Trzy polimerazy RNA
Eukariotyczne polimerazy RNA
Mechanizm transkrypcji u Eukaryota jest podobny do mechanizmu prokariotycznego. Ponieważ jednak u Eukaryota z aparatem transkrypcyjnym jest wiązana znacznie większa liczba polipeptydów, proces ten jest bardziej skomplikowany. Za transkrypcję różnych klas genów eukariotycznych są odpowiedzialne trzy polimerazy RNA. Obecność trzech różnych polimeraz RNA stwierdzono w trakcie oczyszczania chromatograficznego tych enzymów, podczas którego poszczególne aktywności wypływały z kolumny przy różnych stężeniach soli. Każda z polimeraz ma inną wrażliwość na izolowaną z grzybów toksynę — a-amanitynę. Właściwość tę wykorzystuje się w celu odróżnienia aktywności polimeraz RNA.
Polimeraza RNA I (RNA Pol I) transkrybuje większość genów rRNA. Znajduje się w jąderku i jest niewrażliwa na a-amanitynę
Polimeraza RNA II (RNA Pol II) transkrybuje wszystkie geny kodujące białka i niektóre geny małych jądrowych RNA (snRNA — ang. smali nuclear RNA). Znajduje się w nukleoplazmie i jest bardzo wrażliwa na a-amanitynę
Polimeraza RNA III (RNA Pol III) transkrybuje geny tRNA, 5S rRNA, U6 snRNA oraz geny kilku innych małych RNA. Znajduje się w nukleo- plazmic i jest stosunkowo mało wrażliwa na a-amanitynę
Oprócz enzymów jądrowych, komórki eukariotyczne zawierają dodatkowe polimerazy RNA w mitochondriach i chloroplastach.
Podjednostki polimeraz RNA
Wszystkie trzy polimerazy są dużymi enzymami zawierającymi 12 lub więcej podjednostek. Geny kodujące dwie największe podjednostki każdej z polimeraz wykazują względem siebie homologię (spokrewnione sekwencje DNA). Wszystkie polimerazy eukariotyczne mają podjednostki wykazujące homologię do podjednostek zawartych w rdzeniu polimerazy RNA E coli. Największa podjednostka każdej z eukariotycznych polimeraz przypomina podjednostkę V polimerazy E. coli, natomiast druga co do wielkości podjednostka tych polimeraz podobna jest do podjednostki p, zawierającej miejsce aktywne enzymu E. coli. Funkcjonalne znaczenie tych homologii wspiera następująca obserwacja: druga co do wielkości podjednostka wszystkich polimeraz eukariotycznych również zawiera miejsce aktywne enzymu. Dwie podjednostki wspólne dla RNA poi I i RNA poi III oraz jedna podjednostka specyficzna dla RNA Pol II wykazują homologię do podjednostki a polimerazy RNA z E. coli. Przynajmniej pięć innych mniejszych podjednostek jest wspólnych dla trzech eukariotycznych polimeraz. Dodatkowo każda z polimeraz zawiera cztery do siedmiu innych podjednostek, specyficznych dla każdej z nich.
Aktywności eukariotycznych polimeraz RNA
Podobnie jak w przypadku bakteryjnych polimeraz RNA, każdy z eukariotycznych enzymów katalizuje transkrypcję w kierunku 5'-»3' i syntetyzuje RNA komplementarny do ustawionego antyrównolegle łańcucha matrycy. Reakcja wymaga obecności prekursorów nukleotydowych ATP, GTP, CTP i UTP i do inicjaqi transkrypcji nie wymaga startera. Oczyszczone eukariotyczne polimerazy RNA, w przeciwieństwie do oczyszczonych enzymów bakteryjnych, wymagają obecności dodatkowych białekinicjatorowych umożliwiających im związanie się z promotorem i rozpoczęcie transkrypcji.
