ZASTOSOWANIE ENZYMÓW DO ILOŚCIOWEJ ANALIZY METABOLITÓW

Oznaczanie stężenia glukozy w materiale biologicznym

Enzymy są doskonałym narzędziem stosowanym w analizie wielu związków. Wykorzystuje się je w analizie żywności, leków i diagnostyce medycznej. Szczególnie użyteczne są enzymy w badaniach biochemicznych i biotechnologicznych. W biochemii stosuje się je do analizy metabolitów (alkohol, glukoza, fruktoza, 2,3-difosfoglicerynian, kreatynina, cholesterol, CO₂ itd.). Metody analityczne z udziałem enzymów charakteryzują się wysoką specyficznością, powtarzalnością, szybkością i ogromną czułością. Dzięki specyficzności enzymów analiza może być wykonywana w homogenatach, płynach fizjologicznych i nie oczyszczonych próbach, a wysoka czułość pozwala na użycie do badań niewielkich ilości materiału.

W oznaczeniach z udziałem enzymów bardzo często reakcje sprzężone są z procesami fosforylacji lub defosforylacji oraz utlenieniem lub redukcją NAD lub NADP. Enzymy stosuje się do analizy ilościowej cukrów tj. glukozy, fruktozy lub skrobi.

W analizie glukozy wykorzystuje się enzymy metabolizujące ten cukier: heksokinazę i dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu (glikoliza, cykl pentozofosforanowy) (1) lub oksydazę glukozy w reakcji sprzężonej z aktywnością peroksydazy (2).

heksokinaza

(1) glukoza + ATP glukozo-6-fosforan + ADP

glukozo-6-fosforan + NADP⁺ 6-fosfoglukonian + NADPH + H⁺

(2) glukoza + H₂O +O₂ glukonian + H₂O₂

2H₂O₂ + 4-aminofenazon + fenol chinonoimina + 4H₂O

W wyniku reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu (1) dochodzi do spadku poziomu NADP i wzrostu poziomu NADPH w mieszaninie reakcyjnej. Ilość powstającego w reakcji NADPH jest proporcjonalna do ilości glukozy. Ilość glukozy wyznaczamy na podstawie rosnącej absorbancji próby mierzonej przy λ = 340nm. Zmiany te wynikają z tego, że widmo adsorpcyjne NADP i NADPH jest różne. NADP posiada jedno maksimum absorbcji przy λ = 260 nm, a powstający po redukcji NADPH zyskuje dodatkowe maksimum absorbcji przy λ = 340nm.

Odczynniki:

1. 5M HClO₄

2. 2,5M KOH

3. 100 mM bufor Tris-HCl pH 8,0

4. 10mM ATP

5. 3mM NADP⁺

6. Mieszanina heksokinaza 140U/ml i dehydrogenaza glukozo-6-fosforanu l U/ml w 100mM buforze Tris-HCl pH 8,0 + 0,9% albumina + 0,05% NaN₃

7. 100mM MgCl₂

8. Roztwór standardowy glukozy o stężeniu 0,1 mg/ml

Materiał:

1. Surowica krwi

2. Wątroba

3. Kiełki pszenicy lub kukurydzy

Wykonanie:

A. Przygotowanie krzywej kalibracyjnej

Celem przygotowania krzywej kalibracyjnej dla każdej metody analizy ilościowej jest:

a/ wyznaczenie zależności między ilością analizowanej substancji, a wartością uzyskanych

w doświadczeniu danych np. absorbancji. Wartości te możemy wykorzystać do

sporządzenia wykresu, oraz do obliczenia współczynnika kalibracji,

b/ określenie zakresu metody, czyli wyznaczenie najmniejszej i największej ilości lub

stężenia substancji jaką możemy zmierzyć stosując daną metodę analityczną,

c/ zbadanie czy stosowana metoda spełnia kryteria wynikające ze zjawisk, które stanowią

podstawę używanej do analizy metody np. w metodach kolorymetrycznych wypełniają

kryterium liniowej zależności między stężeniem analizowanej substancji, a absorbancją

uzyskanych roztworów barwnych.

Z roztworu standardowego glukozy o stężeniu 0,1mg/ml przygotuj następujące roztwory:

1/ 10 μg glukozy/0,6ml; 2/ 20 μg glukozy/0,6ml; 3/ 30 μg glukozy/0,6ml

W probówce zmieszaj kolejno:

0,6 ml standardu o określonym stężeniu glukozy

0,6 ml 100 mM buforu Tris-HCl pH 8,0

0,1 ml 100mM MgCl₂

0,05 ml 10mM ATP

0,05 ml mieszaniny heksokinazy i dehydrogenazy (przygotowany rozwór enzymów jest 50×rozc.)

