Podstawowe metody i technik stosowqne w enzymologii - izolowanie, oczyszczanie i charakteryzowanie białek (enzymów).©

Izolacja białek

• Głowne zajęcie biochemików i biologów molekularnych

• Tysiące procedur oczyszczania białek opisanych w publikacjach naukowych

• BRAK JEDNEJ WSPÓLNEJ RECEPTURY OCZYSZCZANIA

  Etapy izolacji i oczyszczania (preparatyki) białek

1. Homogenizacja materiału badawczego - dezintegracja komórek

2. Wirowanie bądź ultrawirowani

3. Wstępne oczyszczanie

4. Chromatografia (selektywne metody frakcjonowania)

5. Elektroforeza (selektywne metody frakcjonowania)

   Stabilizacja białek podczas całej procedury izolacji i oczyszczania:

• Środowisko wodne (obecność soli, glicerol lub sacharoza - 10℅ kiedy izolujemy białka błonowe) wsalanie białek - pozostawanie białek w formie natywnej w obecności konkretnej ilości soli

• Dobór odpowiedniego buforu (pH, czynniki stabilizujące - substancje redukujące np. Beta - merkaptoetanol, cysteina, DTT, glutation - przeciwdziałają utlenieniu grup -SH w białkach)

• Inhibitory peptydaz (enzymów proteolitycznych)

• Niska temperatura (4 st)

• Przechowywanie - odpowiednie warunki

  Kontrola po każdym etapie:

• Stężenie białka (metody fotometryczne)

• Aktywność enzymu

• Liczbę białek w preparacie (elektroforeza analityczna)

  Zapobieganie proteolizie oczyszczanych enzymów

1. utrzymywanie odpowiednio niskiej temperatury

2. Obecność inhibitorów peptydaz

3. W niektórych przypadkach - ultrafiltracja z limitem odcięcia <30kDa

   Inhibitory peptydaz:

   Fluorek fenylometylosulfonylu - inhibitor peptydaz serynowych i cysteinowych

   Pepstatyna A

   E-64 - inhibitor wyłącznie peptydaz cysteinowych

   EDTA - inhibitor metalopeptydaz

   Dezintegracja komórek - problemy:

1. Komórki zwierzęce : brak ściany, duże rozmiary - jest fajnie

2. Komórki zwierzęce : ściana komórkowa (skrobia, celuloza, barwniki), duże rozmiary

3. Bakterie : sztywna ściana komórkowa, błona zewnętrzna u Gram ujemnych, niewielkie rozmiary, komórki sferyczne

4. Grzyby : bardzo sztywna ściana (chityna/glikan), aktywne enzymy proteolityczne

   - problemy ogólne: utrata mechanizmów kontroli metabolizmumw momencie rozbicia komórek, efekty cieplne związane z zastosowaniem metod mechanicznych - tarcie = ciepełko

   Homogenizacja materiału badawczego

   Metody mechaniczne : moździerz - piasek, ciekły azot, homogenizator ręczny lub elektryczny, vortex - kulki szklane

   Metody fizyczne: sonikacja (działanie ultradźwięków), prasa Frencha (wysokie ciśnienie) - fajne drogie urządzenie z tłokiem, którego naciśnięcie powoduje wzrost ciśnienia w komorze, co za tym idzie w komórkach - potem następuje nagły spadek ciśnienia, dochodzi do rozerwania błon plazmatycznych

   Inne metody fizyczne : szok osmotyczny, szok termiczny

   Inne metody (enzymatyczne) : bakterie : lizozym+DNAza dla G+, lizozym+DNAza +EDTA, detergent niejonowy + lizozym dla G-

   Grzyby : chitynaza + beta-glukanaza, Beta-glukuronidaza

   Kom roślinne : celulaza

   Wirowanie - sedymentacja cząstek pod wpływem siły odśrodkowej

   Wstępne oczyszczanie ( metody o niskiej selektywności)

   - rozpuszczalność białek w roztworach wpdnych wynika z obecności na ich powierzchni polarnych i zjonizowanych łańcuchów bocznych aminokwasów

   - każdy czynnik zaburzający interakcję woda-białko zmniejsza tę rozpuszczalność

   - rozpuszczalność białka wynika z różnic w składzie aminokwasowycm

   Czynniki powodujące precypitację białek:

