Microsoft PowerPoint - Enzymologia cz. IV

dr inŜ. Aneta Białkowska

ANALIZA SKŁADU AMINOKWASOWEGO

Skład  aminokwasowy białka  wyznacza  się zwykle  po  jego  hydrolizie
kwasowej,  np.  w  6M  HCl w  temperaturze  105-110°C  przez  24  godz.  W
tych  warunkach  tryptofan ulega  prawie  całkowitemu  rozłoŜeniu,  a
częściowemu cystyna, cysteina i metionina.

W celu uwolnienia tryptofanu z łańcucha polipeptydowego

praktycznie bez strat stosuje się hydrolizę zasadową roztworem Ba(OH)

gotując hydrolizat przez 24 godziny.

W celu oznaczenia w białku cystyny, cysteiny i metioniny bez

strat,  przed  kwaśną hydrolizą poddaje  się białko  reakcji  utleniania  za
pomocą kwasu  nadmrówkowego,  w  wyniku  której  z  cystyny  i  cysteiny
powstaje kwas cysteinowy, a z metioniny sulfon metioniny, produkty te są
odporne na długotrwałe gotowanie z kwasem solnym.
Walina  i  izoleucyna  uwalniają się dość trudno  z  białka  i  dlatego  oznacza
się je dopiero po 96 godz. hydrolizy.

METODA CHEMICZNA

METODA ENZYMATYCZNA

Subtylizyna i pronaza (proteaza ze Streptomyces griseus) hydrolizują białka
całkowicie, ale reakcja enzymatyczna biegnie bardzo wolno

dr inŜ. Aneta Białkowska

ANALIZA SKŁADU AMINOKWASOWEGO

Rozdział i ilościowe oznaczanie aminokwasów w

hydrolizatach kwasowych

Chromatografia jonowymienna

na sulfonowanych Ŝywicach

polistyrenowych

RP-HPLC (derywatyzacja przed

kolumną)

Reakcja z ninhydryną

Detekcja promieniowania w

zakresie światła widzialnego

Reakcja np. z N-(4-chinolilo)

karbaminianem N-sukcynoimidu

– przekształcenie aminokwasów

w pochodne fluorescencyjne

Detekcja promieniowania

fluorescencyjnego

Metoda Moore’a i Steina

dr inŜ. Aneta Białkowska

ANALIZA SKŁADU AMINOKWASOWEGO

ANALIZA SKŁADU AMINOKWASOWEGO POZWALA OKREŚLIĆ, W

JAKICH STOSUNKACH MOLOWYCH WYSTĘPUJĄ

POSZCZEGÓLNE AMINOKWASY W POLIPEPTYDZIE, ALE NIE

DOSTARCZA INFORMACJI O ICH KOLEJNOŚCI.

dr inŜ. Aneta Białkowska

IDENTYFIKACJA N-TERMINALNEGO AMINOKWASU

MIMO DUśEJ CZUŁOŚCI WIĘKSZOŚCI OMÓWIONYCH

METOD OZNACZANIA AMINOKWASÓW N-KOŃCOWYCH, NIE

MOśNA ICH STOSOWAĆ WIELOKROTNIE DO ANALIZY TEJ

SAMEJ PRÓBY POLIPETYDU, PONIEWAś PODCZAS

HYDROLIZY KWASOWEJ POLIPEPTYD ULEGA CAŁKOWITEJ

DEGRADACJI DO WOLNYCH AMINOKWASÓW.

dr inŜ. Aneta Białkowska

SPECYFICZNE EGZOPEPTYDAZY

KARBOKSYPEPTYDAZY

(odszczepiają

po jednej reszcie aminokwasowej od C-

końca począwszy)

AMINOPEPTYDAZY

(odszczepiają

po jednej reszcie aminokwasowej od N-

końca począwszy)

Karboksypeptydaza A charakteryzuje
się

szeroką

specyficznością,

C-końca

polipeptydu najszybciej uwalnia Tyr, Phe,
Trp, Leu, Ile, Met, Thr, Gln, His, Ala, Val, nie
uwalnia Pro, ani Arg, natomiast pozostałe
aminokwasy odłącza wolno lub bardzo wolno.

Karboksypeptydaza B

odłącza od C-końca polipeptydu

tylko aminokwasy zasadowe.

IDENTYFIKACJA C- LUB N-TERMINALNEGO

AMINOKWASU (

HYDROLIZA ENZYMATYCZNA POLIPEPTYDU

)

dr inŜ. Aneta Białkowska

SEKWENCJONOWANIE BIAŁKA ENZYMATYCZNEGO

W CELU USTALENIA SEKWENCJI DŁUGIEGO POLIPEPTYDU NALEśY

GO NAJPIERW ROZCIĄĆ NA MNIEJSZE FRAGMENTY SKŁADAJĄCE

SIĘ Z 20-50 RESZT, KTÓRE PO ROZDZIELENIU PODDAJE SIĘ

SEKWENCJONOWANIU.

