12. Metody oczyszczania białek

Poznanie funkcji określonego białka wymaga jego wyizolowania i oczyszczenia (oddzielenia) od tysięcy innych białek obecnych w badanych ekstraktach komórkowych lub

tkankowych. Białko można oddzielić od innych cząsteczek, w tym również od innych białek,

wykorzystując różnice w: rozpuszczalności, wielkości cząsteczek, w wielkości ładunku, a

także w powinowactwie do specyficznych grup chemicznych. Oczyszczanie białek jest możliwe tylko i wyłącznie w warunkach laboratoryjnych z wykorzystaniem odpowiednich preparatów i narzędzi. Jako główne metody e oczyszczania białek możemy zaliczyć:

• chromatografię jonowymienną - jedna z najbardziej popularnych metod rozdziału mieszanin wieloskładnikowych, której istotą jest rozdział białek wykorzystujący różnicę w ładunku elektrycznym. Separacja makromolekuł w chromatografii jonowymiennej polega na odwracalnej adsorpcji obdarzonych ładunkiem elektrycznym makromolekuł na złożu jonowymiennym (jonowymieniaczu). Wymieniacz jonowy jest substancją, która w zetknięciu z roztworem wymienia część swoich jonów na jony z roztworu. W jego strukturze można wyróżnić nierozpuszczalną matrycę połączoną wiązaniami kowalencyjnymi z określonymi grupami funkcyjnymi, które ulegają jonizacji i mogą w sposób odwracalny asocjować z jonami przeciwnego znaku, tzw. przeciwjonami;

• chromatografię żelową - zwaną również filtracją żelową, stosowana jest do rozdziału białek różniących się masą cząsteczkową i kształtem oraz do oddzielania białek od składników niskocząsteczkowych np. sole (odsalanie). Próbkę nanosi się na szczyt kolumny chromatograficznej jest ona wypełniona porowatymi ziarenkami, małe cząsteczki mieszaniny wnikają w głąb porowatych ziaren, duże natomiast nie wnikają. Droga do momentu wycieku z kolumny, którą musi pokonać każdy ze składników próbki jest więc nierówna. Cząsteczki o najmniejszym ciężarze cząsteczkowym mają do pokonania najdłuższą drogę i dlatego wypływają najpóźniej z kolumny. Białka o dużej masie cząsteczkowej i o efektywnej średnicy większej niż pory ziaren złoża mają do pokonania krótszą drogę w żelu i wędrują najszybciej. Pojawiają się zatem jako pierwsze u wylotu kolumny;

• chromatografię powinowactwa - jest szczególnym typem chromatografii adsorpcyjnej. Ze względu na swe unikalne właściwości pozwala znacznie uprościć procedurę izolowania wybranej substancji, przy jednoczesnym zachowaniu jej biologicznej aktywności. wykorzystuje się różne, w odpowiedni sposób zaktywowane sita molekularne oraz wzajemne powinowactwo dwóch substancji biologicznie czynnych, zdolnych do tworzenia kompleksów typu: enzym - substrat czy enzym - inhibitor. Jedna z nich stanowi ligand(atomy, cząsteczki lub aniony, które są bezpośrednio przyłączone do atomu centralnego lub kationu centralnego)

unieruchomiony na nierozpuszczalnym nośniku, a druga znajduje się w analizowanym lub oczyszczanym materiale biologicznym;

• wysalanie białek - metoda wykorzystująca różnicę rozpuszczalności białek w stężonych roztworach soli, dlatego wysalanie można wykorzystać do ich wstępnego frakcjonowania. Do wysalania stosuje się sole, które wiążą wodę (np. siarczan amonu). Pozbawienie cząsteczek białka płaszcza wodnego zmniejsza jego rozpuszczalność i prowadzi do wytrącenia z roztworu. Proces ten polega na odciąganiu wody hydratacyjnej z powierzchni cząsteczek białkowych przez obecne w roztworze jony soli (np. NH4+). Jest to związane z znacznie większym powinowactwem jonów NH4+ do cząsteczek wody w porównaniu z siłami powodującymi uwodnienie cząsteczek białka. Wysalanie białek jest procesem odwracalnym.

• SDS-PAGE - do rozdziału białek najpowszechniej wykorzystuję się metodę SDS-PAGE. SDS niszczy wyższe struktury białek i opłaszcza białka co powoduje, że wszystkie one mają ten sam ujemny ładunek. Procedura SDS-PAGE: liza komórek w buforze RIPA zawierającym, inhibitory proteaz i fosfataz, wirowanie lizatu w celu oddzielenia, pozostałości błon komórkowych, określenie ilości białek w lizacie (μg/μl) (Np. metoda Bradford, polegająca na, wybarwieniu białek barwnikiem Kumazyną i, spektrofotometryczna analiza), denaturacja białek wraz z SDS, elektroforeza poliakrylamidowa i barwienie

.