PRACE NAUKOWO - BADAWCZE

50

PRZEGLĄD PAPIERNICZY · 68 · STYCZEŃ 2012

Wprowadzenie

Papier należy do materiałów technicznych, które są szcze-

gólnie wrażliwe na niszczącą aktywność mikroorganizmów,
przede wszystkim grzybów. Grzyby strzępkowe odpowiedzialne
za biodegradację papieru pojawiają się już na etapie produkcji,
a ich dalszy rozwój w gotowych produktach zależy od sposobu
przechowywania (1-3). W korozji mikrobiologicznej gotowych
wyrobów papierniczych biorą udział głównie mikroorganizmy,
które mają zdolność do hydrolizowania celulozy zawartej w pa-
pierze. Rozwój grzybów celulolitycznych w papierze powoduje
nie tylko zmiany na jego powierzchni, ale również zmienia che-
miczną i fizyczną strukturę papieru (4). Skutkiem tego procesu
może być całkowite zniszczenie materiału. Zarodniki grzybów są
wszechobecne i mogą pochodzić nie tylko z samego papieru, ale
również z otaczającego środowiska, przede wszystkim z powie-
trza. Zarodniki są mało wrażliwe na niesprzyjające środowisko
zewnętrze i mogą w tych warunkach przetrwać wiele lat. Wi-
doczne makroskopowo grzybnie mogą się rozwinąć nawet przy
niewielkiej wilgotności.

W celu ograniczenia rozwoju grzybów stosuje się mikrobiocydy,

substancje chemiczne o działaniu przeciwdrobnoustrojowym,
których właściwy dobór możliwy jest po określeniu mikroflory
dominującej w danym środowisku. Z przeprowadzonych do-
tychczas badań wynika, że każda postać morfologiczna pleśni
reaguje inaczej na działanie środków biobójczych (5). Nie bez

Zastosowanie mikrobiocydów alkiloamoniowych

w ochronie papieru przed grzybami

strzępkowymi

Applications of alkylammonium microbiocides

to protect paper materials against moulds

ANNA KOZIRÓG, BEATA GUTAROWSKA, BOGUMIŁ BRYCKI

W artykule przedstawiono wyniki badań skuteczności mikrobiocydów
alkiloamoniowych ograniczających populację grzybów strzępkowych
o właściwościach celulolitycznych, powodujących biodegradację
wyrobów papierniczych.
Słowa kluczowe: biocydy, ochrona papieru, grzyby strzępkowe

The article provides results of biocidal efficacy of alkylammonium
microbiocides against cellulite fungi which are responsible for bio-
degradation of paper materials.
Keywords: biocides, paper protection, moulds

Dr A. Koziróg, dr hab. B. Gutarowska, Instytut Technologii Fermentacji

i Mikrobiologii, Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Politechnika

Łódzka, 90-924 Łódź ul. Wólczańska 171/173; Prof. UAM dr hab. B. Brycki,

Pracownia Chemii Mikrobiocydów, Wydział Chemii, Uniwersytet im. Adama

Mickiewicza, 60-780 Poznań, ul. Grunwaldzka 6

e-mail: [e-mail], [e-mail], [e-mail]

znaczenia pozostaje także wiek szczepu. Szczepy młode są
bardziej wrażliwe na działanie mikrobiocydów, w porównaniu
do szczepów dojrzałych, które pozostają na powierzchni papieru
w formie konidiów (6). Dlatego też, przed wyborem odpowied-
niego preparatu biobójczego, istotne jest stwierdzenie, jaka
mikroflora występuje w miejscu przeznaczonym do dezynfekcji.
Stosowanie mikrobiocydów w odpowiednim stężeniu i czasie dla
konkretnej mikroflory i danego środowiska powoduje inaktywację
i skuteczne zniszczenie drobnoustrojów. Zły dobór związków
chemicznych może prowadzić nie tylko do tego, że proces dezyn-
fekcji staje się nieskuteczny, ale co więcej, w dezynfekowanym
obszarze mogą pojawić się formy oporne, które przystosowały
się do tych warunków.

