BIOTECHNOLOGIA W OCHRONIE ŚRODOWISKA

Ćwiczenie 1 : Bioremediacja gleb skażonych metalami ciężkimi

Bioremediacja - technologia usuwania zanieczyszczeń (głównie substancji ropopochodnych) z gleby i wód podziemnych za pomocą żywych mikroorganizmów w celu katalizowania, destrukcji lub transformacji różnego rodzaju zanieczyszczeń w formy mniej szkodliwe. W bioremediacji metali ciężkich z gleby wykorzystuje się naturalne zdolności mikroorganizmów do powierzchniowego wiązania metali przez polimery i makrocząsteczki występujące w osłonach komórkowych (biosorpcja) oraz wewnątrzkomórkowe wiązanie metali.

Wykorzystywane są mikroorganizmy występujące naturalnie w środowisku. Właściwości degradacyjne posiadają bakterie, grzyby i drożdże dla których naturalnym środowiskiem życia jest gleba. Posiadają one zdolności do wykorzystywania związków ropopochodnych jako jedynego źródła węgla w przemianach metabolicznych. Są to np. n-alkany, alkany rozgałęzione cykliczne alkany, węglowodory aromatyczne, policykliczne węglowodory aromatyczne. Mikroorganizmy degradują je zarówno w warunkach tlenowych jak i beztlenowych.

Cel ćwiczeń : Zastosowanie grzybów mikoryzowych do oczyszczania gleb skażonych ciężkimi metalami.

Analiza mikrobiologiczna i enzymatyczna badanych gleb:

1. Do 90 cm³ soli fizjologicznej dodajemy 10g gleby. Wytrząsamy przez 10 min. Po sedymentacji makrocząsteczek sporządzono kolejne rozcieńczenie pobierając po 1 ml i dodając do próbówek z solą fizjologiczną. Wykonano kolejne rozcieńczenia.

2. Podłoża stałe
   Na podłoża stałe wykonano posiew:
   - podłoże Chapek-Doxa posiew od 10^-1 do 10^-4, określenie liczby grzybów   pleśniowych
   - podłoże ze skrobią od 10^-2 do 10^-5 , określa liczbę bakterii rozkładających skrobię   (wykorzystujących skrobię jako subtancję odżywczą)
   - podłoże Fraziera od 10^-2 do 10^-5, określenie liczebności bakterii proteolitycznych
   - podłoże BA od 10^-3 do 10^-6, określenie liczebności bakterii
   - podłoże z fioletem krystalicznym od 10^-1 do 10^-4, wzrost bakterii Gramm -

3. Podłoża płynne
   Na podłoża płynne wykonano posiew:
   - podłoże z KNO₃ od 10^-2 do 10^-8
   - podłoże z wodą peptonową od 10^-1 do 10^-7 Do probówek włożono paski bibuły   nasączone octanem ołowiu
   - podłoże z argininą (podłoże półpłynne) od 10⁰ do 10^-4
   - podłoże z mocznikiem od 10⁰ do 10^-4
   

Na wszystkie podłoża stałe naniesiono 0,1 ml próbek glebowych o odpowiednim rozcieńczeniu. Do podłoży płynnych wprowadzono 0,5 ml próbek glebowych o odpowiednim rozcieńczeniu. Natomiast w przypadku podłoża półpłynnego odpowiednie próbki glebowe wprowadzono za pomocą drucika, wbijając go delikatnie w podłoże.

4. Posiewy inkubowano w temperaturze 28^oC przez 7 dni.

Wyniki:
Podłoża stałe

	Liczebność w 1g s.m. gleby
		Bakterie	Bakterie Gram -	Bakterie proteolityczne	Grzyby	Stosunek B/G
Gleba skażona metalami	4,7 x 10^8	5,7 x 10^6	3,33 x 10^7	4,6 x 10^5	23500:23

Podłoża płynne i półpłynne:

-miano bakterii rozkładających mocznik wynosi 10^-1

- miano bakterii rozkładających argininę wynosi 10^-2

- miano bakterii rozkładających aminokwasy zawierające siarkę wynosi 10^-4

-miano bakterii redukujących
(przeprowadzających całkowitą denitryfikację) wynosi 10^-5

  Częściowa denitryfikacja wystąpiła w stężeniu 10^-7, lecz była spowodowana zanieczyszczeniem   próby przez grzyb.

5. Czas trwania oczyszczania gleby z metali ciężkich trwał 2 tygodnie, po czym ponownie wykonaliśmy posiewy na wszystkie podłoża hodowlane.

