Elektroforeza- zjawisko elektrokinetyczne , w którym pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego przemieszczają się makrocząsteczki obdarzone niezrównoważonym ładunkiem elektrycznym .

Przyłozenie pola elektrycznego do wodnego roztworu elektrolitu zawierającego makroczasteczki obdarzone niezrównoważonym ładunkiem elektrycznym zawsze powoduje ruch janów , elektrolitu i makrojonów w kierunku elektrody o przeciwnym znaku niż znak ładunku.

• Prędkość przemieszczania się naładowanej elektrycznie makrocząsteczki zależy od jej ładunku , rozmiaru , kształtu, oporów ruchu środowiska

• Zalety : szybka separacja, proste urządzenia, niskie koszta

• Zastosowanie: biochemia białek , kwasów nukleinowych, biologia molekularna, farmakologia, medycyna sadowa- odciski palców, weterynaria, diagnostyka, kontrola jakości żywności

Jony, makrojony posiadają otoczkę hydratacyjną- uporządkowany układ dipoli wodnych związanych z jonami słabymi siłami oddziaływania elektrostatycznego . zasięg uporządkowania jest niewielki ale bardzo wpływa na ruch jonów i makrojonów.

Właściwości otoczki zależą od rozmiarów jonów ale także od ładunku, siły jonowej pH.

Siła jonowa : funkcja stężenia jonów tworzących elektrolit

1. faza początkowa wzrostu siły jonowej- odl. miedzy otoczkami jonów duże - wzrost przewodności jonowej wraz ze wzrostem liczby nośników ładunku elektrycznego. gdy stężenie jonów jest niskie to niedobór nośników ład el , wzrost oporności el.

2. dalszy wzrost siły jonowej - zageszczenie jonów - rola w ruchu w polu el. Ogdrywa tarcie wyst.pomiędzy otoczkami -przewodnictwo spada., ograniczenie ruchliwości jonów

3. najkorzystniej gdy równomierny rozkład jonów i makrojonów .

wartość pH : miara stężenia jonów wodorowych w elektrolicie

1. znaczenie dla białek peptydów

2. białka i peptydy: własności amfoteryczne- ładunek + lub - w zależności od środowiska co jest związane z obecnością aminokwasów tworzących białka reszty aminokwasowe mogą być zarówno kwaśne jaki i zasadowe; ładunek el białek pochodzi z jonizacji bocznych łańcuchów karboksylowych jonizacja zależna od pH

3. wypadkowy ładunek elektryczny cząst białka zależy od wartości pH

4. pH w którym ładunek el ( wypadkowy)= zero punkt izoelektryczny (pI)

5. w środowisku o pH<pI białko posiada ład dodatni i migruje do elektrody ujemnej

6. skuteczna separacja elektroforetyczna gdy pH jest stałe w elektrolicie

7. kwasy nukleinowe zawsze ładunek ujemny bo posiadają silny kwas fosforanowy

parametry elektryczne :

• elektroforeza zachodzi dzięki obecności pola elektrycznego

• siła z jaką pole oddziałuje na ładunek elektryczny jonu jest proporcjonalna do natężenia tego pola

• natężenie pole jest proporcjonalne do napięcia U przyłożonego do elektrod

• gdy niska siła jonowa napięcie= natężenie * opór

zasilacze stosowane do elektroforezy przeważnie utrzymują stała wartość napięcia natężenia lub oporu lub mocy P ,dla innych parametrów ustala się górny zakres wartości

w trakcie trwania elektroforezy oporność elektrolitu ulega zmianom: spada ze wzrostem temp, rośnie im mniej jonów

• w warunkach SDS elektroforezy przy stałym prądzie(stałe natężenie) wzrost oporności układu, wzrost ilości wydzielanego ciepła układ wymaga aktywnego odprowadzania ciepła.

