Microsoft PowerPoint Enzymologia cz I

dr in

. Aneta Białkowska

(pokój 322; aneta.bialkowska@p.lodz.pl)

ENZYMOLOGIA

WYKŁAD – 15 GODZIN

LABORATORIUM – 15 GODZIN (II POŁOWA
SEMESTRU)

FORMA ZALICZENIA WYKŁADU I
LABORATORIUM –

KOLOKWIUM PISEMNE

dr inż. Aneta Białkowska

LITERATURA:

1. Witwicki, Ardelt, 1989, Warszawa PWN – „Elementy enzymologii”

2. Kafarski, Lejczak, 1994, Warszawa PWN – „Chemia bioorganiczna”

3. Szlegel,1996, Warszawa PWN – „Mikrobiologia ogolna”

4. Whitaker, Voragen, Wong, 2002, CRC Press – „Handbook of food

enzymology”

5. Bommarius, Bettina, 2004, Wiley-VCH, Weinheim – „Biocatalysis”

6. Kołakowski, Bednarski, Bielecki, 2005, Wydawnictwo Akademii Rolniczej

w Szczecinie – „Enzymatyczna modyfikacja składników żywności”

7. Berg, Tymoczko, Stryer, 2009, Warszawa PWN – „Biochemia”

8. Kłyszejko-Stefanowicz, 2011, Warszawa PWN – „Ćwiczenia z biochemii”

9. Podstawy biotechnologii, 2011, Warszawa PWN

10.Methods of enzymology (wydawnictwo ciagłe, począwszy od 1955 r.)

11.Literatura oryginalna (artykuły w czasopismach)

dr inż. Aneta Białkowska

ENZYMOLOGIA

– PODSTAWOWA CZĘŚĆ BIOCHEMII

DYNAMICZNEJ, ZAJMUJĄCA SIĘ:

poznaniem relacji między strukturą a funkcją
enzymów;

sposobami ich izolowania i oczyszczania;

właściwościami i mechanizmami działania enzymów;

przebiegiem katalizowanych przez nie reakcji;

drogami biosyntezy biokatalizatorów

CO TO JEST BIOKATALIZATOR

ENZYM

(białko globularne)

RYBOZYMY (RNAzymy)

ABZYMY

(PRZECIWCIAŁA-

IMMUNOGLOBULINY)

MIKROZYMY

(

nowa klasa naturalnych, katalitycznych

biocząsteczek, których masy są niższe od 10 kDa)

Katalizatory: enzymy, abzymy, rybozymy mogą być stosowane w
formie:

preparatów o różnej czystości (rozpuszczalnych lub
unieruchomionych)
całych komórek (głównie drobnoustrojów) lub ich fragmentów

dr inż. Aneta Białkowska

CO TO JEST BIOKATALIZATOR

SYNZYMY – biokatalizatory
otrzymane na drodze syntezy
chemicznej lub modyfikacji
genetycznych

DEOKSYRYBOZYMY

(DNAZYMY) - katalityczne DNA

dr inż. Aneta Białkowska

SYNZYMY UZYSKANE NA DRODZE MODYFIKACJI CHEMICZNYCH

Technologia enzymów, dr inż. Aneta Białkowska

Obniżona termostabilność w
celu łatwiejszej inaktywacji w
czasie pasteryzacji przy
produkcji sera

Utlenianie metioniny, takie jak przy
użyciu H

Rennina (szczepy Mucor)

Wzrost aktywności
koagulacyjnej mleka do 2 razy

Acylacja bezwodnikowa

Rennina

Wzrost aktywności do 70 razy

Acylacja N-hydroksybursztynowymi
estrami aminokwasów

Termolizyna (Bacillus
thermoproteolyticus)

Zwiększona aktywność
esterazy i wyeliminowanie
aktywności peptydazy

Acetylacja lub jodowanie tyrozyny w
aktywnym centrum

Karboksypeptydaza A

Zwiększona termostabilność
powyżej 70°C, zmniejszona
termostabilność poniżej 67°C

Acetylacja octanem p-nitrofenolu

-amylaza (Bacillus

subtilis)