Domena CTD polimerazy RNA II
Koniec karboksylowy RNA Pol II zawiera ciąg siedmiu aminokwasów, który w przypadku mysiego enzymu jest powtórzony 52 razy, a w przypadku drożdżowego 26 razy. Ten heptapeptyd ma następującą sekwencję Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser i znany jest pod nazwą karboksylowej domeny terminalnej. Powtórzenia te są istotne dla funkcji życiowych. Reszty serynowe i niektóre tyrozynowe sekwencji CTD mogą być fosforylowane. Badania in vitro wykazały, że domena ta nie jest fosforylowana w momencie inicjowania transkrypcji, lecz fosforylacja zachodzi w czasie elongacji, gdy tylko polimeraza opuści miejsce promotorowe. Ponieważ RNA Pol II katalizuje transkrypcję wszystkich genów kodujących białka, jest z tego powodu najważniejszym enzymem w badaniach nad zróżnicowaną ekspresją tych genów. Domena C I D okazała się właśnie miejscem związanym ze zróżnicowaną aktywacją elongacji transkrypcji.
Geny transkrybowane przez RNA POL I: POWTÓRZENIA GENÓW RYBOSOMOWYCH RNA
RNA Pol I jest odpowiedzialna za ciągłą syntezę rRNA w czasie interfazy. W komórkach ludzkich znajduje się pięć zespołów genów rRNA, każdy zawierający po około 40 kopii tych genów. Zespoły te znajdują się na różnych chromosomach. Każdy gen rRNA daje trans- krypt 45S rRNA o długości około 13 000 nt. Pierwotny transkrypt ulega rozcięciu dając po jednej kopii 28S rRNA (5000 nt), 18S rRNA (2000 nt) i 5,8S rRNA (160 nt). Ciągła transkrypcja wielu kopii genów rRNA jest konieczna do wystarczającej produkcji dojrzałych cząsteczek rRNA, które następnie wchodzą w skład rybosomów.
Funkcja jąderka
Każdy zespół genów rRNA zwany jest organizatorem jąderkowym, jako że jąderko zawiera duże pętle DNA zawierającego zespoły tych genów. Po zakończeniu mitozy rozpoczyna się w komórce synteza rRNA i pojawiają się małe jąderka w miejscach chromosomowego DNA, w których znajdują się geny rRNA. W czasie aktywnej syntezy rRNA, transkrybowane pre-rRNA gromadzą się wzdłuż genów rRNA i mogą być uwidocznione w mikroskopie elektronowym jako tzw. struktury „choinek”. W strukturach tych, syntetyzowane transkrypty RNA są gęsto ułożone wzdłuż DNA i odgałęziają się na zewnątrz prostopadle w stosunku do DNA. Krótkie transkrypty widać przy początku genu, a wydłużają się one w kierunku jego końca. Koniec genu znajduje się tam, gdzie przestają się pojawiać transkrypty RNA.
Promotory RNA Pol I
Promotor genów prc-rRNA u ssaków składa się dwóch rejonów kontrolujących transkrypcję
Główny rejon zawiera miejsce startu transkrypcji i otaczające go nukleotydy od -31 do +6. Rejon ten jest istotny dla transkrypcji.
Dodatkowy rejon kontrolny, o długości 50-80 pz, zwany UCE zaczyna się około 100 nukleotydów powyżej miejsca startu (-100). Rejon UCE jest odpowiedzialny za zwiększenie wydajności transkrypcji od 10-100 razy w porównaniu z wydajnością tego procesu uzyskiwaną tylko z głównego rejonu
Z elementem UCE wiąże się specyficzne białko wiążące DNA, zwane czynnikiem wiążącym się z elementem UCE lub w skrócie — UBF. Czynnik UBF wiąże się nie tylko z rejonem UCE, lecz również z początkową częścią głównego rejonu promotorowego. Sekwencje nukleotydowe w obu miejscach wiązania czynnika UBF nie wykazują podobieństwa. Uważa się, że z każdym z tych rejonów promotorowych wiąże się jedna cząsteczka UBF. Dwie cząsteczki UBF mogą się więc wiązać ze sobą poprzez oddziaływania białko-białko, powodując wytworzenie pętli DNA znajdującego się między dwoma rejonami promotora.
Dodatkowy czynnik, zwany czynnikiem selekcyjnym wiąże się z kompleksem UBF-DNA stabilizując go i oddziałuje z wolną częścią głównego rejonu promotorowego. Związanie SL 1 umożliwia przyłączenie się RNA Pol I do kompleksu i zainicjowanie transkrypcji.
