnostyczną testu.

Poza czynnikami pro-zapalnymi, zwiększającymi aktywności komórek fagocytujących i endotelium naczyniowego, w przebiegu sepsy wzrasta także poziom szeregu cytokin o działaniu przeciw-zapalnym takich jak IL-10, IL-13 oraz TGF-beta. Cytokiny te hamują wiele komórkowych reakcji pro-zapalnych, głównie poprzez blokowanie syntezy innych cytokin tj. TNF-alfa, IL-1, IL-6, 1L-12 oraz IL-18, produkowanych przez monocyty, makrofagi i aktywowane komórki endotelium w pro-zapalnej fazie sepsy.

Większość badań dotyczących cytokin przeciw-zapalnych w sepsie i stanach urazowych nie powikłanych czynnikami infekcyjnymi dotyczy IL-10. Sepsa powoduje wzrost poziomu IL-10 w surowicy w szerokim zakresie (22-383 ng/L). Szczególnie wysoki poziom IL-10 obserwuje się w zakażeniach wywołanych przez drobnoustroje Gram (-), ponieważ LPS jest silnym induktorem tej cytokiny zarówno in vivo jak i in vitro, a komórkami produkującymi IL-10 stymulowanymi LPS są głównie makrofagi i monocyty. W warunkach eksperymentalnych podanie LPS powoduje szybki wzrost poziomu IL-10 w surowicy, osiągającym wartość szczytową już po 3 godzinach od podania. Z drugiej strony wzrost stężenia IL-10 obserwuje się także w stanach urazowych już po 2 godzinach od urazu, oraz u pacjentów chirurgicznych nie powikłanych zakażeniem.

Dane te generalnie wskazują na udział IL-10 w kompensacyjnym zespole odpowiedzi przeciw-zapalnej, powstającej w mniejszym lub większym zakresie w przebiegu każdej odpowiedzi immunologicznej indukowanej czynnikami infekcyjnymi i nie infekcyjnymi (reakcja odczynowa).

W dotyczące stężenia IL-10 w sepsie u noworodków są ograniczone, lecz także wskazują na jej wzrost surowicy w zakresie 113 ng/L (sepsa) i 36 ng/L (kontrola).

VI. Prokalcytonina (PCT)

W odróżnieniu od wielu cytokin i białek ostrej fazy znaczenie PCT w odpowiedzi immunologicznej nie jest wyjaśnione. Na udział PCT w aktywacji kaskady cytokin pro-zapalnych wskazuje wzrost poziomu PCT w surowicy następujący krótko po zwiększeniu się poziomu TNF-alfa po podaniu LPS i dodatniej korelacji (r=0.86) pomiędzy poziomem obu tych biomarkerów. Wzrost poziomu PCT już po 2-6 godzinach po podaniu LPS i utrzymywanie się wysokiego plateau przez dalsze 8-24 godzin (już po spadku poziomu TNF-alfa) wskazuje na potencjalną przydatność oznaczania PCT jako biomarkera sepsy. Ważną cechą PCT jako biomarkera jest długi okres półtrwania (22-29 godzin) oraz stały wzrost poziomu w surowicy w trakcie trwania infekcji, niezależnie od typu drobnoustrojów wywołujących zakażenie (Gram + Gram -).

Wątpliwości co do przydatności PCT jako biomarkera sepsy budzą jednak doniesienia wskazujące na wzrost PCT w wielu stanach zapalnych nie związanych z zakażeniem takich jak dysfunkcja wątroby, uraz (wzrost poziomu PCT już w 3 godziny po urazie), eliminacja limfocytów T w celach terapeutycznych, oparzenia, udar cieplny. Przeciwnie, u pacjentów septycznych z leukopenią poziom PCT jest niski i nie przekracza poziomu 2 ug/L nawet w warunkach szoku septycznego. Dane te wskazują na ciągle niejasne znaczenie PCT w reakcjach odpornościowych.

Pomimo pozytywnej korelacji pomiędzy postaciami zakażenia (SIRS, sepsa, ciężka sepsa i wstrząs septyczny) a poziomem PCT w surowicy, poziom PCT nie ma bezpośredniego znaczenia diagnostycznego. Wielu autorów wskazuje na brak użyteczności PCT w diagnostyce różnicowej sepsy, urazu lub SIRS. Szeroki zakres czułości (65-97%; średnia 85%) i swoistości (48-94%; średnia 73%) testów potwierdzają te wątpliwości.

Dane dotyczące użyteczności PCT w diagnostyce sepsy u noworodków są ograniczone w porównaniu do obserwacji u osób dorosłych. Podobnie jak w przypadku CRP poziom PCT wzrasta przez pierwsze 24 godziny po urodzeniu, osiągając wartość szczytową po pierwszej dobie. Powoduje to trudności porównywania danych z różnych, ciągle nielicznych doniesień, z uwagi na różny wiek noworodków. Poziom PCT u noworodków z sepsą waha się w granicach 12-78 ug/L, przy wartości kontroli (zdrowe noworodki) w zakresie 0.8-2.5 ug/L.

Zakres czułości testu PCT jest podobny jak u osób dorosłych (77-99% średnia 85% ), przy nieco większej swoistości (62-91%; średnia 83%). Różnicowanie pomiędzy zapaleniem na tle infekcyjnym i nie infekcyjnym w znacznym stopniu zależy od wieku noworodków. Najwyższą czułość i swoistość oznaczeń uzyskuje się po pierwszych 48 godzinach po urodzeniu. Podobnie jak u osób dorosłych wzrost PCT u noworodków także wiąże się z zapaleniami na tle nie infekcyjnym (zespól niewydolności oddechowej noworodków).

VII. Inne biomarkery sepsy

Z innych wykładników odpowiedzi immunologicznej których poziom w surowicy ulega zmianom w przebiegu sepsy wymienić można fibronektynę, rozpuszczalne postacie receptorów leukocytów, tj. sCD163, sTREM-1, składniki dopełniacza C3a i 5a, niektóre czynniki transkrypcyjne (np. NF-κB), receptory komórkowe dla cytokin w formie rozpuszczalnej, czynniki aktywujące endotelium i inne. Ich poziom w sepsie koreluje często z wyżej wymienionymi biomarkerami. Zastosowanie tych wykładników odpowiedzi immunologicznej jako biomarkerów sepsy jest ograniczone i nie wychodzi poza zakres eksperymentu.