Efekt

Modyfikacja chemiczna

Enzym

SYNZYMY UZYSKANE NA DRODZE INśYNIERII GENETYCZNEJ

Technologia enzymów, dr inż. Aneta Białkowska

Zmiany w przedziale
substratów

RM seryna

→

fenyloalanina i inne

Dehydrogenaza

Zmiany w przedziale
substratów

RM seryna

→

fenyloalanina i inne

Amidaza

Zmieniona specyficzność
substratowa

SSM glicyna

226

→

alanina

Trypsyna

Zwiększona
termostabilność

SSM izoleucyna

→

cysteina,

następnie chemiczne sieciowanie

Lizozym

Większa odporność na
wybielanie

Zmieniona specyficzność
substratowa

SSM metionina

222

→

alanina

SSM glicyna

166

→

kwas

asparaginowy i glutaminowy

Subtilizyna

Nowa cecha

Metoda modyfikacji

Enzym

SSM-ukierunkowana mutacja wyizolowanego materiału genetycznego

RM- przypadkowa mutacja genu in situ w organizmie producenta

wysoka specyficzność, selektywność i nietoksyczność

wytwarzanie

enancjomerycznie

czystych

produktów

lub

półproduktów

potanienie procesu

możliwość wielokrotnego wykorzystania (immobilizacja enzymów)

uzyskanie

zmodyfikowanych

produktów

spożywczych

udoskonalonych cechach sensorycznych i przedłużonej trwałości

podniesienie przyswajalności i walorów zdrowotnych żywności
poprzez

usunięcie

składników

szkodliwych

dla

konsumenta

nieprzyswajalnych

i/lub

utrudniających

przyswajanie

innych,

wartościowych komponentów

zastąpienie tradycyjnych procesów chemicznych, niejednokrotnie
uciążliwszych

dla

środowiska

przez

przyjemne

dlań

energooszczędne biotechnologie

pełniejsze wykorzystanie surowców, zmniejszenie ilości odpadów,
mogących negatywnie wpływać na środowisko naturalne

DLACZEGO WARTO STOSOWAĆ ENZYMY (KOMÓRKI)?:

dr inż. Aneta Białkowska

PROBLEMY ZWIĄZANE ZE STOSOWANIEM

ENZYMÓW (KOMÓREK)

niestabilność w zbyt wysokich temperaturach

niestabilność w ekstremalnych pH

niestabilność w rozpuszczalnikach organicznych

inhibicja przez niektóre jony metali

możliwość łatwej degradacji pod wpływem działania enzymów

proteolitycznych

wysoki koszt (np. enzymów z klasy oksydoreduktaz)

konieczność stosowania drogich kosubstratów

czynniki alergenne

dr inż. Aneta Białkowska

ŚWIATOWY RYNEK ENZYMÓW PRZEMYSŁOWYCH

Novozymes (DK) 45%

Others 29%

Danisco/Genencor (DK/USA)

BASF (Germany) 4%

DSM (NL) 5%

Novozymes (DK) 45%

Others 29%

Danisco/Genencor (DK/USA)

BASF (Germany) 4%

DSM (NL) 5%

Rys. Największe firmy biotechnologiczne zajmujące się produkcją enzymów
przemysłowych i ich udział w globalnym rynku tych produktów.

dr inż. Aneta Białkowska

RYNEK ENZYMÓW I JEGO GŁÓWNE SEKTORY

Sektor techniczny

63%

Sektor spożywczy

31%

Sektor

paszowy 63%

dr inż. Aneta Białkowska

ŹRÓDŁA ENZYMÓW

izolowane z roślin

izolowane ze

zwierząt

produkowane

przez

mikroorganizmy

(bakterie,

drożdże, grzyby

strzępkowe

)

Piekarnictwo

Ficyna

Drzewo
figowe

Piekarnictwo,
produkcja syropów
maltozowych

ββββ

-amylaza

Soja,
jęczmień

Hydroliza estrów

Esteraza

Pszenica

Właściwości
przeciwzapalane

Bromelaina

Ananas

Diagnostyka

Peroksydaza

Chrzan

Piekarnictwo,
garbarstwo,
mleczarstwo,
tenderyzacja mięsa

Papaina

Papaja

Diagnostyka

Ureaza

Soja

Zastosowanie

Enzym

Źródło

Lizozym

Jaja kurze

Urokinaza

Ludzki mocz

Pepsyna,
trypsyna

Wątroby
cielęce

Podpuszczka

śołądki cieląt

Enzym

Źródło

dr inż. Aneta Białkowska

1. tańsza produkcja

2. łatwiejsza kontrola produkcji

3. większa dostępność surowców do wzrostu drobnoustrojów

(łatwe przygotowanie podłoży)