• Gdy stałe napięcie gdy R wzrasta to I maleje mniej oddawanego ciepła(spadek) dłuższy czas trwania elektroforezy

• Stałe pH , stabilizacja prądu spadek oporności to spadek oddawanego ciepła

• Stałe pH, stabilizacja napięcia wzrost prądu, i ilości oddawanego ciepła

Stabilizacja poszczególnych parametrów zależy od czasu trwania elektroforezy, ograniczenia dyfuzji molekuł , strat aktywności biologicznych molekuł

Zwykle elektroforezę w żelu poliakrylamidowym prowadzi się przy stałym prądzie białka ; przy stałym napięciu kwasy nukleinowe; stała moc żele sekwencyjne ( oporność żelu silnie wzrasta wraz z czasem trwania rozdziału)

Temperatura : utrzymanie temp.na zadanym poziomie osiagniecie zadawalajacych efektów

Nadmiar ciepła:

• Powstawanie prądów konwekcyjnych nieregularności w porowatości i sieciowaniu nośnika

• Nierównomierne przemieszczenie frontu elektroforezy

• Migracja dubletów prążkowych

• Denaturacja i inaktywacja separowanych białek straty

• Topnienie żeli agarozowych

• Pękanie szklanych płyt

Rodzaje nośników elektroforetycznych

Nośniki elektroforetyczny : bibuła, azotan celulozy, agaroza, poliakrylamid

Stabilizacja elektrolitu , separacja mikrocząsteczek , dzięki czemu rozdział elektroforetyczny może być prowadzony w całej objętości elektrolitu

agaroza, poliakrylamid frakcjonowanie cząsteczek na zasadzie sita molekularnego.

Nośnik powinien być zawsze elektrycznie obojętny aby nie oddziaływa z ładunkiem el makrocząsteczki zmiana prędkości migracji aż do zatrzymania makrojonu

ELEKTROENDOSMOZA- gdy nosnik posiada ładunek czasteczki wody migrują w kierunku katody .

agaroza	akrylamid
Nośnik o ubogim usieciowieniu i większych porach	nośniki o gęstym usieciowieniu i niewielkich porach
Separacja większych cząsteczek białkowych np. multimeryczne cząsteczki czynnika VON Willebranda 1-10 M , immunoglobin 1M , większe fr kwasów nukleinowych 50 - 30000 bp	Separacja makrocząsteczek białkowych o masach rzędu 5K- 300K Polinukleotydów 5-2000 par zasad
Żele agarozowe Polisacharyd agar- agar składający się z agarozy i agaropektyny , biały, żółty proszek Łatwo rozpuszcza się w gotującej się wodzie w stanie płynnym aż do 40 stopni C Poniżej 40 - zestala się w postaci porowatego żelu . Porowatość reguluje się zmieniając stężenie agarozy wyższe stężenie - bogatsze usieciowienie, mniejsze pory. Zazwyczaj stężenie 0.4- 4.0 % Łatwa, szybka w przygotowaniu Forma dokumentowania- nie można ich dokumentować jak żele poliakrylamidowe. Sporzadzenie fotografii	Żele poliakrylamidowe Monomer akrylamidu i substancje sieciujące . Monomer silna neurotoksyna Gęstość usieciowienia i rozmiar porów reguluje się przez dobór stężenia akrylamidu i bisakrylamidu Długie przygotowanie, trudne Forma dokumentowania- można wysuszyć ( te które maja poniżej 15 % akryl amidu ,te powyżej pękają) Pomiędzy warstwa bibuły i celofanu. Wysuszony żel można przechowywać dowolnie długo.

Żele poliakrylamidowe mają przewagę nad żelami agarozowymi z kilku przyczyn:

● zdolność rozdzielcza żeli poliakrylamidowych jest tak duża, że można rozdzielać cząsteczki

DNA różniace się o 1 p.z.

● studzienkę żelu poliakrylamidowego można załadować znacznie większą ilością DNA niż w

żelu agarozowym

● DNA odzyskany z żelu poliakrylamidowego jest czysty (nie wymaga dodatkowego

czyszczenia przy stosowaniu w biologii molekularnej)

SDS- wartości denaturujące

EDTA,PMSF- inhibitory proteaz serynowych

1. Izolacja DNA plazmidowego - metoda lizy alkalicznej

ETAP 1

1. liza komórek bakteryjnych

2. denaturacja białek

3. Denaturacja Dna roztworami zasadowycmi

ETAP 2

1. pokomórkowy gruz jest strącany - w roztworze pozostają tylko cząsteczki plazmidów

ETAP 3

1. renaturacja plazmidu ( szybsza niż chromosomu) bardzo szybka po usunięciu czynnika renaturujacego

2. roztwór Gl3 zobojętnia środowisko i powoduje wytracenie DNA chromosomowego i białek

3. otrzymany plazmid może być oczyszczony na mikrokolumnach

Istotny w tej metodzie jest czas- denaturacji alkalicznej - zbyt długie przetrzymanie DNA w roztworach zasadowych powoduje nieodwracalna denaturację .

kolumny- - zasada działania opiera się na zdolności DNA do adsorpcji na powierzchni krzemionki w obecności związków chaotropowych. Oczyszczanie.