VIII. Receptory komórkowe leukocytów jako biomarkery sepsy

W różnych postaciach zakażenia włącznie ze stanem septycznym leukocyty najszybciej wchodzą w kontakt z czynnikami infekcyjnymi. Dotyczy to zarówno monocytów i granulocytów krwi obwodowej jak i makrofagów tkankowych. Wykorzystując techniki immunofluorescencji w połączeniu z cytometrią przepływową można ocenić stan aktywacji tych komórek poprzez określenie ekspresji ich niektórych receptorów błonowych.

Zmiany w zakresie ekspresji markerów błonowych granulocytów i monocytów krwi obwodowej w przebiegu reakcji septycznej zależą w znacznym stopniu od działania cytokin pro-zapalnych , tj. IFN-gamma, TNF-alfa, IL-1, G-CSF i GM-CSF oraz przeciw-zapalnych, tj. IL-10, TGF-beta, oraz prostglandyn E2 (PGE2). Pierwsza faza reakcji septycznej, tj. uogólniona reakcja prozapalna (SIRS-systemic inflammatory response syndrome) zależy od działania cytokin pro-zapalnych. Druga jej faza , tzw CARS (compensatory anti-inflammatory response syndrome) zależy od dzialania czynników przeciw-zapalnych

Ponieważ granulocyty i monocyty są komórkami naturalnego układu odpornościowego, najszybciej odpowiadającego na czynniki infekcyjne, to w przebiegu sepsy komórki te ulegają aktywacji już w kilka godzin po zakażeniu, co można stwierdzić poprzez zmiany ekspresji niektórych markerów błonowych granulocytów (CD64 i TREM-1) i monocytów (HLA-DR, CD163) .

Poniżej przedstawiono ich krótki opis w odniesieniu do znaczenia tych receptorów jako wczesnych markerów sepsy.

Receptor CD64

Receptor CD64 wiąże fragment Fc immunoglobuliny IgG (receptor dla fragmentu Fc IgG typu I). Wykazuje b. niski poziom ekspresji na granulocytach krwi obwodowej osób zdrowych, jednak jego ekspresja gwałtownie wzrasta w trakcie infekcji, przede wszystkim pod wpływem działania cytokin prozapalnych (IFN-gamma, IL-12 oraz G-CSF). Ekspresja tego markera po aktywacji charakteryzuje się: a) szybkim wzrostem (już po 3-4 godzinach stymulacji przez czynniki prozapalne), b) stosunkowo stabilną ekspresją (utrzymującą się do 30 godzin po pobraniu próbki krwi, przechowywanej w temp, pokojowej lub nawet do 72 godzin w przypadku przechowywania próbki w 4 C), c) pomiar ekspresji CD64 jest prosty i szybki (ok. 1 godziny, wymagane 50 ul krwi), d) wzrost ekspresji CD64 koreluje z postacią i ciężkością zakażenia, e) wzrost ekspresji CD64 nie zależy od innych wykładników zakażenia takich jak leukocytoza, skład odsetkowy populacji krwinek białych („rozmaz”), stała sedymentacji erytrocytów, poziom białka C-reaktywnego; stanowi więc dodatkowy wykładnik infekcji, e) wiek pacjentów oraz ewentualne leczenie immunosupresyjne nie wpływają na ekspresję CD64, f) ekspresja CD64 granulocytów nie wzrasta u pacjentów z białaczką szpikową, zespołem mielodysplastycznym, anemią megaloblastyczną, w przebiegu ciąży oraz po leczeniu sterydami; wzrost ekspresji CD64 granulocytów jest więc związany z infekcją. Wymienione cechy ekspresji CD64 granulocytów czynią ten marker cennym wykładnikiem laboratoryjnym infekcji. Komercyjnie dostępne zestawy immunofluorescencyjne, przystosowane do wykonania pomiarów techniką cytometrii przepływowej (np. Trillium Diagnostic Luko 64), umożliwiają wykorzystanie tej techniki do ilościowej oceny ekspresji CD64 w populacji zarówno granulocytów jak i monocytów.

Receptor TREM-1.

Receptor TREM-1 (triggering receptor expressed on myeloid cells) jest glikoproteiną (o m.cz. 30 k-Da), należącą do nadrodziny immunoglobulin. Ekspresję tego receptora wykazują granulocyty krwi obwodowej, monocyty i makrofagi (z wysoką ekspresja receptora CD14). Szczególne znaczenie ma ten receptor w populacji makrofagów pęcherzyków płucnych, wyspecjalizowanych w usuwaniu drobnoustrojów, komórek apoptotycznych oraz makrocząsteczek. Wzrost ekspresji TREM-1 związany jest z odpowiedzią układu komórek odporności naturalnej (granulocyty , monocyty, makrofagi i komórki NK) na infekcje, wywołane przez bakterie Gram dodatnie i Gram ujemne oraz grzyby. Przeciwnie, TREM-1 wykazuje obniżona ekspresję w nacieku komórkowym w przypadku infekcji wywołanych przez Mycobacterium tuberculosis, a także w sarcoidozie . Nie wiadomo jakie struktury drobnoustrojów rozpoznaje TREM-1. Liganda dla tego receptora nie jest bowiem znana. Aktywacja granulocytów i makrofagów in vitro via receptor TREM-1 (poprzez interakcję z przeciwciałem monoklonalnym anty-TREM-1) powoduje syntezę przez te komórki szeregu białek prozapalnych takich jak IL-8, oraz MCP-1, MCP-3 (białka chemotaktyczne monocytów), prozapalne białko-1 alfa makrofagów, a także TNF-alfa i IL-1. Aktywacja komórek via receptor TREM-1 w obecności LPS jako kostymulatora szczególnie silnie indukuje reakcje prozapalne, co wskazuje na udział przynajmniej niektórych ligand receptorów Toll w aktywacji monocytów i granulocytów via receptor TREM-1. LPS oraz inne bakteryjne ligandy receptorów Toll wzmagają ekspresję receptora TREM-1 granulocytów i monocytów [14]. Wzrost ekspresji receptora TREM-1 związany jest więc z odpowiedzią na różne czynniki infekcyjne. Obecnie uważa się, że pomiar ekspresji tego receptora w populacji granulocytów i monocytów krwi obwodowej jest przydatnym markerem dla oceny przebiegu zakażeń. Zakres ekspresji TREM-1 koreluje z ciężkością infekcji, zwłaszcza indukowanych przez LPS bakterii Gram ujemnych .