Wykazano, że SL1 składa się z kilku podjednostek. Między innymi w skład tego czynnika wchodzi białko zwane TBP. Wszystkie trzy polimerazy RNA wymagają obecności tego białka w procesie inicjacji transkrypcji. Pozostałe trzy podjednostki SL1 zwane są czynnikami towarzyszącymi TBP lub w skrócie TAF a te podjednostki, które są specyficzne dla transkrypcji prowadzonej przez RNA Pol I, zwane są TAF.
Czynnik zwany I IF-l to element kontrolujący transkrypcję. IF-l, homolog SL1, wiąże się z tym miejscem, umożliwiając wiązanie RNA Pol I i inicjację transkrypcji. W czasie gdy polimeraza RNA oddala się wzdłuż DNA od miejsca inicjacji, czynnik TIF-I pozostaje tam związany, umożliwiając inicjację transkrypcji kolejnej cząsteczce polimerazy RNA i wielokrotne cykle transkrypcji. Z tego względu jest to bardzo prosty sposób kontroli transkrypcji.
Polimeraza III: transkrypcja genów 5S rRNA i tRNA
Polimeraza RNA III jest kompleksem składającym się przynajmniej z 16 różnych pod jednostek. Podobnie jak RNA Pol II, RNA Pol III znajduje się w nukleoplazmie. RNA Pol III syntetyzuje prekursory 5S rRNA, tRNA, różne snRNA i niektóre cytoplazmatyczne RNA.
Pierwotne transkrypty pochodzące z genów tRNA nazywamy cząsteczkami prekursorowymi tRNA. Podlegają one procesom dojrzewania, które prowadzą do uzyskania dojrzałych RNA
Rejony kontrolujące transkrypcję genów tRNA znajdują się poniżej miejsca startu transkrypcji, w obrębie rejonu kodującego, w którym znajdują się dwie bardzo konserwatywne sekwencje nukleotydowe, zwane blokiem A (5'-TGGCNN AGTGG-3') i blokiem 15 (5'-GGTTCG ANNCC-3'). Sekwencje te kodują również ważne fragmenty samej cząsteczki tRNA, zwane pętlą D i pętlą T'FC . Oznacza to, że silnie konserwatywne fragmenty sekwencji tRNA są również silnie konserwatywnymi sekwencjami promotorowymi w genach tRNA.
Zidentyfikowano dwa czynniki tworzące kompleksy z DNA, niezbędne do inicjacji transkrypcji prowadzonej przez RNA Pol III. TFI1IC wiąże się z obydwoma blokami promotorowymi A i B. TFII1B wiąże się z DNA 50 pz powyżej bloku A. TFIIIB składa się z trzech podjednostek, jedną z nich jest TBP, główny czynnik inicjatorowy konieczny do aktywności wszystkich trzech polimeraz RNA. Drugą z nich jest BRF (ang. TFIIB-related factor), czynnik wykazujący homologię do czynnika TFIIB — czynnika inicjatorowego dla RNA Pol II. Trzecia podjednostka jest nazywana B”. TFIIIB nie wykazuje specyficzności wiązania z DNA w zależności od sekwencji nukleotydowej, stąd jego miejsce wiązania jest określone poprzez pozycję, jaką zajmuje TFIIIC związany z DNA. FFUIB umożliwia przyłączenie polimerazy III RNA i następnie zainicjowanie transkrypcji. Jeśli TFIIIB zostanie raz związany z kompleksem inicjatorowym, można usunąć TFIIIC bez towarzyszącego temu negatywnego wpływu na transkrypcję. TFIIIC jest więc czynnikiem odpowiedzialnym za budowę kompleksu inicjatorowego poprzez odpowiednie umiejscowienie czynnika inicjatorowego TFIIIB.
Geny 5S rRNA
Jednym z rybosomowych RNA jest 5S rRNA, transkrybowany przez polimerazę RNA III. Jest to jedyny rRNA transkrybowany niezależnie. Tak jak inne geny rRNA transkrybowane przez RNA polimerazę I, geny 5S rRNA są zorganizowane w zespoły, w których są ułożone tandemowo. U człowieka występuje tylko jeden zespół zawierający około 2000 tych genów. Promotory genów 5S rRNA znajdują się w obrębie sekwencji kodującej. Są to: blok C występujący 81-99 pz poniżej startu transkrypcji i blok A zawierający się między pozycjami +50 a +65.
