Trzy polimerazy RNA

Eukariotyczne polimerazy RNA

Mechanizm transkrypcji u Eukaryota jest podobny do mechanizmu prokariotycznego. Ponieważ jednak u Eukaryota z aparatem transkrypcyjnym jest wiązana znacznie większa liczba polipeptydów, proces ten jest bar­dziej skomplikowany. Za transkrypcję różnych klas genów eukariotycz­nych są odpowiedzialne trzy polimerazy RNA. Obecność trzech różnych polimeraz RNA stwierdzono w trakcie oczyszczania chromatograficz­nego tych enzymów, podczas którego poszczególne aktywności wypły­wały z kolumny przy różnych stężeniach soli. Każda z polime­raz ma inną wrażliwość na izolowaną z grzybów toksynę — a-amanitynę. Właściwość tę wykorzystuje się w celu odróżnienia aktywności polime­raz RNA.

• Polimeraza RNA I (RNA Pol I) transkrybuje większość genów rRNA. Znajduje się w jąderku i jest niewrażliwa na a-amanitynę

• Polimeraza RNA II (RNA Pol II) transkrybuje wszystkie geny kodujące białka i niektóre geny małych jądrowych RNA (snRNA — ang. smali nuclear RNA). Znajduje się w nukleoplazmie i jest bardzo wrażliwa na a-amanitynę

• Polimeraza RNA III (RNA Pol III) transkrybuje geny tRNA, 5S rRNA, U6 snRNA oraz geny kilku innych małych RNA. Znajduje się w nukleo- plazmic i jest stosunkowo mało wrażliwa na a-amanitynę

Oprócz enzymów jądrowych, komórki eukariotyczne zawierają dodat­kowe polimerazy RNA w mitochondriach i chloroplastach.

Podjednostki polimeraz RNA

Wszystkie trzy polimerazy są dużymi enzymami zawierającymi 12 lub więcej podjednostek. Geny kodujące dwie największe podjednostki każ­dej z polimeraz wykazują względem siebie homologię (spokrewnione sek­wencje DNA). Wszystkie polimerazy eukariotyczne mają podjednostki wykazujące homologię do podjednostek zawartych w rdzeniu polimerazy RNA E coli. Największa podjednostka każdej z eukariotycznych polimeraz przypomina podjednostkę V polimerazy E. coli, natomiast druga co do wielkości podjednostka tych polimeraz podobna jest do podjednostki p, zawierającej miejsce aktywne enzymu E. coli. Funkcjonalne znaczenie tych homologii wspiera następująca obser­wacja: druga co do wielkości podjednostka wszystkich polimeraz eukario­tycznych również zawiera miejsce aktywne enzymu. Dwie podjednostki wspólne dla RNA poi I i RNA poi III oraz jedna podjednostka specyficzna dla RNA Pol II wykazują homologię do podjednostki a polimerazy RNA z E. coli. Przynajmniej pięć innych mniejszych podjednostek jest wspól­nych dla trzech eukariotycznych polimeraz. Dodatkowo każda z polime­raz zawiera cztery do siedmiu innych podjednostek, specyficznych dla każdej z nich.

Aktywności eukariotycznych polimeraz RNA

Podobnie jak w przypadku bakteryjnych polimeraz RNA, każdy z euka­riotycznych enzymów katalizuje transkrypcję w kierunku 5'-»3' i syntety­zuje RNA komplementarny do ustawionego antyrównolegle łańcucha matrycy. Reakcja wymaga obecności prekursorów nukleotydowych ATP, GTP, CTP i UTP i do inicjaqi transkrypcji nie wymaga startera. Oczysz­czone eukariotyczne polimerazy RNA, w przeciwieństwie do oczyszczo­nych enzymów bakteryjnych, wymagają obecności dodatkowych białekinicjatorowych umożliwiających im związanie się z promotorem i rozpo­częcie transkrypcji.