Obecnie komercyjnie dostępne p. ciala monoklonalne anty-TREM-1 (f-my RD System) pozwalają ocenić ekspresję receptorów TREM-1, przy zastosowaniu techniki immunofluorescencji i cytometrii przepływowej. W przeciwieństwie do receptora CD64 receptor TREM-1 wykazuje mniej stabilną ekspresję. Uważa się jednak, że poziom ekspresji TREM-1 na granulocytach i monocytach jest przydatnym markerem dla oceny przebiegu zakażeń, ponieważ ilustruje udział tych komórek w reakcjach odpornościowych na czynnik infekcyjny.

Receptor CD163

Receptor CD163 należy do rodziny receptorów „wymiataczy” (scavenger receptors), wiążących kompleks haptoglobiny i hemoglobiny w trakcie hemolizy eryrocytów i ich fagocytozy przez makrofagi i monocyty. Szczególnie wysoką ekspresję tego receptora wykazują monocyty/makrofagi o fenotypie CD14^bright/CD16.

Komórki te pełnią ważną rolę w wygaszaniu prozapalnej odpowiedzi immunologicznej. Zależna od receptora CD163 endocytoza kompleksu haptoglobina/hemoglobina powoduje degradację ligandy białkowej (haptoglobiny) i metabolizowanie hemu w cytozolu przez hemooksygenazę-1. Proces ten wpływa hamująco na reakcję zapalną poprzez indukcję (via CD163) syntezy cytokin o działaniu przeciw-zapalnym oraz wzmaganie reaktywności przeciw-zapalnych makrofagów przez metabolity hemu.

Receptor CD163 występuje w formie związanej z błoną komórkową oraz w formie rozpuszczalnej (sCD163), obecnej w surowicy. Istnieje odwrotna korelacja pomiędzy poziomem sCD163, a receptorem CD163 związanym z błoną komórkową. Wzrost poziomu sCD163 w surowicy związany jest z działaniem cytokin prozapalnych (IFN-gamma, TNF-alfa, IL-1), a także LPS, które także obniżają poziom ekspresji błonowego CD163. Przeciwnie, cytokiny p. zapalne takie jak IL-10 czy TGF-beta, a także IL-6 wzmagają ekspresję formy błonowej CD163, a obniżają poziom sCD163.

Uważa się, że zwłaszcza poziom sCD163 w surowicy jest ważnym wykładnikiem diagnostycznym reakcji zapalnej z udziałem makrofagów. Sugeruje się jednoczesne badanie poziomu ekspresji zarówno sCD163 jak i błonowej formy tego receptora.

Dostępność p.ciał monoklonalnych swoistych dla CD163 umożliwia ocenę ekspresji formy błonowej tego receptora (technika cytometrii przepływowej) jak i formy sCD163 (technika ELISA).

Anergizacja makrofagów/monocytów w przebiegu sepsy może zależeć w znacznym stopniu od nadmiaru sCD163, przy jednocześnie obniżonej ekspresji formy błonowej tego receptora (reakcja prozapalna, z nadmiarem prozapalnych cytokin i niektórych czynników zjadliwości drobnoustrojów, takich jak LPS).

Antygen HLA-DR

Poziom ekspresji tego antygenu w znacznym stopniu zależy od stanu aktywacji komórek, wykazujacych jego ekspresję (monocyty, makrofagi, komorki dentrytyczne, limfocyty B, niektóre populacje aktywowanych komórek T oraz indukowane przez cytokiny komórki endotelium).

Dla monitorowania przebiegu reakcji septycznych stosuje się oznaczanie ekspresji HLA-DR w populacji monocytów krwi obwodowej. Niektóre populacje monocytów różnią się w zakresie ekspresji tego markera.

Wiele badań wskazuje, ze istnieje odwrotna korelacja pomiędzy poziomem ekspresji HLA-DR w monocytach krwi obwodowej, a stopniem infekcji uogólnionej (sepsa, wstrzas septyczny). Wynika to z zakresu anergizacji monocytów/makrofagów w trakcie infekcji.

Pomimo bowiem znacznej syntezy cytokin prozapalnych takich jak IFN-gamma, TNF-alfa czy IL-12, które w przypadku lokalnej infekcji indukują wzrost ekspresji HLA-DR na tych komórkach (co wiąże się z eliminacją antygenu), to ciężkie zakażenie powoduje: a) silną apoptozę monocytów i makrofagów, b) ich silną anergizację wskutek nadmiernej indukcji przeciw-zapalnych cytokin, pojawiajacych się w drugiej fazie reakcji septycznej. Chodzi tu przede wszystkim o IL-10 oraz TGF-beta i IL-13, które znaczaco obniżają poziom ekspresji HLA-DR i innych receptorów o funkcji kostymulacyjnej monocytów krwi obwodowej.

Obserwacje wiążące niską ekspresję HLA-DR monocytów z podwyższonym poziomem IL-10 w surowicy w ciężkich infekcjach potwierdzają przydatność określania ekspresji HLA-DR w populacji monocytów.

Badanie wykonuje się techniką cytometrii przepływowej, oceniając odsetek monocytów wykazujacych ekspresje HLA-DR oraz intensywność fluorescencji (tj. średnią ilość czasteczek HLA-DR/komórkę).