4. mniejsza zawartość potencjalnie szkodliwych substancji tj.

związków fenolowych, proteinaz, inhibitorów w komórkach
mikroorganizmów w porównaniu do tkanek roślinnych i
zwierzęcych

DROBNOUSTROJE JAKO ŹRÓDŁO ENZYMÓW:

dr inż. Aneta Białkowska

1. wydajność produkcji enzymu i szybkość jego biosyntezy

2. czystość wytwarzanych enzymów (brak ubocznych aktywności

enzymatycznych)

3. niepatogenność i brak produktów toksycznych, alergicznych

4. stabilność genetyczna i fenotypowa oraz fagooporność

5. wymagania pokarmowe oraz tolerancja na zmienne stężenie

składników podłoża

6. wielkość zapotrzebowania na tlen oraz tolerancja na zmiany

warunków natlenienia

7. wymagania w zakresie temperatury, odczynu i innych

parametrów procesu oraz stopień wrażliwości na ich zmiany

8. łatwość wydzielania enzymu

CECHY ZEZWALAJĄCE NA OCENĘ
PRZYDATNOŚCI SZCZEPÓW PRZEMYSŁOWYCH:

dr inż. Aneta Białkowska

ETAPY REAKCJI ENZYMATYCZNEJ

dr inż. Aneta Białkowska

ETAPY REAKCJI ENZYMATYCZNEJ

dr inż. Aneta Białkowska

ETAPY REAKCJI ENZYMATYCZNEJ

1. Rozpoznanie i zwi

zanie substratu, dzi

ki oddziaływaniu reszt

aminokwasów wi

ążą

cych zlokalizowanych w kieszeni katalitycznej

(etap charakteryzowany przez K

)

2. Konformacyjny stres enzymu, indukowany przez zmiany w aktywnym

centrum, prowadz

cy do utworzenia produktu (etap entropowy,

charakteryzowany przez k

kat

)

3. Uwolnienie produktu z kompleksu z enzymem

dr inż. Aneta Białkowska

MECHANIZMY WIĄZANIA ENZYMU Z SUBSTRATEM

MODEL tzw. ZAMKA I KLUCZA

(z ang. „lock and key” – teoria

Fischera, znaczenie historyczne)

dr inż. Aneta Białkowska

MECHANIZMY WIĄZANIA ENZYMU Z SUBSTRATEM

MODEL INDUKOWANEGO DOPASOWANIA SIĘ ENZYMU

( z ang.

induced fit model; teoria Koshlanda)

Obszar katalityczny enzymu jest elastyczny; obecność substratu indukuje
zmiany konformacyjne białka, dzięki czemu następuje właściwe ułożenie grup
katalitycznych względem grup funkcyjnych i wiązań w cząsteczce substratu.

dr inż. Aneta Białkowska

MECHANIZMY WIĄZANIA ENZYMU Z SUBSTRATEM

MODEL TRÓJPUNKTOWEGO PRZYŁĄCZENIA SUBSTRATU

ang. three-point interaction model; teoria Ogstona)

Substrat przyłącza się do powierzchni enzymu w trzech punktach; położenie cząsteczki
substratu wobec enzymu jest jednoznacznie określone, a reakcja zachodzi tylko w
jednym z trzech punktów przyłączenia; wyjaśnia swoistość przestrzenną enzymów.

dr inż. Aneta Białkowska

CENTRUM KATALITYCZNE ENZYMU

1. Względnie mała część całkowitej objętości cząsteczki enzymu (od

kilku do kilkunastu reszt aminokwasowych)

2. Struktura trójwymiarowa, obejmująca zwykle odległe reszty

aminokwasów

3. Ma charakter kieszonki lub szczeliny zlokalizowanej w obszarze

hydrofobowym molekuły enzymu co wzmaga oddziaływania
polarnych reszt (Ser, Thr, Lys, His, Asp, Glu, Cys, Met, Arg)
aminokwasów na substrat

4. Ulega zmianom konformacyjnym przy współdziałaniu z

substratem – jego rozmiary mogą się więc zmieniać, choć
specyficzność wiązania substratu jest zdefiniowana określonym
położeniem atomów w centrum aktywnym