Wyniki

Podłoża stałe

	Liczebność w 1g s.m. gleby
		Bakterie	Bakterie Gram -	Bakterie proteolityczne	Grzyby	Stosunek B/G
Gleba po 2 tyg. oczyszczaniu	4,8 x 10^6	2,6 x 10^6	1,5 x 10^6	2,6 x 10^6

Podłoża płynne i półpłynne:

-miano bakterii rozkładających mocznik wynosi 10^-2

- miano bakterii rozkładających argininę wynosi 10^-3

- miano bakterii rozkładających aminokwasy zawierające siarkę wynosi 10^-3

-miano bakterii redukujących
(przeprowadzających całkowitą denitryfikację) wynosi 10^-5

  Częściowa denitryfikacja wystąpiła w stężeniu 10^-6, lecz była spowodowana zanieczyszczeniem   próby przez grzyby.

Porównanie wyników

		Bakterie	Bakterie Gram -	Bakterie proteolityczne	Grzyby
Gleba po 2 tyg. oczyszczaniu	4,8 x 10^6	2,6 x 10^6	1,5 x 10^6	2,6 x 10^6
Gleba skażona metalami	4,7 x 10^8	5,7 x 10^6	3,33 x 10^7	4,6 x 10^5

Po dwu tygodniowym oczyszczaniu gleby z metali ciężkich zaobserwowano spadek ogólnej liczebności gleby. Liczebność bakterii Gram - praktycznie nie zmieniła. Liczebność bakterii proteolitycznych zmalała a liczebność grzybów w glebie po oczyszczaniu wzrosła.

Ćwiczenie 2: Analiza mikrobiologiczna osadu czynnego

Osad czynny to mieszane kultury mikroorganizmów biorące aktywny udział w oczyszczaniu ścieków i zdolne do tworzenia łatwo opadalnych zawiesin.

Najbardziej liczną grupę mikroorganizmów osadu czynnego stanowią bakterie. W skład osadu czynnego wchodzą również grzyby mikroskopowe Ascoidea, Fusarium, Subbaromyces, Sepedonium, Aspergillus, Cladosporium, Mucor, Trichoderma, Trichosporon, Rhizopus, a także liczne osiadłe i wolnopływające pierwotniaki, wrotki, nicienie, larwy owadów oraz pajęczaki. Usuwanie związków organicznych ze ścieków zachodzi z udziałem bakterii heterotroficznych, głównie z rodzaju Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Alcaligenes, Moraxella i Flavobacterium. W ściekach organiczne związki azotu są utleniane do azotanów (III) i azotanów przez bakterie nitryfikacyjne - Nitrosomonas i Nitrobacter. Azotany są usuwane ze ścieków przez bakterie denitryfikacyjne wykorzystujące te związki jako akceptory elektronów w procesach oddychania beztlenowego. W warunkach tlenowych następuje również utlenianie zredukowanych związków siarki do siarczanów z udziałem bakterii z rodzaju Acidithiobacillus. Znaczenie w procesie kształtowania kłaczków o znacznych rozmiarach mają też niektóre bakterie nitkowate, jednak ich nadmierny wzrost może powodować puchnięcie i/lub pienienie osadu. Frakcja mikroorganizmów stanowi od 5 do 20% całości kłaczków, resztę stanowi substancja o charakterze koloidalnym.

Przebieg:

Z kolby stożkowej pobrano próbkę (100 cm³) osadu czynnego i wlano do cylindra miarowego. Następnie pozostawiono próbkę na 30 min i po ustalonym czasie zmierzono ile objętości zajmuje woda a ile osad, który opadł.

Następnie przeprowadzono obserwacje pod mikroskopem aby określić średnią liczbę i wielkość kłaczków oraz mikroorganizmów występujących w osadzie czynnym w 10 polach widzenia. W celu określenia czy kłaczki są natlenowane, naniesiono kroplę osadu czynnego na szkiełko a następnie dodano kroplę błękitu metylenowego.

Wyniki:

Gęsty osad, duża ilość kłaczków po 30 minutach sedymentacji 75cm³zajmował osad, a 25 cm³ woda. Osad miał kolor ciemno brunatny. Nad osadem ciecz miała małą mętność.
Kłaczki rozgałęzione z gąbczastą strukturą, duże i dosyć liczne w polu widzenia. Kłaczki po zabarwieniu błękitem metylenowym są niebieskie co świadczy o dobrym natlenowaniu w osadzie czynnym. W próbkach były widoczne liczne pałeczki, ziarniaki oraz laseczki Gramm + (na preparacie widoczny sznur laseczek G+), oraz pałeczki Gramm -. Zauważalne sporadycznie ameby nagie czyli tzw. Korzenionóżki (organizmy jednokomórkowe pokryte cienka pellikulą, cechuje je duża zmienność kształtów) oraz sporadyczne wrotki (ruchliwe, wielokomórkowe organizmy o podłużnym kształcie).

Ćwiczenie 3: Określenie zawartości kadmu i ołowiu w glebach pochodzących z terenów o różnych stopniu zakażenia

Zawartość metali

- OŁÓW 88,6 MG/KG

- KADM 43,2 MG/KG

Zawartość metali po 2 tygodniach

- OŁÓW 40,3 MG/KG

- KADM 32,2 MG/KG

Dominika Sławacka

Dominika Szewczak

Karolina Sochacka

Izabela Woch

---