1. Klonowanie - uzyskiwanie zwielokrotnionej liczby genetycznie identycznych komórek

Klonowanie DNA- powielanie wyizolowanych odcinków DNA za pośrednictwem wektorów plazmidowych ( plazmid może być wektorem ponieważ ma zdolność do samodzielnej replikacji )

1. dobrany enzym restrykcyjny tnie na fragmenty DNA przeznaczone do klonowania oraz przecina DNA plazmidów

2. enzym ligaza łączy pocięte fragmenty ligacja, powstają cząsteczki zrekombinowanego DNA , w których fragment DNA jest włączony do plazmidów

3. zrekombinowany plazmid zostaje wprowadzony do bakterii na drodze transformacji

4. w toku kolejnych podziałów bakteria wytwarza klon komórek, z których każda zawiera zrekombinowane plazmidy z klonowanym DNA klonowanie DNA

Klonowanie-Enzymy restrykcyjne- restryktazy

• enzymy wyizolowane z bakterii

• należą do endonukleaz- tną wewnątrz cząsteczki

• enzymy klasy II -tną dwuniciowy Dna w obrębie lub w określonym miejscu sekwencji nukleotydowej ( palindromowe4-6; sekwencje 5-8)

• dany rodzaj enzymu przecina DNA zawsze w ten sam sposób

• mapa restrykcyjna- wzajemne ułożenie miejsc rozpoznawanych przez określony zbiór restryktaz

• mogą ciąć pozostawiając lepkie lub tępe końce

wektory bakteryjne - nośniki fragmentu DNA , które ma być sklonowane ;

zawieraja:

• ORI - miejsce inicjacji replikacji

• MARKER I- znajdujący się w wektorze gen pozwalający odróżnić bakterie posiadające plazmid od tych co je nie posiadają

• MARKER II - pozwala odróznic bakterie , które pobrały plazmid bez wstawki , od tych które otrzymały plazmid zrekombinowany

• POLILINKER- niewielki sztucznie utworzony odcinek DNA , zawierajacy sekwencje rozpoznawane [rzez wiele enzymów restrykcyjnych; pojedynczemiejsca ciecia w wektorze.; wstawiony wobrebie drugiego markera

Wektory bifunkcjonalne- Wektory bifunkcjonalne to wektory, które zawierają elementy umożliwiające ich powielanie i selekcję w komórkach dwóch gospodarzy

Wektory ekspresyjne- umożliwiają ekspresję wstawionej do nich sekwencji DNA

kodującej białko. Wektory bakteryjne, które służą do otrzymywania białka eukariotycznego

muszą posiadać dodatkowe elementy takie jak:

Sekwencja promotorowa - silny promotor umiejscowiony przed miejscem wprowadzenia

sekwencji kodującej. Może być konstytutywny albo regulowany.

Sekwencja Shine-Dalgarno (SD=RBS) - miejsce wiązania rybosomów bakteryjnych.

Sekwencja ATG może pochodzić ze wstawki albo również znajdować się na wektorze.

Terminator transkrypcji - za sekwencją kodującą

2. Transformacja bakterii

1. sorpcja DNA na powierzchni komórki bakteryjnej

2. transport zasorbowanej cząsteczki do wnętrza komórki

3. właczenie DNAdo genomu

4. fenotypowe procesy zewnętrznego wyrażania nowej cechy

wyrózniamy kilka metod transformacji:

• wykorzystywanie naturalnej kompetencji niektórych komórek bakteryjnych

• indukcja kompetencji ( zastosowanie chlorku wapnia) -bakterie traktowane są zimnym roztworem CaCl2 , a następnie szybko ogrzane pobierają DNA plazmidowy z otoczenia

• elektroporacja(przyłozone napiecie(?))

• protoplastyzacja komórek

wydajność transformacji zalezy od:

• szczepu bakterii

• fazy wzrostu komórki

• ilości i wielkości DNA użytego do transformacji

• czasu inkubacji DNA z komórkami kompetentnymi

Łańcuch DNA

---