5. Współdziała z substratem przy użyciu względnie słabych

oddziaływań, np. hydrofobowych, jonowych, wodorowych, czy
van der Waalsa

dr inż. Aneta Białkowska

CENTRUM KATALITYCZNE ENZYMU

Łańcuch polipeptydowy z

bocznymi łańcuchami

aminokwasowymi

substrat

miejsce katalityczne (odpowiedzialne za czynność
katalityczną enzymu, czyli za jego specyficzność
działania)

OBSZAR CENTRUM AKTYWNEGO (budowa wg. Daniela E. Koshlanda)

K - aminokwasy
kontaktowe (swoiste i
katalityczne)

P - aminokwasy
pomocnicze

S - aminokwasy
stabilizujące

miejsce określające swoistość, tzw.

miejsce wiążące (odpowiedzialne za

specyficzność substratową enzymu)

dr inż. Aneta Białkowska

DOWODY NA ISTNIENIE KOMPLEKSU ENZYM-

SUBSTRAT

1. Kompleksy ES zostały bezpośrednio zarejestrowane dla licznych

enzymów za pomocą mikroskopii elektronowej i badań
krystalograficznych

2. Fizyczne właściwości enzymu, np. jego rozpuszczalność i stabilność

cieplna mogą się często zmieniać podczas tworzenia kompleksu ES

3. Kompleks ES może mieć inne właściwości spektroskopowe, np.

peroksydaza wykazuje maksimum pochłaniania światła przy 400
nm, a jej kompleks z H

przy 415 nm

4. Współczynnik sedymentacji kompleksów ES jest wyższy w

porównaniu z wolnym enzymem

5. Kinetyka reakcji enzymatycznych potwierdza tworzenie się

kompleksu ES, o czym świadczy charakter krzywej V=f[S] przy [E] =
const i tzw. efekt nasycenia. Efekt ten nie jest obserwowany dla
reakcji nie katalizowanych przez enzymy

PODZIAŁ ENZYMÓW WZG. BUDOWY

CHEMICZNEJ

dr inż. Aneta Białkowska

1. Enzymy będące

białkami prostymi

(zbudowane

jedynie z aminokwasów)

Grupa czynna

– specyficzne ugrupowanie

aminokwasów, których nie można odszczepić
bez nieodwracalnej zmiany struktury białka

Przykłady: Amylaza, RNAza, Ureaza

PODZIAŁ ENZYMÓW WZG. BUDOWY

CHEMICZNEJ

dr inż. Aneta Białkowska

2. ENZYMY ZŁOśONE

holoenzym

- pełny układ katalityczny

apoenzym

część białkowa

holoenzymu

koenzym

przyłączona część o

niebiałkowym charakterze

HOLOENZYM = apoenzym + koenzym

holoenzym

- pełny układ katalityczny

apoenzym

część białkowa

holoenzymu

koenzym

przyłączona część o

niebiałkowym charakterze

trwale

związany

nieaminokwasowy koenzym =

grupa prostetyczna

(witaminy i

ich pochodne)

(odłączenie grupy prostetycznej
powoduje i

naktywacje

enzymu

(zazwyczaj nieodwracalną))

luźno

związany nieaminokwasowy

koenzym (kosubstrat)

którego nie można

traktować jako integralnej części enzymu
(nukleotydy i ich pochodne, jony
nieorganiczne).
(jest on łatwo i odwracalnie usuwalny bez
uszkodzenia części białkowej, ale jego
usunięcie prowadzi do inaktywacji enzymu)

PODZIAŁ ENZYMÓW WZG. BUDOWY

CHEMICZNEJ

dr inż. Aneta Białkowska

Koenzym mogą być klasyfikowane

zależnie od grupy

której przeniesienie ułatwiają

1. Koenzymy przenoszące H

NAD

, NADP

FMN, FAD,
Kwas liponowy,

Koenzym Q

2. Koenzymy przenoszące inne

grupy niż H

CoASH
Pirofosforan tiaminy

Biotyna

Koenzymy kobamidowe (B

)

KLASYFIKACJA KOENZYMÓW

dr inż. Aneta Białkowska

KLASYFIKACJA ENZYMÓW

I Oksydoreduktazy - katalizują procesy oksydo-redukcyjne (przenoszenie elektronów i
protonów na różne akceptory, np. NAD+, NADP+, flawoproteidy).