Domena CTD polimerazy RNA II

Koniec karboksylowy RNA Pol II zawiera ciąg siedmiu aminokwasów, który w przypadku mysiego enzymu jest powtórzony 52 razy, a w przy­padku drożdżowego 26 razy. Ten heptapeptyd ma następującą sek­wencję Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser i znany jest pod nazwą karboksylo­wej domeny terminalnej. Powtórzenia te są istotne dla funkcji życiowych. Reszty serynowe i nie­które tyrozynowe sekwencji CTD mogą być fosforylowane. Badania in vitro wykazały, że domena ta nie jest fosforylowana w momencie inicjowania transkrypcji, lecz fosforylacja zachodzi w czasie elongacji, gdy tylko polimeraza opuści miejsce promotorowe. Ponieważ RNA Pol II katalizuje transkrypcję wszystkich genów kodujących białka, jest z tego powodu najważniejszym enzymem w badaniach nad zróżnicowaną ekspresją tych genów. Domena C I D okazała się właśnie miejscem związa­nym ze zróżnicowaną aktywacją elongacji transkrypcji.

Geny transkrybowane przez RNA POL I: POWTÓRZENIA GENÓW RYBOSOMOWYCH RNA

RNA Pol I jest odpowiedzialna za ciągłą syntezę rRNA w czasie interfazy. W komórkach ludzkich znajduje się pięć zespołów genów rRNA, każdy zawierający po około 40 kopii tych genów. Zespoły te znajdują się na róż­nych chromosomach. Każdy gen rRNA daje trans- krypt 45S rRNA o długości około 13 000 nt. Pierwotny transkrypt ulega rozcięciu dając po jednej kopii 28S rRNA (5000 nt), 18S rRNA (2000 nt) i 5,8S rRNA (160 nt). Ciągła transkrypcja wielu kopii genów rRNA jest konieczna do wystarczającej produkcji doj­rzałych cząsteczek rRNA, które następnie wchodzą w skład rybosomów.

Funkcja jąderka

Każdy zespół genów rRNA zwany jest organizatorem jąderkowym, jako że jąderko zawiera duże pętle DNA zawierającego zespoły tych genów. Po zakończeniu mitozy rozpoczyna się w komórce synteza rRNA i pojawiają się małe jąderka w miejscach chromosomowego DNA, w których znajdują się geny rRNA. W czasie aktywnej syntezy rRNA, transkrybowane pre-rRNA gromadzą się wzdłuż genów rRNA i mogą być uwidocznione w mikroskopie elektronowym jako tzw. struktury „choinek”. W struktu­rach tych, syntetyzowane transkrypty RNA są gęsto ułożone wzdłuż DNA i odgałęziają się na zewnątrz prostopadle w stosunku do DNA. Krót­kie transkrypty widać przy początku genu, a wydłużają się one w kie­runku jego końca. Koniec genu znajduje się tam, gdzie przestają się poja­wiać transkrypty RNA.

Promotory RNA Pol I

Promotor genów prc-rRNA u ssaków składa się dwóch rejonów kontro­lujących transkrypcję

• Główny rejon zawiera miejsce startu trans­krypcji i otaczające go nukleotydy od -31 do +6. Rejon ten jest istotny dla transkrypcji.

• Dodatkowy rejon kontrolny, o długości 50-80 pz, zwany UCE zaczyna się około 100 nukleotydów powyżej miejsca startu (-100). Rejon UCE jest odpowiedzialny za zwiększenie wydajności transkrypcji od 10-100 razy w porównaniu z wydajnością tego procesu uzyskiwaną tylko z głównego rejonu

Z elementem UCE wiąże się specyficzne białko wiążące DNA, zwane czynnikiem wiążącym się z elementem UCE lub w skrócie — UBF. Czyn­nik UBF wiąże się nie tylko z rejonem UCE, lecz również z początkową częścią głównego rejonu promotorowego. Sekwencje nukleotydowe w obu miejscach wiązania czynnika UBF nie wykazują podobieństwa. Uważa się, że z każdym z tych rejonów promotorowych wiąże się jedna cząsteczka UBF. Dwie cząsteczki UBF mogą się więc wiązać ze sobą poprzez oddziaływania białko-białko, powodując wytworzenie pętli DNA znajdującego się między dwoma rejonami promotora.

Dodatkowy czynnik, zwany czynnikiem selekcyjnym wiąże się z komple­ksem UBF-DNA stabilizując go i oddziałuje z wolną częścią głównego rejonu promotorowego. Związanie SL 1 umożliwia przyłączenie się RNA Pol I do kompleksu i zainicjowanie transkrypcji.