VIII. Znaczenie kortykosterydów w terapii stanu septycznego

Masywny, ogólnoustrojowy odczyn pro-zapalny w reakcjach septycznych wymaga postępowania przeciw-zapalnego. Stosowanie kortykosterydów w sepsie budzi szereg wątpliwowści i obaw z powodu ich działania osłabiającego anty-bakteryjne i anty-wirusowe reakcje odpornościowe. Z drugiej strony działanie sterydów jako fizjologicznych mediatorów łagodzących ogólnoustrojową reakcję stresową (zaawansowaną w stanach septycznych) byłoby wskazane, zwłaszcza w przypadkach niewydolności nadnerczy, często występującą w sepsie. Poniżej krótko przedstawiono działania hormonów sterydowych w powiązaniu z ich zastosowaniem w terapii stanów septycznuych.

1. Podstawowe właściwości fizjologiczne i mechanizm działania glukokortykosterydów.

W części rdzennej nadnerczy produkowane są hormony układu współczulnego (adrenalina i nor-adrenalina). W części korowej zewnętrznej (zona glomerulosa) tego narządu produkowany jest szereg hormonów regulujących funkcje gospodarki mineralnej (mineralo-kortykosterydy, głównie aldosteron i w mniejszym zakresie kortykosteron); w głębszej części kory (zona reticularis) produkowany są słabe androgeny (dehydrepiandrosteron, siarczan dehydropiandrosteronu, Δ₄- androstenedion, oraz 11β-hydroksyandrostenedion).

Glukokortykosterydy (kortyzol i kortyzon) produkowane są w części korowej głębokiej nadnerczy (zona fasciculata). Kortyzol jest produktem enzymatycznej konwersji cholesterolu. Występuje w surowicy w postaci wolnej, aktywnej (5-20% kortyzolu calkowitego) i w postaci nie aktywnej, odwracalnie związanej z białkami osocza, tj. globuliną wiażącą kortyzol (CBG) oraz albuminą. Kortyzol z racji swej lipofilnej natury wchodzi do wnętrza komórki drogą transportu biernego i wiąże się w cytozolu z rozpuszczalnym receptorem dla kortyzolu (receptor w formie nieczynnej związany jest z białkiem szoku cieplnego -hsp 90). Natępnie kompleks receptor/kortyzol przechodzi do jądra komórkowego, gdzie wchodzi w interakcję ze swoistymi miejscami wiążącymi w łańcuchu DNA, co powoduje zarówno hamowanie jak i pobudzanie transkrypcji wielu genów. Kortyzol zaangażowany jest w aktywacji lub hamowaniu ekspresji ponad 2000 genów zaangażowanych w regulacji odpowiedzi immunologicznej.

2. Regulacja syntezy glukortykosterydów.

Synteza glukortykosterydów regulowana jest na osi podwzgórze-przysadka-nadnercza. Produkcja i sekrecja kortyzolu zachodzi poprzez stymulujące działanie ACTH (hormon adrenokortykotropowy przysadki). ACTH jest peptydem (39 aminokwasów), uwalnianym na drodze proteolizy z jego prekursora tj. pro-opiomelanokortyny, z którego pochodzą także inne hormonalnie czynne peptydy: β-endorfina, lipotropina i melanotropina. ACTH stymuluje syntezę i sekrecję kortyzolu (w warunkach niskiego poziomu kortyzolu w komórkach kory nadnercza) oraz aktywuje syntezę enzymów koniecznych dla syntezy kortyzolu oraz ich kofaktorów, jak również receptorów dla cholesterolu obecnego w niskocząsteczkowej frakcji lipoprotein; ACTH indukuje także syntezę androgenów nadnerczowych oraz (w mniejszym zakresie) mineralokortykoidów.

Okres półtrwania ACTH jest krótki, a jego działanie bardzo szybkie, na co wskazuje gwałtowny wzrost koncentracji kortyzolu w naczyniach żylnych nadnercza już w kilka minut po sekrecji ACTH. Stymulatorami ACTH są hormony podwzgórza, tj. CRH (kortykotropina) oraz wazopresyna (AVH). Wazopresyna jest stosunkowo słabym stymulatorem ACTH lecz silnie indukuje CRH. Do induktorów ACTH należą także katecholoaminy, tj. angiotensyna II, serotonina, wazoaktywne peptydy jelitowe, cytokiny pro-zapalne (IL-1, IL-2, IL-6, TNF-alfa); działanie hamujące wywiera natomiast TGF-beta.

CRH - induktor ACTH -jest peptydem (41 aminokwasów) produkowanym w podwzgórzu. Stymuluje syntezę białka prekursorowego, tj. pro-opiomelanokortyny. Wiele czynników wpływa sekrecję CRH. Działanie stymulujące wywiera noradrenalina i serotonina, natomiast substancja P, opioidy, kwas γ-aminobutyrylowy hamują uwalnianie CRH. Cytokiny prozapalne (IL-1, IL-2, IL-6 oraz TNF-alfa) także wpływają na poziom sekrecji CRH (generalnie wzmagając produkcję tego hormonu).

Glukokortykosterydy wywierają działanie hamujące na oś przysadka-podwzgórze, blokując produkcję ACTH, transkrypcję mRNA propio-opiomelenokortyny oraz syntezę CRH i AVH.

Sekrecja hormonów osi podwzgórze-przysadka (ACTH, CRH oraz AVP) odbywa się w rytmie pulsacyjnym i podlega regulacji dobowej. Amplituda rytmu wydzielniczego zmienia się w ciągu doby, osiągając najwyższy poziom w godzinach rannych, gwałtownie obniżając się do południa i stopniowo dalej zmniejszając się aż do północy.

3. Działania glukokortykosterydów:

Glukokortykosterydy wywierają działania metaboliczne oraz przeciw-zapalne. Działania metaboliczne obejmują:

•Regulację metabolizmu glukozy poprzez stymulację glukogenezy i glikogenolizy wątrobowej; wzmaganie aktywności innych hormonów zaangażowanych w procesie glukogenezy (głównie glukagonu i adrenaliny); hamowanie zużywania glukozy przez komórki poprzez zmniejszanie ekspresji receptora dla insuliny (obwodowa oporność na insulinę). Konsekwencją tych aktywności jest wzrost poziomu glukozy we krwi. Regulację metabolizmu lipidów głównie poprzez działanie lipo-lityczne oraz blokowanie zużywania glukozy przez adipocyty.

