Biochemia żywienia Wd2 – 12.10.2009

Metabolizm białka – proteoliza

PROTEOLIZA WEWENĄTRZ KOMÓRKOWA

Funkcje proteolizy komórkowej:

• Powiązanie metabolizmu białek z metabolizmem energetycznym

• Dopasowanie metabolizmu do aktualnych potrzeb przez rozkładanie enzymów i innych czynników regulujących,

• Zapewnienie odpowiedniej jakości białek w komórce przez usuwanie białek o nieprawidłowej strukturze,

• Regulacja wydzielania hormonów.

Okresy półtrwania wybranych enzymów – najkrótsze enzymów regulatorowych

Enzym	L1/2 (dot)
Dh mleczanowa	6,0
Aldolaza	4,9
Dh glukozo – 6 – fosforanu	1
Glukokinaza	1
Karboksykinaza fosfoeneolopirogronianowa	0,3
Kinaza tymidynowa	0,1
Dekarboksylaza ornitynowa	0,008
Polimeraza RNA I	0,05
Aminotransferaza tyrozynowa	0,06
Oksygenaza tryptofanu	0,008
Dh aldehydu fosfoglicerynowago	3,4
arginaza	4,5
Karboksylaza acetylo – CoA	2

Zmiany wiekowe okresu półtrwania różnych białek w ludzkich fibroblastach (godziny)

Białka	Okres młody	Okres stary
Aminotransferaza asparganinowa	5,5	5,0
Lizozym	2,8
aldolaza
cyklonukleza	0,8	1,28

Główne systemy proteolityczne w komórce

• Lizosomalny

• Zależny od jonów wapniowych

• Zależny od ubikwityny i ATP

Turnovem białka – klasy białek i mechanizmy

Rola komórkowych systemów proteolitycznych

Proteoliza jest m. In wykorzystywana do zapewnienia prawidłowiej struktury puli białek w komórce

• Chaperony korzystają z energii ATP – są ATP-azami,

• Chaperony pomagają przy fałdowaniu poprzez bukowanie niedozwolonych interakcji miedzy cząsteczkami,

• Kompleks ATP – chaperon ma powinowactwo do peptydów niesfałdowanych, a nie ma do białek natywnych.

• Chaperony przeciwdziałają agregacji białek charakterystycznej dla takich schorzeń jak choroba Alzheimera, Crucutzfelda – Jacoba,

• Naprawianie cząsteczki białka przez cha perony może podlegać na ułatwianiu „odfałdowania” w celu możliwości nowego prawidłowego pofałdowania

• Niektóre cha perony działają jak enzymy zwiększające tempo fałdowania cząsteczki białka – peptydylo – propylu – izomerazy, izomerazy białkowych mostków dwusiarczkowych

Do rodziny cha peronów należą białka szoku cieplnego (heat shock protein - HSP)

Indukowane w odpowiedzi na:

• Stres termiczny

• Stres oksydacyjny

• Zatrucie metalami Cinimi

• Zatrucie alkoholem

• Inhibitory przemian energetycznych

• Zapalenie

Białka szoku termicznego zwiększają szansę przeżycia komórki w warunkach szoku przez dezagregację białek wrażliwych na stres i doprowadzenie do proteolizy białek uszkodzonych.

W warunkach bezstresowych biorą udział w regulacji podstawowych życiowych funkcji komórki (housekeeping): oprócz fałdowania i translokacji białek, aktywują białka regulatorowe – np. czynniki transkrypcyjne, kinazy.

Mechanizm działania CHAPERONÓW –

Związanie niepofałdowanego białka powoduje zmianę konformacyjną – skrócenie cząsteczki chaperonu – utworzenie „form” i sfałdowanie białka.

Wrodzone schorzenia spowodowane przez mutację cha peronów i chaperonin

• Syndrom McCusicka – Kaufmana – m. In. Wrodzona wada serca

• Syndrom Bardet – Biedl - retinopatia, opóźnienie umysłowe, otyłość, dysfunkcja nerek.

• Autosomalna recesywna ataksja Charlevoix – Sagueany - neuropatia motoryczna, atrofia móżdżku, hipermielnizacja siatkówki,

• Wrodzona katarakta

Degradacja lizosomalna

• Lizosomy – organelle zawierające liczne hydrolazy

• pH lizosomalne miedzy 4 5

• proteazy lizosomalne – katepsyny – mają optimum pH w tym zakresie

• proteazy lizosomalne działają na białka pobierane drogą endocytozy z zewnątrz komórki, z jej powierzchni lub wnętrza

• lizosomalne proteazy są zdolne do degradowania białek aż do aminokwasów.