• Sole nieorganiczne (siarczan amonu) - wysalanie

• Rozpuszczalniki organiczne (aceton, metanol, etanol -20 st) - osuszenie

• Glikol polietylenowy (polimer niejonowy)

• pH (np. wykwaszanie białek o niskim pI, węglan sodu > pH 8)

• Temperatura (białka termolabilne) - bardzo termostabilne enzymy - polimerazy

  - możliwie krótka ekspozycja na działanie czynnika

  - możliwie niska temperatura (2-4 st)

  Wytrącanie białek poprzez zmianę pH:

  -rozpuszczalność białek zależy od pH roztworu

  -rozpuszczalność danego białka jest najmniejsza przy pH = pI

  Np. Iminona peptydaza prolinowa z kiełkującyh ziarniaków zbóż

  Frakcjonowanie rozpuszczalnikami organicznymi:

  -białka wytrącane są w wyniku dodania do roztworu mieszających się z wodą, niedenaturujących rozpuszczalników organicznych

  -najczęściej stosowane: aceton, etanol

  Wysalanie białek :

  -białka ulegają odwodnieniu i wypdają z roztworu w wyniku zwiększenia jego siły jonowej po dodaniu soli (siarczan amonu, siarczan sodu)

  Zagęszczanie roztworów białek -później rozc preparatu białkowego podczas rozdziału chromatograficznego

• Dodanie ziaren suchego, porowatego polimeru (sephadex G25) wielkość porów musi być tak dobrqna, aby nie wnikały w nie cząsteczki białek

• Usunięcie nadmiaru wody oraz niewielkich cząsteczek przez dyfuzję poprzez półprzepuszczalną membranę (ultrafiltracja)

  materiały używane do otrzymywania błon półprzepuszczalnych:

  - octan celulozy

  - poliwęglan

  -poliamidy

  - PCW

  - polisulfon

• Usunięcie wody pod zmniejszonym ciśnieniem (liofilizacja)

  Chromatografia cieczowa (selektywna metoda rozdziału mieszanin)

• Metoda fizykochemiczna

• Podział składników między dwie fazy (stacjonarną i ruchomą)- faza ruchoma jest cieczą, faza stacjonarna jest ciałem stałym

• Najefektywniejsza z metod oczyszczania białek

• Różne tempo przemieszczania się składników mieszaniny wynika z ich różnego powinowactwa do fazy stacjonarnej

  • Chromatografia sita molekularnego - kształt i wielkość cząsteczek

  • Chromatografia jonowymienna - wypadkowy ładunek cząsteczek

    - rodzaje złóż: anionity (wymieniają aniony), kationity (wymieniają kationy)

    - silne S, słabe W

    - anionity : DEAE, QAE

    - kationity: CM, SP, S

    - jeżeli pH>pI używamy anionitu

    - jeżeli pH<pI używamy kationitu

1. Dobór rodzaju złoża

2. Dostosowanie rodzaju buforu do rodzaju złoża (dla a, bufory k; dla k, bufory a)

3. Naniesienie próbki w roztworze o niskiej sile jonowej, nie więcej niż 50 milimoli

4. Eluacja - wzrastający gradientem soli, gradiengem pH, gradientem amfolitu (chromatoogniskowanie)

   + zagęszczenie próbki, brak ograniczeń objętości próbki nanoszonej na kolumnę, łagodne warunki nanoszenia i elucji, wysoka rozdzielczość

   - bezwględma konieczność zachowania niskiej siły jonowej próbki, białka eluowane z kolumny roztworem o wywokiej sile jonowej

   • Chromatografia adsorbcyjna - polarność

   • Chromatografia powinowactwa - powinowactwo do ligandu

     Techniki chromatograficzne:

• Formulacja nośnika:

  • Bibułowa (nośnik w bibule)

  • Cienkowarstwowa

  • Kolumnowa (nośnik w kolumnie chromatograficznej)

• Różnice w ciśnieniach przepompowania fazy ruchomejmprzez stacjonarną

  • LPLC - niskociśnieniowa chromatografia cieczowa

  • FPLC - szybka chromatografia cieczowa

  • HPLC - wysokociśnieniowa wysokosprawnościowa chromatografia cieczowa

    ---różnią się rodzajem złóż i przyłożonym ciśnieniem, zasada rozdziału pozosttaje taka sama