Celem przeprowadzonych badań była identyfikacja grzybów

strzępkowych wyizolowanych z pomieszczeń bibliotecznych
w Polsce, ocena ich właściwości celulolitycznych oraz okre-
ślenie wrażliwości na mikrobiocydy przygotowane na bazie soli
alkiloamoniowych.

Część doświadczalna

Identyfikacja grzybów strzępkowych i ich uzdolnienia ce-

lulolityczne

Badane szczepy grzybów strzępkowych wyizolowano z różnych

pomieszczeń i zbiorów bibliotecznych w Polsce. Diagnostykę
grzybów przeprowadzono na podłożu Czapek (firmy Merck)
i podłożu naturalnym – brzeczce (5°Blg) porównując cechy
makro- i mikroskopowe wyizolowanych gatunków z kluczami
diagnostycznymi (7).

Ocenę właściwości celulolitycznych określono na podłożu

o pH=6,4 z dodatkiem celulozy jako jedynego źródła węgla.

PRACE NAUKOWO - BADAWCZE

51

PRZEGLĄD PAPIERNICZY · 68 · STYCZEŃ 2012

Podłoże na płytkach Petriego szczepiono mikroorganizmami
punktowo, inkubowano w temperaturze 27°C. Po 48 i 168 go-
dzinach inkubacji, w celu sprawdzenia efektu hydrolizy celulozy
przez badane gatunki grzybów strzępkowych, powierzchnię pod-
łoża zalano płynem Lugola i obserwowano strefy przejaśnienia
wokół kolonii.

Ocena skuteczności działania mikrobiocydów metodą dy-

fuzyjną

Do oceny wybrano pięć najbardziej aktywnych celuloli-

tycznie szczepów. Zastosowano pięć preparatów na bazie
czwartorzędowych soli alkiloamoniowych, poliamin alkilowych
i sekwestrantów, które przygotowano w Pracowni Chemii Mi-
krobiocydów Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu.
Skład mikrobiocydów podano w tabeli 1. Każdy preparat przy-
gotowano w stężeniach 0,8; 0,4; 0,1; 0,05 i 0,01 μl/ml. Wartości
minimalnych stężeń hamujących wzrost drobnoustrojów (MIC)
wyznaczono metodą dyfuzyjną.

Tabela 1. Substancje czynne w mikrobiocydach wykorzystywanych w ba-
daniach

Substancje czynne

Oznaczenia mikrobiocydów/Zawartość

substancji czynnych (mg/g)

M-1

M-2

M-3

M-4

M-5

Chlorki tetraalkiloamoniowe

a

150

150

150

150

150

Poliaminy alkilowe

b

17

34

17

34

34

Sekwestranty

c

0

0

40

40

60

a)

5. generacja soli tetraalkiloamoniowych (mieszanina chlorków dialkilo-

dimetyloamoniowych (dioktylo, 25%; didecylo, 25%, oktylodecylo, 50%)
z chlorkiem benzalkoniowym (C

12

, 40%; C

14

, 50%; C

16

, 10%) (11)

b)

bis(N,N-aminopropylo)-N-alkilo(C

8

-

25%, C

12

- 50%, C

14

- 25%) amina

c)

PBTC, NTA

W pierwszym etapie przeprowadzono standaryzację inokulum

w celu uzyskania gęstości zarodników 10

6

jtk/ml. Kolejno na płytki

z pożywką MEA (firmy Merck) wprowadzono 0,1 ml zawiesiny
zarodników i rozprowadzono na całej powierzchni pożywki ste-
rylnym gładzikiem. Następnie w pożywce wycinano studzienki
średnicy 10 mm, do których wprowadzano przygotowane wcze-
śniej roztwory badanych preparatów. Tak przygotowane hodowle
inkubowano 48 godzin w temperaturze 27°C. Po tym czasie ob-
serwowano strefy zahamowania wzrostu grzybów strzępkowych
wokół studzienek. Wielkości strefy wyliczono wg wzoru:

gdzie:
X – wielkość strefy zahamowania wzrostu,
A – średnica strefy bez widocznego wzrostu,
B – średnica otworu wyciętego w pożywce, do którego wpro-

wadzono biocyd.