Składniki dokładnie wymieszaj, przenieś do kuwety.

Dodaj 0,1 ml NADP⁺ i kuwetę wstaw do spektrofotometru.

Co 1 min notuj zmiany absorbancji przy λ= 340 nm aż do uzyskania stałej wartości odczytu.

Próbę „0” przygotuj jak wyżej dodając w miejsce roztworu glukozy 0,6 ml H₂O.

B. Przygotowanie materiału

1/ Surowica

Do probówki Eppendorfa z 0,5 ml surowicy dodać 0,5 ml H₂O i l ml 5M HClO₄. Dokładnie wymieszać i wirować 2 min w mikrowirówce. Pobrać l ml supernatantu do probówki Eppendorfa i dodać l ml 2,5M KOH. Ponownie dokładnie wymieszać i odwirować. Do oznaczeń supernatant rozcieńczyć 5-krotnie H₂O.

2/ Wątroba

5g wątroby rozdrobnić nożem i zhomogenizować w probówce plastikowej z 10 ml H₂O używając homogenizatora nożykowego. 4ml homogenatu przenieść do 2 probówek Eppendorfa i wirować 10 min przy 15tys. obr/min. Supernatant rozcieńczyć 5 × wodą destylowaną. W kolejnej probówce Eppendorfa zmieszać l ml rozcieńczonego 5 × supernatantu z l ml 5M HCIO4 i wirować przez 2 min w mikrowirówce. Ponownie pobrać l ml supernatantu i przenieść do suchej probówki, dodać l ml 2,5M KOH, dokładnie wymieszać i odwirować w mikrowirówce. Do oznaczeń supernatant rozcieńczyć 5 × H₂O.

3/ Kiełki

2,5 g kiełków rozetrzeć w moździerzu z l0 ml H₂O. 4ml homogenatu przenieść do 2 probówek Eppendorfa i wirować 10 min przy 15 tys. obr/min. Do kolejnej probówki Eppendorfa przenieść 0,5 ml supernatantu, dodać 0,5 ml H₂O i l ml 5 M HClO₄. Po dokładnym wymieszaniu zawiesinę wirować przez 2 min w mikrowirówce. Do probówki Eppendorfa przenieść l ml supernatantu i 1 ml 2,5M KOH. Całość dokładnie wymieszać i odwirować jak wyżej. Do oznaczeń supernatant rozcieńczyć 10 × H₂O.

C. Oznaczanie stężenia glukozy w surowicy krwi, komórkach watroby i kiełkach

Przed pomiarem ustaw długość fali w spektrofotometrze na λ = 340nm.

W probówce szklanej zmieszać:

0,6ml odbiałczonej próby

0,6 ml 100 mM buforu Tris-HCl pH 8,0

0,l ml 100mMMgCl₂

0,05 ml 10 mM ATP

0,05 ml mieszaniny heksokinazy i dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu (50× rozc)

Dokładnie wymieszać, przenieść do kuwety spektrofotometrycznej.

Dodać 0,1 ml NADP⁺ wymieszać, wstawić do spektrofotometru i notować zmiany absorbancji przy λ = 340 co l min aż do stałej wartości odczytu.

Próbę „zerową" przygotować jak wyżej dodając w miejsce odbiałczanej próby 0,6 ml wody.

Opracowanie wyników:

1. Na podstawie uzyskanych wyników wykreśl zależność wartości absorbancji od stężenia glukozy

w próbie (0,6ml) oraz oblicz współczynnik kalibracji k.

2. Posługując się krzywą standardową i korzystając ze współczynnika kalibracji oblicz stężenie

glukozy (mg/ml) w surowicy krwi, komórkach wątroby i kiełkach.

3. Molowy współczynnik absorpcji dla NAD⁺/NADP⁺ wynosi ε = 6220 l x mol^-1 x cm^-1

przy grubości warstwy 1 cm i długości fali λ = 340 nm.

Z prawa Lamberta-Beera:

A = c x ε x l gdzie: A - absorbancja roztworu

c - stężenie substancji

l - grubość warstwy (cm)

Korzystając z powyższego wzoru oblicz stężenie glukozy (mg/ml) w badanym materiale.

Uwaga! Przy obliczaniu całkowitego stężenia glukozy uwzględnij jej rozcieńczenie

w badanym materiale.

1

oksydaza glukozy

peroksydaza

dehydrogenaza

glukozo-6-fosforanu

---