Wykazano, że SL1 składa się z kilku podjednostek. Między innymi w skład tego czynnika wchodzi białko zwane TBP. Wszystkie trzy polimerazy RNA wymagają obecności tego białka w procesie inicjacji transkrypcji. Pozostałe trzy podjednostki SL1 zwane są czynnikami towarzyszącymi TBP lub w skrócie TAF a te podjednostki, które są specyficzne dla transkrypcji prowadzonej przez RNA Pol I, zwane są TAF.

Czynnik zwany I IF-l to element kontrolujący transkry­pcję. IF-l, homolog SL1, wiąże się z tym miejscem, umożliwiając wiązanie RNA Pol I i inicjację transkrypcji. W czasie gdy polimeraza RNA oddala się wzdłuż DNA od miejsca inicjacji, czynnik TIF-I pozostaje tam związany, umożliwiając inicjację transkrypcji kolejnej cząsteczce polimerazy RNA i wielokrotne cykle transkrypcji. Z tego względu jest to bardzo prosty sposób kontroli transkrypcji.

Polimeraza III: transkrypcja genów 5S rRNA i tRNA

Polimeraza RNA III jest kompleksem składającym się przynajmniej z 16 różnych pod jednostek. Podobnie jak RNA Pol II, RNA Pol III znajduje się w nukleoplazmie. RNA Pol III syntetyzuje prekursory 5S rRNA, tRNA, różne snRNA i niektóre cytoplazmatyczne RNA.

Pierwotne transkrypty pochodzące z genów tRNA nazywamy cząstecz­kami prekursorowymi tRNA. Podlegają one procesom dojrzewania, które prowadzą do uzyskania dojrzałych RNA

Rejony kontro­lujące transkrypcję genów tRNA znajdują się poniżej miejsca startu transkrypcji, w obrębie rejonu kodującego, w którym znajdują się dwie bardzo konserwatywne sekwencje nukleotydowe, zwane blokiem A (5'-TGGCNN AGTGG-3') i blokiem 15 (5'-GGTTCG ANNCC-3'). Sekwencje te kodują również ważne fragmenty samej cząsteczki tRNA, zwane pętlą D i pętlą T'FC . Oznacza to, że silnie konserwatywne frag­menty sekwencji tRNA są również silnie konserwatywnymi sekwencjami promotorowymi w genach tRNA.

Zidentyfikowano dwa czynniki tworzące kompleksy z DNA, nie­zbędne do inicjacji transkrypcji prowadzonej przez RNA Pol III. TFI1IC wiąże się z obydwoma blokami promotorowymi A i B. TFII1B wiąże się z DNA 50 pz powyżej bloku A. TFIIIB składa się z trzech podjednostek, jedną z nich jest TBP, główny czynnik inicjatorowy konieczny do aktywności wszystkich trzech polimeraz RNA. Drugą z nich jest BRF (ang. TFIIB-related factor), czynnik wykazujący homologię do czynnika TFIIB — czynnika inicjatorowego dla RNA Pol II. Trzecia podjednostka jest nazywana B”. TFIIIB nie wykazuje specyficzności wiązania z DNA w zależności od sekwencji nukleotydowej, stąd jego miejsce wiązania jest określone poprzez pozycję, jaką zajmuje TFIIIC związany z DNA. FFUIB umożliwia przyłączenie poli­merazy III RNA i następnie zainicjowanie transkrypcji. Jeśli TFIIIB zosta­nie raz związany z kompleksem inicjatorowym, można usunąć TFIIIC bez towarzyszącego temu negatywnego wpływu na transkrypcję. TFIIIC jest więc czynnikiem odpowiedzialnym za budowę kompleksu inicjatorowego poprzez odpowiednie umiejscowienie czynnika inicjatorowego TFIIIB.

Geny 5S rRNA

Jednym z rybosomowych RNA jest 5S rRNA, transkrybowany przez polimerazę RNA III. Jest to jedyny rRNA transkrybowany niezależnie. Tak jak inne geny rRNA transkrybowane przez RNA polimerazę I, geny 5S rRNA są zor­ganizowane w zespoły, w których są ułożone tandemowo. U człowieka występuje tylko jeden zespół zawierający około 2000 tych genów. Promotory genów 5S rRNA znajdują się w obrębie sekwencji kodującej. Są to: blok C występujący 81-99 pz poniżej startu transkrypcji i blok A zawie­rający się między pozycjami +50 a +65.