Omówienie wyników

Spośród wyizolowanych grzybów strzępkowych dominowały

dwa rodzaje – Aspergillus i Penicillium (rys. 1). Są to grzy-
by powszechnie występujące w środowisku, m.in. w glebie
i powietrzu, powodujące psucie żywności czy biodeteriorację
drewna i papieru. Ze względu na ich częstą obecność w różnych

pomieszczeniach magazynowych, nazywane są też „pleśniami
magazynowymi” (8). Wśród badanych pleśni z rodzaju Asper-
gillus zdiagnozowano 3 gatunki, a z rodzaju Penicillium – 7
gatunków.

Wyniki aktywności celulolitycznej wyizolowanych szczepów

przedstawiono w tabeli 2. Trzy spośród 22 izolatów nie wykazały
zdolności celulolitycznych – Alternaria tenussima i dwa gatunki
z rodzaju Mucor. Najwcześniej, po 2 dobach hodowli, zdolność
do rozkładu celulozy zaobserwowano u Chaetomium globosum
i Aspergillus flavus. Jednak największą aktywnością cechowały
się Aspergillus niger, Penicillium cyclopium i Chaetomium glo-
bosum, u których występowały największe strefy przejaśnienia
wokół kolonii.

Tabela 2. Gatunki grzybów strzępkowych wyizolowanych z badanych
bibliotek i ich aktywność celulolityczna

Rodzaj

Gatunek

Aktywność

celulolityczna

po 7 dniach

wyizolowanych grzybów strzępkowych

1 Aspergillus

A. niger

A. flavus

A. ochraceus

++

+

+

2 Penicillium

P. cyclopium

P. terrestre

P. purpurogenum

P. variable

P. notatum

P. virdicatum

P. albidum

++

+

+

+

+

+

+

3 Alternaria

A. tenussima

A. alternata

-

+

4 Cladosporium

C. herbarum

C. macrocarpum

+

+

5 Chaetomium

Ch. globosum

++

6 Mucor

M. hiemalis

M. racemosus

-

-

7 Acremonium

A. strictum

+

8 Fusarium sp.

+

Na podstawie przeprowadzonych badań wytypowano mikro-

florę dominującą, która charakteryzowała się uzdolnieniami ce-
lulolitycznymi. Do tej grupy należą: Aspergillus niger, Aspergillus
ochraceus, Chaetomium globosum, Penicillium terrestre i Peni-
cillium cyclopium. Powyższe drobnoustroje poddano działaniu
mikrobiocydów M-1 – M-5. W tabeli 3 przedstawiono wartości
minimalnych stężeń testowanych środków przeciwgrzybowych
wobec pięciu testowanych gatunków grzybów strzępkowych. Na
podstawie tych wyników określono wartości MIC, które zebrano
w tabeli 4.

Rys. 1. Rodzaje grzybów strzępkowych w zbiorach bibliotecznych w Polsce

(% całkowitej ilości wyizolowanych grzybów)

PRACE NAUKOWO - BADAWCZE

52

PRZEGLĄD PAPIERNICZY · 68 · STYCZEŃ 2012

Tabela 3. Wielkość stref zahamowania wzrostu grzybów strzępkowych
pozwalająca określić wartości minimalnych stężeń hamujących wzrost

Gatunki grzy-

bów strzępko-

wych

Ro-

dzaj

bio-

cydu

Kon-

trola

Stężenia mikrobiocydów [μl/ ml]