MIKROAUTOFAGIA – małe porcje cytoplazmy tworzą wgłębienia na powierzchni lizosomów – odpowiedzialna za ciągłą degradacje dług żyjących białek.

MAKROAUTOFAGIA – duże fragmenty cytosolu lub całe organelle zostają otoczone przez wakuole – powstają autolagosomy – po fuzji z lizosomami następuje proteoliza.

KRINOFAGIA – pochłanianie przez lizosomy pęcherzyków aparatu golgiego – ograniczenie wydzielania.

Makroautofagia w wątrobie odpowiedzialna za prawie całą proteolizę, zwłaszcza w okresie głodzenia.

Czynniki hamujące Makroautofagię:

• aminokwasy

• insulina

• pęcznienie komórki

• rozerwanie cytoszkieletu

Degradacja zależna od ubikwityny:

• białka zostają „naznaczone” przez związanie z ubikwityną – stają się rozpoznawalne przez proleasomy i ulęgają degradacji pod ich wpływem.

• Proteasomy – multikatalityczny kompleks proteaz cytosolowych.

1. Ubikwityna przyłącza się kowalencyjnie do białek docelowych w reakcji wymagającej ATP,

2. Dołączenie kolejnych ubikiwtyn – powstaje poliubikwityna połączona z substratem – cząsteczka rozpoznawana przez proteasomy.

Proteoliza zależna od ubikwityny zaangażowana jest w następujące procesy w komórce:

• Regulacja cyklu komórkowego i podziałów komórki,

• Regulacja różnicowania

• Odpowiedź na stres komórkowy i czynnik zewnętrzny,

• Morfogeneza połączeń nerwowych

• Modulacja receptorów powierzchniowych

• Modulacja kanałów jonowych

• Naprawa DNA

• Regulacja transkrypcyjna

• Pamięć długotrwała

• Rytmy dobowe

• Regulacja reakcji zapalnych i odpornościowych

• Biogeneza organelli

• Proteoliza zależna od ubikwityny - zwiększa się w stanie głodu i niedożywienia białkowego.

• Aktywność fizyczna zmniejsza, a bezczynność mięśni zwiększa intensywność proteolizy zależnej od ubikwityny.

• Sepsa, choroba nowotworowa, zakwaszenie zwiększa proteolizę tego typu, ma ona znaczący udział w powstawaniu wyniszczenia

Proteoliza zależna od jonów wapniowych

Enzymy kalpainy – proteazy tiolowe, aktywność zależna od poziomu wapnia wewnątrz komórki.

Kalpainy – są unieczynnione przez wewnątrzkomórkowe inhibitory – kalpastyny. Kalpainy degradują białka błonowe i cytoszkieletu, a także enzymy związane z błonami.

• Działają podczas fuzji błon,

• Substratami są np. kinazy białkowe i erytrocytarny transporter anionowy,

• Proteoliza kinaz białkowych wskazuje na ich wpływ na przeniesienie sygnałów informacyjnych wewnątrz komódki. Aktywowane są przez czynniki regulujące.

• Przypuszczalnie odgrywają rolę w podziałach komórkowych.

• Rozkładają niektóre czynniki transkrypcyjne. Regulacja ekspresji genów?

• Zaangażowane są w programowaną śmierć komórki apoptozę w niektórych typach komórek w przypadku działania określonych czynników stymulujących.

• Zaangażowanie w wiek stanów patogennych związanych z zaburzeniami wewnątrzkomórkowymi homeostazy wapniowej.

CHOROBY ZWIĄZANE Z PODWYŻSZONĄ AKTYWNOŚCIĄ KALPAIN

• Choroba Alzheimera – w korze mózgu 3x wyższa aktywność kapaliny i tyle samo niższa kalpastatyny.

• Katarakta - napływ wapnia (1 mM lub więcej) aktywuje m-kalapinę, która rozkłada białko krystalinę. Fragmenty krystality tworzą agregaty – katarakty,

• Dystrofia mięśni – choroba Duchenne’a – utrata białka błonowego, dystrofiny, powoduje napływ Wania , wzrost aktywność kapain miejscową proteolizę.

• Zawał mięśnia sercowego - W miejscach niedotlenienia wzrost poziomu wapnia. Kapaliny degradują białka desminę i alfa – spektryne.

• Stwardnienie rozsiane – wszystkie główne białka mieliny są substancjami kapalin. Aktywność kapalin wzrasta pod pływem zmian zapalnych. Inhibitory kapalin hamują degradację neurofilamentów.