Promotorowy blok C genów 5S rRNA jest miejscem wiązania specyficznego białka wiążącego się z DNA, TFII1A. TFIIIA jest czynnikiem organizującym, który umożliwia oddziaływania TFIIIC z promotorem 5S rRNA. Blok A może pełnić również funkcje stabilizujące wiązanie TFIIIC. TFIIIC zostaje w ten sposób związany z DNA w miejscu, którego odległość od miejsca startu transkrypcji jest taka sama jak w przypadku genów tRNA. Raz związany TFIIIC umożliwia przyłączenie TFÍIIB, następnie polimerazy RNA III i rozpoczęcie transkrypcji.
Inne promotory dla RNA Pol III
gen małego jądrowego RNA U6- zawiera charakterystyczny blok A- nie jest niezbędny do transkrypcji
gen małego RNA wirusa Epsteina-Barr
znajdują się się powyżej miejsca startu transkrypcji. Sekwencja nukleotydowa powyżej rejonu kodującego U6 snRNA zawiera typowe sekwencje promotorowe dla RNA Pol II, włączając w to kasetę TATA ) zlokalizowaną między pozycjami nukleotydowymi -30 do -23. Wspólne czynniki transkrypcyjne mogą regulować transkrypcję genów prowadzoną zarówno przez polimerazę RNJA II, jak i przez RN A Pol III.
Terminacja transkrypcji prowadzonej przez RNA Pol III wymaga jedynie rozpoznania przez polimerazę prostej sekwencji nukleotydowej. Sekwencja ta to ciąg reszt d A, a wydajność terminacji transkrypcji w tym rejonie zależy od sekwencji nukleotydowych otaczających trakt.
POLIMERAZA II – promotory I i sekwencje wzmacniające
Polimeraza RNA II znajduje się w nukleoplazmie. Jest odpowiedzialna za transkrypcję wszystkich genów kodujących białka i niektórych genów małych jądrowych RNA. Pre-mRNA musi zostać poddany obróbce zwanej dojrzewaniem. Polega ona na utworzeniu kapu na końcu 5' RNA, przyłączeniu poli(A) do końca 3' mRNA oraz wycięciu intronów poprzez splicing
Promotory
Wiele eukariotycznych promotorów zawiera sekwencję zwaną kasetą TATA, znajdującą się w przybliżeniu między nukleotydami 25-35 powyżej miejsca startu transkrypcji. /). W kasetę wchodzi 7 nukleotydów o najwyższej zgodności (ang. consensus sequence) 5'-TATA(A/T)A(A/T)-3'. Obecnie wiadomo, że białko wiążące się z kasetą TATA, TBP, wiąże się z sekwencją 8 pz, w skład których wchodzi dodatkowy nukleotyd na końcu 3' konserwatywnej sekwencji, a którego znaczenie jakościowe nie jest istotne. Funkcja bloku TATA przypomina funkcję sekwencji promotorowej -10 u E. coli, to znaczy, polega ona na prawidłowym ulokowaniu RNA Pol II dla inicjacji transkrypcji. O ile sekwencja nukleotydowa wokół kasety TATA jest krytyczna dla transkrypcji, o tyle sekwencja między blokiem TATA a miejscem startu transkrypcji taką nie jest. Niemniej jednak odległość między blokiem TATA a miejscem startu jest istotna. W około 50% przypadków, nukleotydem rozpoczynającym transkrypcję jest reszta adeniny. Niektóre eukariotyczne geny zawierają element inicjatorowy zamiast kasety TATA. Element inicjatorowy znajduje się w rejonie miejsca inicjacji transkrypcji. Wiele elementów inicjatorowych zawiera C w pozycji -1 i A w pozycji +1. Inne promotory nie zawierają ani kasety TATA, ani elementu inicjatorowego
Inne elementy powyżej genu regulujące transkrypcję
Dwoma typowymi przykładami są blok SP1, który znajduje się powyżej genów zarówno mających, jak i nie mających kasety TATA, oraz blok CC A AT. Przed genami może być jedna, obie lub wiele kopii tych sekwencji. Sekwencje te, znajdujące się często w rejonie 100-200 pz powyżej promotora, nazywa się elementami regulującymi znajdującymi się „powyżej" genu. Pełnią one ważną rolę, zapewniając wydajną transkrypcję genu.