II Transferazy - katalizują reakcje przenoszenia grup funkcyjnych z cząsteczki donora
do cząsteczki akceptora, np. metylowej -CH

(transmetylazy), aminowej -NH

(transaminazy), acylowych R-CO-(transacylazy).

III Hydrolazy - katalizują rozpad cząsteczek złożonych na prostsze przy udziale H

innymi słowy katalizują przenoszenie grupy funkcyjnej z cząsteczki donora do
cząsteczki wody; w ten sposób dochodzi do hydrolizy np. wiązań estrowych (esterazy),
eterowych, glikozydowych (glikozydazy), peptydowych (proteazy).

IV Liazy - katalizują reakcję addycji wody, amoniaku lub CO

do wiązań podwójnych;

katalizują również reakcje odwrotne.

V Izomerazy - przebudowują strukturę cząsteczki bez jej rozkładu; katalizują więc
wewnątrzcząsteczkowe przegrupowanie atomów, czyli izomerię (np. izomerazy cis,
trans).
VI Ligazy - katalizują reakcje łączenia dwóch substratów, w wyniku czego powstają
wiązania C-O, C-S, C-N, C-C. Są to reakcje wymagające nakładu energii ze związków
wysokoenergetycznych, np. ATP, GTP.

dr inż. Aneta Białkowska

JEDNOSTKI AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ

1 UNIT (1 U)

– jest to taka ilość enzymu, bądź jego aktywność, która katalizuje

przekształcenie 1

mola substratu w ciągu 1 minuty, w optymalnej temperaturze i

w optymalnych warunkach pH oraz stężenia substratu.

1 KATAL (1 kat)

– jest to taka ilość enzymu, bądź jego aktywność, która katalizuje

przekształcenie 1 mola substratu w ciągu 1 sekundy, w optymalnej temperaturze i
w optymalnych warunkach pH oraz stężenia substratu. Jest to jednostka zalecana
przez Komisję Międzynarodowej Unii Biochemicznej.

AKTYWNOŚĆ MOLEKULARNA

– jest to ilość mmoli substratu przekształcona w

ciągu 1 minuty w standardowych warunkach przez 1

mol enzymu (w odniesieniu

do jednego centrum aktywnego, jeżeli enzym zawiera ich więcej). Ten sposób
wyrażania aktywności można jednak stosować tylko wtedy, gdy znana jest masa
cząsteczkowa enzymu i liczba centrów aktywnych.

AKTYWNOŚĆ WŁAŚCIWA

–określa liczbę jednostek enzymu na 1 mg białka. Jest

to bardzo przydatny sposób wyrażania aktywności podczas wydzielania i
oczyszczania enzymów, ponieważ w kolejnych etapach oczyszczania aktywność
całkowita zazwyczaj maleje, a aktywność właściwa wzrasta i jest miarą stopnia
oczyszczenia enzymu.

dr inż. Aneta Białkowska

•

temperatura

•

aktywatory i inhibitory

•

stała dielektryczna

•

siła jonowa

•

stężenie substratu, ewentualnie koenzymu

•

stężenie enzymu

•

czas reakcji

dr inż. Aneta Białkowska

CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA SZYBKOŚĆ

REAKCJI ENZYMATYCZNEJ

dr inż. Aneta Białkowska

METODY OZNACZANIA AKTYWNOŚCI

ENZYMÓW

1. METODY STATYCZNE

•

dwupunktowe – porównanie ilości substratu lub produktu w 2
punktach czasowych, tj. w czasie zero i po zakończeniu inkubacji
mieszaniny reakcyjnej (należy zapewnić warunki reakcji aby
zapewnić stałą szybkość reakcji przez cały czas inkubacji)

2. METODY KINETYCZNE

•

pomiar zmian stężenia substratu lub produktu w jednostce czasu
(wymagają ciągłej rejestracji zmian stężeń badanego składnika w
czasie, czyli jest to tzw. pomiar wielopunktowy lub ciągły)

dr inż. Aneta Białkowska

METODY OZNACZANIA AKTYWNOŚCI

ENZYMÓW

1. Spektrofotometryczne (w tym kolorymetryczne)

2. Fluorymetryczne

3. Manometryczne

4. Wiskozymetryczne (np. oznaczanie aktywności enzymów

pektynolitycznych, której miarą jest spadek lepkości
mieszaniny reakcyjnej)

SPEKTROFOTOMETRYCZNE OZNACZANIE

AKTYWNOŚCI ENZYMÓW

dr inż. Aneta Białkowska

SPEKTROFOTOMETRIA

jest techniką instrumentalną, w której do celów

analitycznych wykorzystuje się przejścia energetyczne zachodzące w
cząsteczkach substratów lub produktów, spowodowane absorpcją
promieniowania elektromagnetycznego w zakresie nadfioletu (UV, 200-380
nm) lub widzialnym (VIS, 380 – 780 nm).

