Pomiar spektrofotometryczny

Kalorymetria jest działem analizy chemicznej, w którym podstawę ilościowego oznaczania substancji w roztworze stanowi zależność między absorbancją o określonej długości fali a stężeniem zawartej w nim substancji.

Absorbancja: jest to logarytm dziesiętny ze stosunku natężenia światła padającego do natężenia światła jakie przeszło przez roztwór.

log(I₀/I₁)

gdzie:

I₀- natężenie światła padającego

I₁- natężenie światła jakie przejdzie przez roztwór

Transmitancja: stosunek ilości światła, która przeszła przez badany roztwór, do ilości światła wchodzącej do roztworu (może być wyrażona w %). Może mieć wartości od 0 do 1 (czyli od 0% do 100%)

T=I₁/I₀

Zależność miedzy absorbancja a transmitancja:

A=2-log%T lub A=-logT

Podstawowe prawo w kalorymetrii: prawo Lamberta -Beera: absorbancja światła monochromatycznego jest wprost proporcjonalna do grubości warstwy i stężenia roztworu.

A= l*c*k

gdzie:

l- grubość warstwy

c- stężenie

k- współczynnik absorbancji

Współczynnik absorbancji każdej substancji barwnej ma charakterystyczną wartość stałą dla danej długości fali świetlnej. Miano i wartość liczbowa współczynnika absorbancji- k, zależą od jednostek stężenia i grubości warstwy absorbującej.

Jeżeli stężenie wyrażono w gramach na litr roztworu, a grubość warstwy absorbującej w centymetrach, to współczynnik k nosi nazwę właściwego współczynnika absorbancji- a. Liczbowo równa się on absorbancji roztworu o stężeniu 1g/l i grubości warstwy 1 cm.

Jeśli stężenie wyrażono w mol/l, jest to molowy współczynnik absorbancji- ε.

Liczbowo równa się on absorbancji roztworu 1molowego a grubości warstwy 1cm.

Z jego wartości można obliczyć stężenie substancji w mol/l ze wzoru:

c= A/(ε*l)

Inny sposób obliczenia stężenia z odczytanej absorbancji:

Obliczenie stężenia ze wzoru:

A próby badanej / A wzorca= c próby badanej / c wzorca

z którego:

c pb = (A pb / A w) * cw

My oznaczaliśmy spektrofotometrycznie stężenie białka w naszej próbie.

Oznaczanie zawartości białka metodą pomiaru absorbancji w nadfiolecie.

Większość białek wykazuje maksimum absorbancji przy 280 nm dzięki obecności aminokwasów aromatycznych: tyrozyny i tryptofanu. Na wartość absorbancji przy tej długości fali mogą wpływać związki wielkocząsteczkowe tj. kwasy nukleinowe. Ich maksimum pochłaniania występuje przy 260 nm.

Stężenie białka można obliczyć ze wzoru:

c= 1,55*A₂₈₀- 0,76*A₂₆₀

Wynik uzyskuje się w mg/ml.

Z tego też wzoru skorzystaliśmy przy obliczaniu stężenia naszego białka.

Metoda ta obarczona jest znacznym błędem wynikającym z tego, że zarówno różne białka, jak i kwasy nukleinowe, w jednakowych stężeniach nie dają identycznych wartości absorbancji maksymalnej. Poza tym wiele związków małocząsteczkowych (puryny, pirymidyny, fenole) wykazują dużą absorbancję przy 260 i 280nm.

Metoda nie nadaje się do oznaczania białka w mieszaninie zawierającej więcej niż 20% kwasów nukleinowych.