•Regulację metabolizmu białek głównie poprzez blokowanie ich syntezy oraz wzmaganie proteolizy w mięśniach i uwalnianie aminokwasów, które stanowią substrat dla glukogenezy.

•Regulację gospodarki mineralnej głównie poprzez wpływ na mineralizację tkanki kostnej (aktywacja osteoklastów, przy jednoczesnym hamowaniu procesu odnowy tkanki kostnej -blokowanie proliferacji osteoblastów), zmniejszanie wchłaniania jelitowego wapnia i wzrost jego wydalania przez nerki.

Działania przeciw-zapalne i regulujące reakcje odpornościowe obejmują szereg aktywności, które zależą od interakcji glukokortykosterydów z ich receptorami komórkowymi, obecnymi w błonie komórkowej komórek układu odpornościowego. Wiele immunoregulujących i przeciw-zapalnych działań kortykosterydów opisanych w warunkach in vitro nie ma swojego odpowiednika w warunkach klinicznych.

Działanie przeciw-zapalne kortykosterydów w warunkach klinicznych uzyskuje się stosując te hormony w dawkach supra-fizjologicznych. Glukokortykosterydy wywierają działanie przeciw-zapalne poprzez ich wpływ na dystrybucję i funkcję wielu komórek układu odpornościowego, tj. limfocytów T , B, komórek NK (naturalne komórki cytotoksyczne), monocytów, makrofagów, eozynofilów, neutrofilów, komórek tucznych, oraz bazofilów.

Podanie glukortykosterydów powoduje limfopenię, wywołaną wzmożonym przechodzeniem obwodowych limfocytów do narządów limfoidalnych (śledziona, utkanie chłonne jelit, węzły chłonne obwodowe, wątroba). Jednocześnie dochodzi do granulocytozy z powodu wzrostu puli krążących granulocytów i zahamowaniem ich migracji do tkanek (głównie z powodu zahamowania syntezy chemokin o działaniu chemotaktycznym). Zjawisko to przyczynia się w znacznej mierze do przeciw-zapalnego działania glukokortykosterydów (zarówno lokalnego jak i ogólnoustrojowego). Glukokortykosterydy powodują też zahamowanie aktywności sekrecyjnej makrofagów, zwiększają apoptozę eozynofilów i monocytów (zwłaszcza pro-zapalnej populacji tych komórek o fenotypie CD14/CD16).

Glukokortykosterydy wpływają na syntezę wielu cytokin o działaniu pro i przeciw-zapalnym. Generalnie blokują syntezę pro-zapalnych cytokin produkowanych przez limfocyty T (IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IFN-gamma, GM-CSF), monocyty i makrofagi (IL-1, TNF-alfa, IL-6, IL-8 oraz IL-12). Hamują także syntezę chemokin, eikozanoidów, bradykininy oraz czynnika hamującego migrację makrofagów. Jednocześnie wzmagają syntezę czynników przeciw-zapalnych takich jak IL-1Ra, TNF-Rs, IL-10 oraz TGF-beta. Działanie przeciw-zapalne kortykosterydów zależy także od hamowania syntezy enzymów zapalenia takich jak cyclo-oksygenaza-2 (COX-2) czy też indukowana syntetaza tlenku azotu (NO), oraz wzmagania syntezy lipokortyny-1, co powoduje blokowanie produkcji leukotrienów i fosfolipazy A₂, enzymu indukującego przemianę kwasu arachidonowego. Ważnym elementem przeciw-zapalnego działania kortykosterydów jest blokowanie ekspresji niektórych komórkowych receptorów błonowych, istotnych dla działania pro-zapalnego, tj. receptora CD14 monocytów i makrofagów (receptor dla LPS), a także wielu innych receptorów zarówno endotelium naczyniowego jak i leukocytów (ICAM-1, 2, LFA-1, CD2, etc), co powoduje zmniejszanie migracji pro-zapalnych komórek do tkanek objętych zapaleniem. Zwiększanie wrażliwości na apoptozę eozynofilów, pro-zapalnych monocytów oraz dojrzałych limfocytów T także przyczynia się do przeciw-zapalnego dzialania kortykosterydów.

4. Glukokortykosterydy w reakcji stresowej.

Masywne zakażenie jakim jest stan septyczny wiąże się z uruchomieniem mechanizmów reakcji stresowej, w trakcie której dochodzi do szybkiego uwalniania ACTH, spadku poziomu CBG i wzrostu poziomu wolnego kortyzolu we krwi. Elastaza granulocytów także miejscowo wzmaga poziom wolnego kortyzolu poprzez rozbicie jego wiązania z CBG (globulina wiążąca kortyzol). Cytokiny wzmagają wiązanie glukortykosterydów z ich receptorami komórkowymi. W czasie reakcji stresowej zmienia się profil syntezy minerakokortykoidów nadnercza (spadek produkcji aldosteronu, wzrost poziomu reniny). Kliniczne znaczenie tego zjawiska nie jest znane, a stosowanie mineralokortykosterydów w leczeniu sepsy pozostaje kontrowersyjne. Zmiany te spowodowane są zaburzeniami dobowego rytmu sekrecji kortyzolu, wywołane poprzez wzrost produkcji CRH oraz ACTH (indukcja przez cytokiny) i słabe hamowanie zwrotne przez kortyzol.

Wzrost poziomu glukokortykosterydow w reakcji stresowej umożliwia zachowanie prawidłowej homeostazy, której utrzymywanie zależy od regulującego działania kortykosterydów, tj. aktywności metabolicznych, krążeniowych i przeciw-zapalnych. Działania metaboliczne obejmują hyperglikemię, co zapewnia odpowiedni poziom glukozy w okresie zwiększonego zapotrzebowania i jej przechodzenie do komórek niezależnych od insuliny, tj centralnego układu nerwowego i komórek zapalenia. Działania krążeniowe polegają na utrzymywaniu reaktywności receptorów naczyniowo-ruchowych. Działania przeciw-zapalne umożliwiają blokowanie nieomal każdego etapu kaskadowych reakcji pro-zapalnych. Wszystkie te trzy mechanizmy integrują reakcję adaptacyjną na stres.

