REPLIKACJA DNA

Mechanizm semikonserwatywny
Podczas replikacji dwie nici rodzicielskie rozplatają się i każda działa jako matryca do prowadze­nia, katalizowanej przez enzym, syntezy nowej, komplementarnej nici potomnej. Synteza postępuje według normalnych reguł parowania zasad (A z T; G z C). Dwie nowo powstałe dwuniciowe cząsteczki przechodzą następnie, w trakcie podziału komórkowego, do dwóch komórek poto­mnych. Miejsce, w którym zachodzi rozdzielenie nici i synteza nowego DNA, jest znane jako widełki replikacyjne. Mechanizm semikonserwatywny został dowiedziony przez Meselsona i Stahla poprzez zastosowanie izotopu ciężkiego azotu ¹⁵N. Eksperyment Meselsona-Stahla udowodnił, że replika­cja DNA w żywych komórkach przebiega zgodnie z semikonserwatywnym schematem Watsona i Cricka, co wskazywało na to, że komórki muszą mieć sposób na rozwiązanie problemu topologicznego podwójnej helisy. Sposób ten został poznany przez biologów molekularnych dopiero 25 lat później, po odkryciu i scharakteryzowaniu grupy nowych enzymów na­zwanych topoizomerazami.

Topoizomerazy DNA są enzymami odpowiedzial­nymi za katalizowanie reakcji przecinania i łączenia polinukleotydowych łańcuchów DNA. W zależności od metody działania wyodrębniono trzy typy topoizomeraz DNA:

• Topoizomerazy typu IA wprowadzają przecięcie do jednego łańcucha polinukłeotydowego i przecis­kają drugi łańcuch przez utworzoną przerwę. Końce przerwanego łańcucha ulegają następnie ligacji. Ten sposób działania powoduje, że liczba skrętów podwójnej helisy ulega zmniejszeniu o jeden (liczba wskazująca, ile razy jeden łańcuch krzyżuje się z drugim w kolistej cząsteczce DNA).

• Topoizomerazy typu IB działają w sposób iden­tyczny jak typu IA, lecz według innego mechaniz­mu. Topoizomerazy typu IA i IB różnią się między sobą w budowie i prawdopodobnie ewoluowały nieza­leżnie od siebie.

• Topoizomerazy typu II przecinają jednocześnie oba łańcuchy polinukleotydowe tworząc „bramkę", przez którą cały sąsiedni segment podwójnej helisy zostaje przesunięty. Działanie takie powoduje zmianę liczby skrętów o dwa.

Wszystkie cząsteczki DNA repli­kują się w ten sam sposób. Nici matrycy są czytane w kierunku 3'5', podczas gdy nowe nici są syntetyzowane w kierunku 5’3’ Substratami dla syntezy DNA są 5'-trifosforany deoksyrybonukłeozydów (dNTP): dATP, dCTP, dGTP i dTTP. Mechanizm reakcji polega na ataku nukleofilowyni grupy 3'-OH nukleotydu z końca 3' nici podle­gającej wydłużaniu — na atom fosforu α w dNTP komplementarnym do następnej zasady w matrycy, po czym uwalnia się pirofosforan. Energia do polimeryzacji pochodzi częściowo z hydrolizy dNTP, a częściowo z hydrolizy uwolnionego pirofosforanu.

Proces replikacji składa się na trzy etapy:

• Inicjacja obejmuje rozpoznanie miej­sca (lub miejsc) w obrębie cząsteczki DNA, od którego (których) replikacja się rozpoczyna

• Elongacja obejmuje procesy związane z działaniem widełek replikacyjnych podczas ko­piowania rodzicielskich łańcuchów polinukleotydowych.

• Terminacja jest procesem, który dotychczas poznano w sposób niedostateczny. Ter- minacją określamy proces kończenia i ostatecznego kompletowania nowych łańcuchów DNA.

Replikony, miejsca inicjacji i terminacji

Replikon - każdy odcinek DNA, który replikuje się jako pojedyncza jednostka.

Inicjacja replikacji DNA w replikonie zawsze następuje w stałym miejscu, określanym jako miejsce inicjacji replikacji. Zwykle powstaje para widełek replikacyjnych, które rozchodzą się w dwóch kierunkach od miejsca inicjacji, aż do osiągnięcia miejsca terminacji.

• Wszystkie chromosomy prokariotyczne, podobnie jak wiele bakteriofagowych i wirusowych cząsteczek DNA, występują w postaci kolistej i stanowią jeden replikon. A zatem występuje w nich jedno miejsce terminacji, oddalone o około 180° od pojedynczego miejsca inicjacji. Wirusowe cząsteczki DNA, występujące w posta­ci liniowej, zwykle mają jedno miejsce inicjacji, które niekoniecznie znajduje się w środku cząsteczki. We wszystkich tych przypadkach miej­sce inicjacji jest złożonym regionem, w którym zachodzi regulacja inicjacji replikacji DNA oraz koordvnacja replikacji z cyklem wzrostu organizmu.

• Długie, liniowe cząsteczki chromosomów eukariotycznych posiadają wiele replikonów, z których każdy ma własne miejsce inicjacji. Typowa komórka ssaka zawiera 50 000-100 000 replikonów, o wielkości 40-200 kpz. Kiedy widełki replikacyjne, należące do sąsiadujących ze sobą „oczek replikacyjnych" spotykają się, ulegają fuzji tworząc w pełni zreplikowaną cząsteczkę DNA. Sekwencje eukariotycznych miejsc ini­cjacji replikacji są znacznie prostsze od tych, które występują w cząstecz­kach DNA będących jednym replikonem. Dzieje się tak, ponieważ kon­trola replikacji eukariotycznego DNA zachodzi przede wszystkim poprzez decyzję o wejściu komórki w fazę S, a nie na drodze regulacji inicjacji osobno w każdym z miejsc początku replikacji. Wszyst­kie miejsca inicjacji mają sekwencje bogate w pary AT, w których nastę­puje początkowe rozplecenie nici. Regiony bogate w AT o wiele łatwiej mogą być rozplecione niż regiony bogate w GC.

Replikacja nieciągła

W replikacji semikonserwatywnej, w każdych widełkach replikacyjnych, synteza obu nowych nici DNA zachodzi równocześnie. Dużą frakcję nowo zsyntetyzowanego DNA stanowią małe fragmenty odługości 1000-2000 pz (100-200 pz u eukariotów). Są to fragmenty Okazaki, które szybko wiążą się w DNA o dużej masie cząsteczkowej