Promotorowy blok C genów 5S rRNA jest miejscem wiązania specyficz­nego białka wiążącego się z DNA, TFII1A. TFIIIA jest czynnikiem organizującym, który umożliwia oddziaływania TFIIIC z promotorem 5S rRNA. Blok A może pełnić również funkcje stabilizujące wiązanie TFIIIC. TFIIIC zostaje w ten sposób związany z DNA w miejscu, którego odległość od miejsca startu transkrypcji jest taka sama jak w przypadku genów tRNA. Raz związany TFIIIC umożliwia przyłączenie TFÍIIB, następnie polimerazy RNA III i rozpoczęcie transkrypcji.

Inne promotory dla RNA Pol III

• gen małego jądrowego RNA U6- zawiera charak­terystyczny blok A- nie jest niezbędny do transkrypcji

• gen małego RNA wirusa Epsteina-Barr

znajdują się się powy­żej miejsca startu transkrypcji. Sekwencja nukleotydowa powyżej rejonu kodującego U6 snRNA zawiera typowe sekwencje promotorowe dla RNA Pol II, włączając w to kasetę TATA ) zlokalizowaną między pozycjami nukleotydowymi -30 do -23. Wspólne czynniki transkrypcyjne mogą regulować trans­krypcję genów prowadzoną zarówno przez polimerazę RNJA II, jak i przez RN A Pol III.

Terminacja transkrypcji prowadzonej przez RNA Pol III wymaga jedynie rozpoznania przez polimerazę prostej sekwencji nukleotydowej. Sekwencja ta to ciąg reszt d A, a wydajność terminacji transkryp­cji w tym rejonie zależy od sekwencji nukleotydowych otaczających trakt.

POLIMERAZA II – promotory I i sekwencje wzmacniające

Polimeraza RNA II znajduje się w nukleoplazmie. Jest odpowiedzialna za transkrypcję wszystkich genów kodujących białka i niektórych genów małych jądrowych RNA. Pre-mRNA musi zostać poddany obróbce zwa­nej dojrzewaniem. Polega ona na utworzeniu kapu na końcu 5' RNA, przyłączeniu poli(A) do końca 3' mRNA oraz wycięciu intronów poprzez splicing

Promotory

Wiele eukariotycznych promotorów zawiera sekwencję zwaną kasetą TATA, znajdującą się w przybliżeniu między nukleotydami 25-35 powyżej miejsca startu transkrypcji. /). W kasetę wchodzi 7 nukleotydów o najwyższej zgodności (ang. consensus sequence) 5'-TATA(A/T)A(A/T)-3'. Obecnie wiadomo, że białko wiążące się z kasetą TATA, TBP, wiąże się z sekwencją 8 pz, w skład których wchodzi dodatkowy nukleotyd na końcu 3' konserwatywnej sekwencji, a którego znaczenie jakościowe nie jest istotne. Funkcja bloku TATA przypomina funkcję sekwencji promotorowej -10 u E. coli, to zna­czy, polega ona na prawidłowym ulokowaniu RNA Pol II dla inicjacji transkrypcji. O ile sekwencja nukleotydowa wokół kasety TATA jest krytyczna dla transkrypcji, o tyle sekwencja między blo­kiem TATA a miejscem startu transkrypcji taką nie jest. Niemniej jednak odległość między blokiem TATA a miejscem startu jest istotna. W około 50% przypadków, nukleotydem rozpoczynającym transkrypcję jest reszta adeniny. Niektóre eukariotyczne geny zawierają element inicjatorowy zamiast kasety TATA. Element inicjatorowy znajduje się w rejonie miejsca inicjacji transkrypcji. Wiele elementów inicjatorowych zawiera C w pozy­cji -1 i A w pozycji +1. Inne promotory nie zawierają ani kasety TATA, ani elementu inicjatorowego

Inne elementy powyżej genu regulujące transkrypcję

Dwoma typowymi przykładami są blok SP1, który znajduje się powyżej genów zarówno mających, jak i nie mających kasety TATA, oraz blok CC A AT. Przed genami może być jedna, obie lub wiele kopii tych sekwencji. Sekwencje te, znajdujące się często w rejonie 100-200 pz powyżej promotora, nazywa się elementami regulującymi znajdu­jącymi się „powyżej" genu. Pełnią one ważną rolę, zapewniając wydajną transkrypcję genu.