W czasie trwania sepsy (lub innych, zlokalizowanych reakcji zapalnych) działanie pro-zapalnych cytokin (TNF-alfa, IL-1, IL-6) indukuje oś podwzgórze- przysadka do produkcji CRH i ACTH, co powoduje wzrost produkcji kortyzolu przez nadnercza. Obecność kortyzolu łagodzi przebieg reakcji pro-zapalnych, a jednocześnie wywołuje negatywne sprzężenie zwrotne osi, co pozwala na odpowiednią regulację syntezy glukortykosterydów w okresie ich wzmożonych aktywności metabolicznych i immunosupresyjnych. Przedłużająca się stymulacja osi podwzgórze-przysadka przez cytokiny, zwłaszcza TNF-alfa i IL-6 zmienia jej profil reaktywności, co manifestuje się spadkiem poziomu ACTH u pacjentów z sepsą lub SIRS. Utrzymujący się wzrost poziomu TNF-alfa jak i IL-6 zmniejszają także reaktywność nadnerczy na działanie ACTH, a także wpływa hamująco na stymulujące działanie CRH, co zmniejsza syntezę ACTH.

Przyjmuje się, że „normalny” poziom kortyzolu w reakcji stresowej, uzyskany po aktywacji przez egzogenny ACTH lub podaniu insuliny (hipoglikemia) wynosi u osób zdrowych około 15-20 ug/dl. W warunkach infekcji wartości szczytowe poziomu kortyzolu korelują z ciężkością zakażenia. Wzrost poziomu kortyzolu jest niezależnym wskaznikiem predykcyjnym, tj. znamiennie wyższe wartości obserwuje się w grupie chorych nie przeżywających, co wskazuje na silną aktywację osi podwzgórze-przysadka.

Wzrost poziomu kortyzolu w reakcji stresowej nie jest wielkością stałą, tzn. nie wiadomo jaki zakres wzrostu może być uznany za prawidłowy. Zdolność nadnerczy do produkcji kortyzolu jest wykładnikiem wydolności hormonalnej nadnerczy i prawidłowości funkcjonowania osi podwzgorze-przysadka-nadnercza. Dla oceny wydolności nadnerczy stosuje się test z ACTH, dzięki któremu można określić efektywność interakcji ACTH z komórkami nadnercza i ich zdolność do syntezy kortyzolu; wzrost poziomu kortyzolu w surowicy o 9ug/dl lub więcej od wartości wyjściowej uznaje się za „prawidłowy”

5. Zastosowanie glukokortykosterydów w leczeniu sepsy.

Przeciw zapalne działanie glukokortykosterydów w reakcji stresowej skłoniło do ich użycia w leczeniu sepsy. Zatosowanie sterydów w wysokich dawkach nie przyniosło jednak pomyślnych rezultatów ani w zakresie skrócenia jej przebiegu ani złagodzenia objawów. Prospektywna analiza wielu randomizowanych badań klinicznych przeprowadzona w latach 90-tych wskazywała na brak znaczącego wpływu zarówno w odniesieniu do śmiertelności jak i wyników leczenia stanów septycznych.

Koncepcja przejściowej niewydolności nadnerczy jako czynnika zaostrzającego przebieg sepsy skłoniła jednak do ponownego rozpatrzenia możliwości użycia glukortykosterydów w terapii sepsy. Niewydolność nadnerczy w sepsie spowodowana jest zmianami w zakresie reaktywnośći osi podwzgórze -przysadka. Zależą one od: a) zmian patologicznych osi, nakładających się na stan septyczny, b) stosowania leków inaktywujących enzymy konieczne dla syntezy kortyzolu (np. ketokenazolu) lub zwiększających metabolizm kortyzolu (fenytoina, fenobarbital), c) zmian krwotocznych lub martwicy nadnerczy (30% przypadków zgonów z powodu sepsy).

Częstość występowania niewydolności nadnerczy w sepsie, określana na podstawie niskiego poziomu kortyzolu, jest bardzo różna w wielu badaniach, głównie z powodu przyjmowania różnych wartości koncentracji progowych. Dysfunkcja osi nadnercza-przysadka podwzgórze w sepsie i innych ciężkich schorzeniach (przewlekła reakcja stresowa) zależy od kombinacji dwóch mechanizmów tj. •niewydolności nadnerczy oraz •oporności obwodowej na glukokortykosterydy.

•Niewydolność nadnerczy występuje u około 50% osób z szokiem septycznym i manifestuje się najczęściej jako przejściowa niewydolność nadnerczy, ustępująca wraz z ustąpieniem choroby podstawowej. Przejściową niewydolność nadnerczy definiuje się jako osłabioną zdolność nadnerczy do odpowiedzi na egzogenny ACTH, manifestującą się tylko niewielkim (do 9 ug/dl) wzrostem kortyzolu, w odniesieniu do podstawowego, (wysokiego) poziomu kortyzolu w surowicy. Natomiast niewydolność nadnerczy utrwalona manifestuje się niskim poziomem kortyzolu w surowicy (poniżej 20 ug/dl). Niewydolność nadnerczy w sepsie jest czynnikiem znacznie zwiększającym śmiertelność.

•Oporność tkanek na działanie glukokortykoidów może być również jedną z przyczyn nadmiernej reaktywność ustroju na czynniki pro-zapalne (infekcyjne i nie infekcyjne). Mechanizmy oporności obwodowej na glukokortykosterydy obejmują: a) ograniczony dostęp kortyzolu do miejsc objętych zapaleniem (z powodu spadku poziomu CBG), b) zmniejszanie lokalnego poziomu kortyzolu (słaba hydroliza kompleksu CBG/kortyzol z powodu niskiej aktywności elastazy granulocytów), c) redukcję liczby i powinowactwa komórkowych receptorów glukokortykoidów, d) wzrost konwersji kortyzolu w postać nie aktywną (kortyzon), wskutek zwiększania aktywności 11-beta-hydroksy-dehydrogenazy, indukowanej przez cytokiny (IL-2, IL-4, IL-13). Wymienione mechanizmy powodują spadek aktywności glukokortykoidów na poziomie tkankowym, przy prawidłowym poziomie kortyzolu w surowicy.