SPECYFICZNE POCIĘCIE POLIPEPTYDU MOśNA OSIAGNĄĆ

METODAMI CHEMICZNYMI LUB ENZYMATYCZNYMI

dr inŜ. Aneta Białkowska

ENZYMATYCZNA HYDROLIZA POLIPEPTYDÓW

ENDOPROTEINAZY

TRYPSYNA

(hydrolizuje białka po C-terminalnej stronie

reszt lizynowych i argininowych – a więc

aminokwasów zasadowych – zostawiając te

reszty na końcach C peptydów powstających

w wyniku jej działania)

CHYMOTRYPSYNA

(hydrolizuje białka po C-terminalnej stronie

reszt aminokwasów aromatycznych (Phe,

Tyr, Trp)

PROTEINAZA V

(Staphylococcus aureus)

(hydrolizuje białka po C-terminalnej stronie

reszt kwasu glutaminowego)

PROTEINAZA izolowana z opieńki

miodowej (Armillaria mellea)

(hydrolizuje białka po N-terminalnej stronie

reszt lizyny)

dr inŜ. Aneta Białkowska

SEKWENCJONOWANIE BIAŁKA ENZYMATYCZNEGO -

BADANIA PROTEOMICZNE

PROTEOMIKA – ZAJMUJE SIĘ BADANIEM RZECZYWISTEJ

EKSPRESJI INFORMACJI GENETYCZNEJ, A WIĘC SKUPIA SIĘ NA

BADANIU, KTÓRE BIAŁKA SĄ TAK NAPRAWDĘ PRODUKOWANE

PRZEZ DANY ORGANIZM BĄDŹ KOMÓRKI OKREŚLONEGO TYPU.

ETAPY W BADANIACH PROTEOMICZNYCH:

1. elektroforeza dwuwymiarowa

2. spektrometria mas

dr inŜ. Aneta Białkowska

ELEKTROFOREZA DWUKIERUNKOWA

1. ELEKTROFOREZA W PIERWSZYM WYMIARZE

Prowadzona jest z uŜyciem gradientu pH. KaŜde białko migruje do

takiego miejsca na Ŝelu, w którym przestaje być obdarzone ładunkiem
(czyli do swojego punktu izoelektrycznego) i tam się zatrzymuje.
Technikę tę nazywamy

ogniskowaniem izoelektrycznym

2. ELEKTROFOREZA W DRUGIM WYMIARZE

Prowadzona jest w obecności dodecylosiarczanu sodu, zróŜnicowanie

migracji białek opiera się w tym wypadku na róŜnicach w ich masach

cząsteczkowych.

Metodą elektroforezy dwuwymiarowej moŜna rozdzielić ponad 1000
białek. Jest to przy tym metoda bardzo czuła: pozwala na wykrywanie
białek na poziomie fentomolowym (10

-15

mola).

SEKWENCJONOWANIE BIAŁKA ENZYMATYCZNEGO -

BADANIA PROTEOMICZNE

dr inŜ. Aneta Białkowska

Obraz po dwuwymiarowej elektroforezie białek ekstraktów komórkowych. Ogniskowanie

izoelektryczne przeprowadzono w poziomie, a elekktroforezę w obecności SDS – w pionie. Zdjęcia

zaczerpnięte z bazy danych SWISS-2DPAGE.

SEKWENCJONOWANIE BIAŁKA ENZYMATYCZNEGO -

BADANIA PROTEOMICZNE

dr inŜ. Aneta Białkowska

Obraz po dwuwymiarowej elektroforezie białek ekstraktów komórkowych. Ogniskowanie

izoelektryczne przeprowadzono w poziomie, a elekktroforezę w obecności SDS – w pionie. Zdjęcia

zaczerpnięte z bazy danych SWISS-2DPAGE.

SEKWENCJONOWANIE BIAŁKA ENZYMATYCZNEGO -

BADANIA PROTEOMICZNE

dr inŜ. Aneta Białkowska

OKREŚLENIE TRÓJWYMIAROWEJ STRUKTURY

(KONFORMACJI) BIAŁKA ENZYMATYCZNEGO

1. Rentgenografia strukturalna

Opiera się na rejestracji obrazów dyfrakcyjnych promieni

rentgenowskich, powstających na skutek subtelnych interakcji tego
promieniowania z chmurami elektronowymi atomów, tworzących
analizowany kryształ. Na podstawie rejestracji obrazów
dyfrakcyjnych promieniowania X przechodzącego przez kryształ pod
róŜnymi kątami wyznacza się trójwymiarową mapę gęstości
elektronowej w komórce elementarnej kryształu.

2. Modelowanie molekularne

Opiera się na domniemaniu, Ŝe dwa białka wykazujące homologię co

do sekwencji aminokwasowej mają podobną strukturę przestrzenną.

Usługa słuŜąca do przewidywania struktury o nazwie SWISS-MODEL

jest dostępna na stronie ExPASy
(http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html).