• Udar mózgu – aktywność kapalin wzrastam a poziom kalpastatyny ulega obniżeniu w miejscach niedotlenienia. Kapaliny uczestnicz zarówno w apoptozie, jak i nekrozie komórek nerwowych, inhibitory kapalin zmniejszają degradację spektryny.

Apoptoza – programowalna lub genetycznie

sterowana śmierć komórki

ŚMIERĆ KOMÓRKI

NEKROZA APOPTOZA

Nekroza – wywołana przez uszkadzające czynniki mechaniczne lub chemiczne:

• Pchniecie komórki i jej organelli spowodowane uszkodzeniem błony komórkowej

• Wypływanie zawartości komórki

• Reakcja zapalna

Apoptoza – wywołana przez czynniki wewnętrzne lub zewnętrzne z uruchomieniem aparatu apoptotycznego:

• Kurczenie się komórki,

• Powstania pęcherzyków na powierzchni błony komórkowej,

• Rozpad mitochondriów i uwolnienie cytochromu C

• Degradacja chromatyny jądrowej

• Fragmentacja komórki w otoczone błoną pakiety

• Fosfolipidy – fosfatydyloseryna wychodzi pod wpływem enzymu flipazy,

• Fosfatydyloseryna jest wiązana przez receptory makrofagów i komórek dendrytycznych, co rozpoczyna proces fagocytozy fragmentów komórki.

• Komorku fagocytujące wydzielają cytokininy hamujące rozwój reakcji zapalnej,

Programowana śmierć komórki jest potrzebna do normalnego rozwoju, jak np. mitoza.

Przykłady:

• Tworzenie palców dłoni i stóp u płodu wymaga apoptozy łączącej te tkanki,

• Martwica endometrium macicy przez menstruacją jest spowodowana apoptozą,

• Tworzenie właściwych połączeń miedzy nerwami w mózgu wymaga usunięcia nadmiaru komórek przez apoptozę

Programowana śmierć komórki jest potrzebna do usunięcia Komorek stanowiących zagrożenie dla organizmu:

Przykłady:

• Komórki zainfekowane przez wirus,

• Komórki systemu immunologicznego zaangażowane w odpowiedz komórkową musza być usunięte, aby nie atakowały komórek własnego ciała – defekt apoptozy powoduje choroby autoimmunologiczne.

• Komórki z defektem DNA – defekt apoptozy podczas życia płodowego – wrodzone wady – później – rozwój nowotworu

Apoptoza rozpoczyna się, gdy zaczynają przeważać sygnały indukujące proces apoptozy nad warunkującymi życie komórki.

Systemy warunkujące życie komórki, rożne dla różnych komórek, np.:

• Czynniki wzrostu dla neuronów

• Hormony płciowe dla komórek układu rozrodczego,

• Interleukina-2 dla limfocytów

Sygnały negatywne:

• Uszkodzenie DNA przez promieniowanie ultrafioletowe, promieniowanie X, leki chematoterapeutyczne,

• Nagromadzenie białek nieprawidłowo pofałdowanych,

• Cząsteczki wiążące się na powierzchni komórek do specyficznych receptorów – „aktywatory Śmierci”

  • Czynnik martwicy guza (TNF – alfa) – receptor TNF

  • Limfo toksyna (TNF-beta) – receptor TNF

  • Ligand fas (FasL) – receptor fas, także nazywany CD95

Mechanism apoptozy

1. Generowany przez sygnały z wnętrza komórki

2. Wywołany przez „aktywatory śmierci” – FasL, TNF – alfa i beta. Do ligand receptorów Fas należą powierzchniowe cząsteczki limfocytów cytotoksycznych

Apoptoza wywołana przez sygnały wewnętrzne:

• Błona zewnętrzna mitochoindrium zawiera na powierzchni białko Bcl – 2,

• Białko Bcl-2 wiąże się z cząsteczką Apaf – 1

• Uszkodzenie komórki powoduje uwolnienie Apaf – 1 penetracja błon mitochondrialnych przez białko Bax.

• Otwarte mitochondriom przez Bax powoduje wypłynięcie cytochromu C

• Cytochrom C, Apaf – 1 i ATP wiążą się z kaspazą 9 tworząc apoptosom.

• Apoptosomy agregują w cytosolu,

• Kaspara 9 inicjuje aktywację innych - 12 – Kaspar, kaspazy – proteazy, których nazwa pochodzi od specyficzności działania – rozszczepienie wiązania przy reszcie kwasu asparginowego,

• Kaspazy powodują degradację białek jądrowych i cytosolowych, nukleazy rozkładają kwasy nukleinowe.

• FAGOCYTOZA