6. Efekt stosowania kortykosterydów w niskich dawkach u pacjentów septycznych

Stosowanie hydrokortyzonu w niskich dawkach (250-300 mg/dobę) przrez 5 dni u pacjentów septycznych wywołuje szereg działań o charakterze przeciw-zapalnym, charakteryzujących się: spadkiem temperatury ciała, zwolnieniem akcji serca, zmniejszeniem produkcji mediatorów zapalenia (fosfolipazy A2, białka C-reaktywnego, cytokin pro-zapalnych, rozpuszczalnych adhezyn) i wzrostem poziomu cytokin przeciw-zapalnych.

Stosowanie kortykoterapii w niskich dawkach u pacjentów septycznych wpływa także na układ sercowo naczyniowy, powodując poprawę warunków hemodynamicznych, tj. zwiększenie reaktywności naczyń na leki wazopresyjne (katecholaminy), wzrost ciśnienia tętniczego i oporu naczyniowego, zwolnienie akcji serca oraz zwiększenie pojemności wyrzutowej serca.

Mechanizm działania glukokortykosterydów na układ naczyniowo-sercowy jest złożony i obejmuje: a) hamowanie syntezy tlenku azotu (NO), działającego jako silny wazodilatator, b) zwiększanie ekspresji receptorów katecholamin w ścianie naczyniowej, c) hamowanie lokalnej produkcji czynników zapalnych.

Niewydolność nadnerczy może przyczyniać się do pogłębiania zaburzeń hemodynamicznych i nasilać odpowiedz pro-zapalną u pacjentów septycznych. Szereg objawów może sugerować niewydolność nadnerczy w przebiegu sepsy. Należą do nich: niestabilność hemodynamiczna, konieczność stosowania katecholamin pomimo opanowania infekcji, hipoglikemia lub eozynofilia, oraz podstawowy poziom kortyzolu w granicach 15 ug/dl lub mniejszy.

W przypadku poziomu kortyzolu powyżej 15 ug/dl (przy wyżej wymienionych objawach) należy wykonać test stymulacyjny z ACTH dla wykluczenia niewydolności nadnerczy: wzrost w zakresie do 9 ug/dl powyżej poziomu podstawowego wskazuje na niewydolność; natomiast wzrost poziomu kortyzolu powyżej 9 ug/dl przy koncentracji podstawowej > 34 ug/dl wskazuje na oporność tkankową na glukokortykoidy.

Niewydolność nadnerczy wymaga szybkiego wprowadzenia terapii substytucyjnej, tj. włączenie kortykoterapii w niskiej dawce (hydrokortyzon 200-300 mg/dobę), w połączeniu z 9 alfa fludrokortyzonem (50 ug/dobę) przez 7 dni, co pozwala na skrócenie czasu trwania sepsy, poprawę warunków hemodynamicznych i wzrost wrażliwości ściany naczyniowej na dzialanie leków wazopresyjnych.

PODSUMOWANIE

Przedstawione opracowanie dotyczy: a) charakterystyki podstawowych mechanizmów immunologicznych zaangażowanych w patogenezie sepsy (udział monocytów, makrofagów, granulocytów, różnych białek odpowiedzi ostrej fazy, dopełniacza, receptorów komórkowych monocytów i granulocytów, oraz cytokin i prokalcytoniny), b) wykorzystania niektórych czynników pro-zapalnych uwalnianych w wyniku zakażenia jako biomarkerów sepsy (niektóre receptory błonowe granulocytów i monocytów, cytokiny, białka ostrej fazy), c) znaczenie kortykoterapii w leczeniu sepsy (podstawowe mechanizmy działania glukokortykosterydów, ich znaczenie w regulacji reakcji stresowej jakim jest stan septyczny, przesłanki skłaniające do użycia glukokortykosterydów w niskiej dawce w leczeniu sepsy.

Dokonany w niniejszym opracowaniu przegląd mechanizmów patogenetycznych sepsy, najważniejszych biomarkerów stanu septycznego i przesłanek stosowania sterydów w niskiej jako leków wyrównujących niewydolność nadnerczy w stanie septycznym, miał na celu zwrócenie uwagi na powiązanie mechanizmów patogenetycznych zakażenia uogólnionego z postępowaniem diagnostycznym i terapeutycznym.

Szybki rozwój technik immunologicznych rokuje rychłe wykrycie nowych biomarkerów wczesnego wykrywania sepsy. Jednym z takich markerów jest receptor CD64 granulocytów, którego wysoka ekspresja wskazuje na aktywację granulocytów przez czynniki infekcyjne. Identyfikacja subpopulacji monocytów pro-zapalnych, wrażliwych na działanie kortykosterydów jest kolejnym tego typu przykładem. Natomiast określanie poziomu cytokin prozapalnych i innych mediatorów zapalenia w surowicy jest mało przydatne w diagnostyce sepsy z powodu niskiej swoistości tych oznaczeń, problemów technicznych, wysokich kosztów oraz czasokresu wykonywania oznaczeń.

Szczególne znaczenie ma nowe podejście do terapii sepsy z użyciem kortykosterydów. Początkowe obawy co do ich immunosupresyjnego działania i w związku z tym pogłębienia niewydolności układu odpornościowego w sepsie ustąpiły poglądowi, że kortykoterapia w niskiej dawce może być przydatna w leczeniu sepsy, zwłaszcza w przypadkach niewydolności nadnerczy, często występującej w sepsie o ciężkim przebiegu. Identyfikacja monocytów pro-zapalnych, wrażliwych na działanie sterydów, może być jednym ze wskazań użycia tej terapii u pacjentów septycznych.