SPEKTROFOTOMETRYCZNE OZNACZANIE

AKTYWNOŚCI ENZYMÓW

dr inż. Aneta Białkowska

Np. Oznaczanie aktywności hydratazy fumaranowej

hydrataza

fumaranowa

Fumaran

max

→

= 300 nm)

L-jabłczan

(brak maksimum przy 300 nm)

SPEKTROFOTOMETRYCZNE OZNACZANIE

AKTYWNOŚCI ENZYMÓW

dr inż. Aneta Białkowska

Np. Oznaczanie aktywności dehydrogenazy alkoholowej

Szybkość reakcji tworzenia się NAD+ i
etanolu można śledzić, mierząc zanik
pasma absorpcji przy 340 nm

340

SPEKTROFOTOMETRYCZNE OZNACZANIE

AKTYWNOŚCI ENZYMÓW

dr inż. Aneta Białkowska

Np. Oznaczanie aktywności aminotransferazy asparaginianowej (AspAT)

reakcja wskaźnikowa

340

SPEKTROFOTOMETRYCZNE OZNACZANIE

AKTYWNOŚCI ENZYMÓW

dr inż. Aneta Białkowska

Np. Oznaczanie aktywności enzymów z użyciem substratów
syntetycznych

(w przypadku, gdy substraty czy kosubstraty nie zmieniają podczas reakcji

widma pochłaniania, jak również nie można sprzęgnąć reakcji z reakcją wskaźnikową)

Produkt reakcji, p-nitrofenol przyjmuje w środowisku zasadowym
barwę żółtą, co jest wykorzystane do oznaczania absorbancji w
próbach przy długości fali 420 nm.

Reakcja hydrolizy o-nitrofenylo-

-D-galaktopiranozydu (ONPG) z udziałem

-galaktozydazy

SPEKTROFOTOMETRYCZNE OZNACZANIE

AKTYWNOŚCI ENZYMÓW

dr inż. Aneta Białkowska

Np. Oznaczanie aktywności enzymów z użyciem substratów
syntetycznych

Produkt reakcji, o-nitrofenol przyjmuje w środowisku zasadowym barwę żółtą, co jest
wykorzystane do oznaczania absorbancji w próbach przy długości fali 420 nm

FLUORESCENCYJNE OZNACZANIE

AKTYWNOŚCI ENZYMÓW

dr inż. Aneta Białkowska

Metoda fluorymetryczna opiera się na pomiarze natężenia emitowanego

promieniowania

fluorescencyjnego

powstałego

po wzbudzeniu

próbki.

Intensywność

fluorescencji

danej

substancji

jest

proporcjonalna do jej stężenia w pewnym przedziale stężeń.

Substancjami wykazującymi zjawisko fluorescencji wśród związków

biologicznie czynnych są m.in.:

1. Aminokwasy aromatyczne; tryptofan, tyrozyna i fenyloalanina

2. Zasady nukleinowe w DNA i RNA: adenina, guanina, cytozyna,

tymina i uracyl

3. Barwniki roślinne: chrofile, bakteriochlorofile i karotenoidy

4. Witaminy i hormony: np. ryboflawina

Metody te są w wielu wypadkach znacznie czulsze niż metody

spektrofotometryczne

ZWIAZKI FLUORYZUJĄCE MOśNA PODZIELIĆ NA NASTĘPUJĄCE GRUPY:

•

Wewnętrzne

Tryptofan - zawierający w swojej strukturze grupę indolową. Wykazuje on
fluorescencję przy długości fali wzbudzenia 280 nm i długości fali emisji 340
nm.