Złożone mechanizmy patogenetyczne sepsy, zróżnicowany przebieg kliniczny, częste trudności diagnostyczne i terapeutyczne oraz coraz szersze możliwości użycia niektórych markerów zapalenia jako wykładników diagnostycznych i prognostycznych, wskazują na konieczność diagnostyki i leczenia sepsy w wysoko specjalistycznych ośrodkach, dysponujących odpowiednią bazą kliniczną i badawczą (identyfikacja czynników infekcyjnych technikami mikrobiologicznymi i molekularnymi, użycie technik immunologicznych dla oceny poziomu ekspresji wybranych biomarkerów zapalenia). Umożliwia to szybką diagnostykę i leczenie sepsy (wdrożenie leczenia przeciw-bakteryjnego) od czego zależy prognoza dotycząca życia pacjenta.

Literatura:

1. Balk R: Severe sepsis and septic shock. Crit. Care Clin, 16: 179-192, 2000.

2. Martin GS, Mannino GM, Eaton S, Moss M: The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000. N.Engl.J.Med. 348(16): 1546-1554,2003.

3. Cursons R, Jeyerarajah E, Sleigh J: The use of plymerase chain reaction to detect septicaemia in critically ill patients. Crit.Care Med. 27: 937-940, 1999.

4. Reno WI, Mc Daniel D, Turner WJ: Polymerase chain reaction for the detection of bacteremia. Am.Surg. 67: 506-512, 2001.

5. Haveman JW., Muller Kobold AC, Tervaert JW., van den Berg AP, Tulleken JE, Kallenberg CG, ThE TH: The central role of monocytes in the pathogenesis of sepsis: conequences for immunomonitoring and treatment. Neth. J. Med. Sep; 55 (3):132-41, 1999.

6. Kox WJ, Volk T, Kox SN, Volk HD: Immunomodulatory therapies in sepsis. Intensive Care Med. 26, Suppl 1:S, 124-128, 2000.

7. Tschaikowsky K, Hedwig-Geissing M, Schiele A, Bremer F, Schywalsky M, Schuttler J: Concidence of pro- and anti-inflammatory responses in the early phase of severe sepsis: longitudinal study of mononuclear histocompatibility leucocyte antigen-DR expression, procalcitonin, C-reactive protein, and changes in T-cell subsets in septic and postoperative patients. Crit Care Med., May 30 (5): 1015-23, 2002.

8. Carrigan SD, Scott G, Tabrizian M: Toward resolving the challenges of sepsis diagnosis. Clin. Chemistry, 50:8, 1301-1314, 2004.

9. Davis BH.: Improved diagnostic approaches to infection/sepsis detection. Expert Rev.Mol.Diagn. 5(2), 193-207, 2005.

10. Lekkou A, Karakantza M, Mouzaki A, Kalfarentzos F, Gogos CA: Cytokine production and monocyte HLA-DR expression aqs predictors of outcome for patients with community acquired severe infections. Clin.Diagn.Lab.Immunol., 11, 1: 161-167, 2004.

11. Davis B: Quantitative neutrophil CD64 expression: promissing diagnostic indicator of infection or systemic acute inflammatory response. Clin.Immunol.Newslett. 16(9): 121-130, 1996

12. Qureshi SS, Lewis SM, Gant WA, Treacher D, Davis BH, Brown KA.: Increased distribution and expression of CD64 on blood polymorphonuclear cells from patients with the systemic inflammatory response syndrome (SIRS). Clin.Exp.Immunol. 2001, 125: 258-265.

13. Colonna M, Facchetti F: TREM-1 (triggering receptor expressed on myeloid cells): a new player in acute inflammatory responses. J.Infect.Dis. 187 (Suppl 2): S 397-401.

14. Radsak MP, Salih HR, Rammensee HG, Schild H.: Triggering receptor expressed on myeloid cells -1 in neutrophil inflammatory responses: differential regulation of activation and survival. J.Immunol. 172: 4956-4963, 2004.

15. Bouchon A, Dietrich J, Colonna M: Cutting edge: inflammatory responses can be triggered by TREM-1, a novel receptor expressed on neutrophils and monocytes. J. Immunol. 164: 4991-4995, 2000.

16. Bleharski JR, Kiessler V, Buonsanti C, Sieling PA, Stenger S, Colonna M, Modlin RL: A role for triggering receptor expressed on myeloid cells -1 in host defense during the early induced and adaptive phases of the immune response. J.Immunol. 170: 3812-3818, 2003.

17. Moestrup SK, Moller HJ: CD163: a regulated scavenger receptor with a role in the anti-inflammatory response. Ann.Med. 36(5):347-54, 2004.

18. Philipidis P, Mason JC, Evans BJ, Nadra I, Taylor KM, Haskard DO, Landis RC.: Hemoglobin scavenger receptor CD163 mediates interleukin-10 release and heme oxygenase-1 synthesis. Antiinflammatory monocyte-macrophage responses in vitro, in resolving skin blisters in vivo, and after cardiopulmonary bypass surgery. Cir Res. 94:119-126, 2004.

19.Pioli PA, Goonan KE, Wardwell K, Gurye PM.: TGF-beta regulation of

human macrophage scavenger receptor CD163 is Smad3-dependent. J.Leuk.Biol. 76(2): 500-8, 2004.

20. Davis BH, Zarev PV.: Human monocyte CD163 expression inversely correlates with soluble CD163 plasma levels. Cytometry B Clin. Cytom, 63(1): 16-22, 2005.

21. Monneret G, Finck ME, Venet F, Debard AL., Bohe J, Bienevenu J, Lepape A: The anti-inflammatory response dominates after septic shock: association of low monocyte HLA-DR expression and high interleukin-10 concentration. Immunol.Lett. 95(2):193-8, 2004.

22. Hynninen M, Pettila V, Takkunen O, Orko R, Jansson SE, Kuusela P, Renkonen R, Valtonen M. Predictive value of monocyte histocmpatibility leucocyte antigen-DR expression and plasma inyterleukin-4 and -10 levels in critically ill patients with sepsis. Shock, 20(1): 1-4, 2003.

23. Prignent H, Maxime V, Annaqne D: Clinical review: corticotherapy in

sepsis. Crtical Care, 8, 2, 122-129, 2004

30

---