•

Zewnętrzne

W przypadku, gdy badany związek nie wykazuje fluorescencji, możliwa jest
jego modyfikacja chemiczna za pomocą tzw. substancji fluoryzujących,
zwanych fluoroforami. Są to substancje selektywnie absorbujące i emitujące
światło o określonej długości fali. Jednym z przykładów jest izotiocyjanian
fluoresceiny, który reaguje z wolnymi grupami aminowymi obecnymi w
strukturach białek. Innymi mogą być np. rodamina lub umbeliferon.

FLUORESCENCYJNE OZNACZANIE

AKTYWNOŚCI ENZYMÓW

dr inż. Aneta Białkowska

FLUORESCENCYJNE OZNACZANIE

AKTYWNOŚCI ENZYMÓW

dr inż. Aneta Białkowska

umbelliferon

tryptofan

izotiocyjanian fluoresceiny

rodamina B

FLUORESCENCYJNE OZNACZANIE

AKTYWNOŚCI ENZYMÓW

dr inż. Aneta Białkowska

APARATURA- FLUORYMETR I SPEKTROFLUORYMETR

MANOMETRYCZNE OZNACZANIE AKTYWNOŚCI

ENZYMÓW

dr inż. Aneta Białkowska

Metody te stosuje się przede wszystkim wówczas, gdy np. jeden z

komponentów reakcji występuje w stanie gazowym i może to być substrat
(np. O

zużywany przez oksydazy), CO

(produkt wydzielany w reakcji

dekarboksylacji) lub N

(produkt wydzielany w reakcji deaminacji)

do oznaczania aktywności enzymów

hydrolizujących białka

GAZOMETRYCZNA METODA van SLYKE’a

MANOMETRYCZNE OZNACZANIE AKTYWNOŚCI

ENZYMÓW

dr inż. Aneta Białkowska

GAZOMETRYCZNA METODA WARBURGA

Jeżeli podczas reakcji powstaje kwas, a reakcję tę prowadzi się

w buforze dwuwęglanowym, znajdującym się w równowadze z gazową
mieszaniną, zawierającą określony procent CO

, wówczas stopniowe

wydzielanie się kwasu powoduje uwalnianie się odpowiednich ilości
CO

, który mierzy się manometrycznie. Grupy karboksylowe mogą

powstawać, np. przy hydrolizie wiązania peptydowego, eterowego,
estrowego i itp

OZNACZANIE STĘśENIA BIAŁKA W ROZTWORZE

dr inż. Aneta Białkowska

Metody

stosowane

do oznaczania

zawartości białka w

określonym materiale zależą od tego, czy zawarte w nim białka można w
całości rozpuścić w środowisku wodnym, a także czy badany materiał
nie zawiera substancji mających wpływ na wynik oznaczenia

Białka nierozpuszczalne

Białka rozpuszczalne

Metoda Kjeldahla

(polega na mineralizacji
materiału celem konwersji
związków azotu w jony
amonowe, które następnie
oznacza się miareczkowo)

Reakcja

biuretowa

Spektrofotome-

tryczny pomiar

absorbancji w

ultrafiolecie A

280

Reakcja

wykorzystująca
zdolność białek

do wiązania

specjalnego

barwnika (np.

Coomassie

Brilant Blue G-

250)

OZNACZANIE STĘśENIA BIAŁKA W ROZTWORZE

dr inż. Aneta Białkowska

Metoda pomiaru absorbancji w UV

Zasada:

Białka, dzięki obecności w swoim składzie aminokwasów
aromatycznych (np. tyrozyna, tryptofan) wykazują zdolność
absorpcji światła o długości fali 280 nm

OZNACZANIE STĘśENIA BIAŁKA W ROZTWORZE

dr inż. Aneta Białkowska

Zalety:

•Proste i szybkie oznaczenie

•Oszczędność materiału

Wady:

•Mała specyficzność

•Metoda nadaje się do oznaczania stężenia oczyszczonego białka (na
podstawie znanego współczynnika absorpcji). Wartość współczynnika
absorpcji zależy od % zawartości aminokwasów aromatycznych

•Obecność kwasów nukleinowych w badanym materiale przeszkadza
w oznaczeniu (max absorbcji 260 nm)

Metoda pomiaru absorbancji w UV

OZNACZANIE STĘśENIA BIAŁKA W ROZTWORZE

dr inż. Aneta Białkowska

Metoda biuretowa

•Oznaczenie natężenia barwy
powstałej w wyniku
utworzenia związków
kompleksowych białek z
jonami miedzi (II) w
środowisku zasadowym

•Intensywność barwy w
reakcji biuretowej jest
proporcjonalna do liczby
wiązań peptydowych

λλλλ

=530 nm

Zalety:

•Wysoka specyficzność dla wszystkich białek – absorbancja nie zależy od
rodzaju oznaczanego białka tylko od jego stężenia w próbie

•Prostota wykonania

Wady:

•Niska czułość

OZNACZANIE STĘśENIA BIAŁKA W ROZTWORZE

dr inż. Aneta Białkowska

Oznaczenie stężenia białka metodą Lowry’ego

Zasada:

W metodzie tej wykorzystuje się 2 odrębne reakcje:

Reakcje aminokwasów z odczynnikiem
Folina:

Tyrozyna, tryptofan, cysteina oraz

przypuszczalnie histydyna występujące w

białkach redukują jony Mo

zawarte w

odczynniku Folina- Ciocalteau do niższych

tlenków

Reakcję biuretową:

Jony miedzi (II) tworzą

kompleksowe połączenia z

wiązaniami peptydowymi,

uczestniczą również w redukcji

odczynnika Folina, przez co
zwiększa się czułość reakcji

KOŃCOWA BARWA JEST WYNIKIEM TYCH DWÓCH POWYśSZYCH REAKCJI

OZNACZANIE STĘśENIA BIAŁKA W ROZTWORZE

dr inż. Aneta Białkowska

Oznaczenie stężenia białka metodą Lowry’ego

Zalety:

•Bardzo wysoka czułość reakcji (ok. 70-krotnie wyższa niż w metodzie
biuretowej)

•Względna prostota wykonania

Wady:

•Wrażliwość na obecne w próbach substancje interferujące

Fenole, zasady purynowe i pirymidynowe, odczynniki sulfhydrylowe
oraz detergenty (zwiększają natężenie barwy)

Inne związki jak ZnSO

, siarczan amonu w stężeniach powyżej

0,1%, 1% etanol i eter obniżają intensywność barwy

•Mała specyficzność wobec różnych białek

OZNACZANIE STĘśENIA BIAŁKA W ROZTWORZE

dr inż. Aneta Białkowska

Oznaczenie stężenia białka metodą Bradforda

W metodzie wykorzystuje się zdolność wiązania barwnika błękitu
brylantowego – Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB G250) z grupami
aminowymi białek.

Maksimum absorpcji

λλλλ

= 595 nm

OZNACZANIE STĘśENIA BIAŁKA W ROZTWORZE

dr inż. Aneta Białkowska

Oznaczenie stężenia białka metodą Bradforda

•Wiązanie ma charakter oddziaływań elektrostatycznych

•CBB G-250 w środowisku kwaśnym ma brunatne zabarwienie, które
po reakcji z białkami zmienia się na błękitne

•Wiąże się z tym zmiana maksimum absorpcji z 465 nm na 595 nm

•Natężenie barwy jest proporcjonalne do zawartości białka w roztworze

400

450

500

550

600

650

700

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

odczynnik Bradforda +BSA (12

µµµµ

g/ml)

odczynnik Bradforda

Rys. Widmo absorpcji odczynnika Bradforda przed (----) i po dodaniu BSA (12

g/ml)(

----

OZNACZANIE STĘśENIA BIAŁKA W ROZTWORZE

dr inż. Aneta Białkowska

Oznaczenie stężenia białka metodą Bradforda

Zalety:

•Prostota i szybkość oznaczenia

•Duża czułość porównywalna z metodą Lowry’ego

•Oznaczenie można wykonywać w obecności powszechnie stosowanych
buforów, EDTA, związków tiolowych, sacharozy i glicerolu

Wady:

•Mała specyficzność wobec różnych białek

•Detergenty (SDS, Triton X-100) dają dodatkowy interferujący kolor

OZNACZANIE STĘśENIA BIAŁKA W ROZTWORZE

dr inż. Aneta Białkowska

umiarkowana

Tak

0,005-0,05

Bradford

duża

Tak

0,05-0,5

Lowry’ego

bardzo mała

Tak

0,5-5,0

Biuretowa

duża

Nie

0,2-2,0

UV 280 nm

Zależność wyniku

od składu

aminokwasowego

Destrukcyjność

Zakres

oznaczalności

[mg]

Metoda