0,8

0,4

0,1

0,05

0,01

A.niger

M-1

0

15

13

6

0

0

M-2

0

17

14

12

0

0

M-3

0

16

15

9

0

0

M-4

0

18

13

11

0

0

M-5

0

20

18

15

0

0

A. ochraceus

M-1

0

15

13

7

0

0

M-2

0

16

12

12

0

0

M-3

0

15

13

8

0

0

M-4

0

18

15

13

0

0

M-5

0

18

15

13

0

0

Ch. globosum

M-1

0

15

14

8

0

0

M-2

0

17

14

12

0

0

M-3

0

15

13

9

0

0

M-4

0

20

14

12

0

0

M-5

0

20

14

12

0

0

P. terrestre

M-1

0

14

12

10

0

0

M-2

0

14

13

12

11

0

M-3

0

12

12

10

0

0

M-4

0

24

17

13

11

0

M-5

0

22

15

12

11

0

P. cyclopium

M-1

0

14

12

10

0

0

M-2

0

16

14

12

11

0

M-3

0

14

11

10

0

0

M-4

0

24

18

12

11

0

M-5

0

26

20

12

11

0

Tabela 4. Wartości minimalnych stężeń mikrobiocydów (MIC, μl/ml) hamu-
jących rozwój wybranych gatunków grzybów strzępkowych

Oznaczenia

biocydów

Gatunki grzybów strzępkowych

A.

niger

A. ochra-

ceus

Ch. glo-

bosum

P. terrestre

P. cyclo-

pium

M-1

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

M-2

0,05

0,05

M-3

0,1

0,1

M-4

0,05

0,05

M-5

0,05

0,05

Najskuteczniejsze w działaniu okazały się preparaty M-2, M-4

i M-5. Zastosowanie ich w stężeniu 0,05 μl/ml było wystarczające
do zahamowania wzrostu szczepów z rodzaju Penicillium. Dla
osiągnięcia tego samego efektu w przypadku środków biobój-
czych M-1 i M-3 wymagane jest użycie dwukrotnie większych
stężeń.

Najmniejszą wrażliwość na zastosowane mikrobiocydy

wykazywały grzyby Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus
i Chaetomium globosum. Dla tych gatunków wartość MIC dla
wszystkich preparatów wynosiła 0,1 μl/ml. Stwierdzono, że
najskuteczniejszymi preparatami są mikrobiocydy M-4 i M-5
zawierające czwartorzędowe sole alkiloamoniowe w stężeniu 150
mg/g, poliaminy alkilowe w stężeniu 34 mg/g oraz sekwestranty.
Powyższe preparaty w stężeniu 0,8 μl/ml powodowały pojawienie
się największych stref zahamowania wzrostu.

Podsumowanie

Stwierdzono, że wśród zidentyfikowanych w środowisku biblio-

tecznym grzybów strzępkowych występuje duża różnorodność,
zarówno rodzajów, jak i gatunków, chociaż ponad 50% wszystkich

izolatów stanowią pleśnie z rodzaju Aspergillus i Penicillium.
Wymienione w tabeli 2 gatunki bardzo często występują na ma-
teriałach bibliotecznych, takich jak książki, papier i pergamin, co
potwierdzają wyniki uzyskane przez innych badaczy (9, 10).

Do najskuteczniejszych mikrobiocydów należą te, które

w swoim składzie zawierają oprócz czwartorzędowych soli
alkiloamoniowych również sekwestranty i poliaminy alkilowe
o podwyższonym stężeniu (34 mg/g). Wśród badanych grzybów
strzępkowych najbardziej wrażliwe okazały się szczepy z rodzaju
Penicillium.

Z przeprowadzonych badań wynika, że przed przeprowadze-

niem dezynfekcji należy określić rodzaj dominującej w danym
środowisku mikroflory i w stosunku do niej dobrać właściwe
mikrobiocydy. Odpowiedni rodzaj i stężenie preparatu biobójcze-
go pozwoli uniknąć pojawienia się szczepów opornych. Bardzo
dobra aktywność przeciwdrobnoustrojowa badanych preparatów
umożliwia ich praktyczne wykorzystanie jako inhibitorów biode-
terioracji papieru.

Serdeczne podziękowania składamy Pani prof. dr hab. Zofii

Żakowskiej z Instytutu Technologii Fermentacji i Mikrobiologii
za cenne wskazówki i dyskusje, które pozwoliły na powstanie
niniejszej pracy.

Pracę tę dedykujemy naszemu Koledze Zbyszkowi Pajewskie-

mu, który był łącznikiem między mikrobiologami i konserwato-
rami dzieł sztuki.

LITERATURA

1. Stobińska H., Zyska B.: „Papier – produkcja, wytwory papiernicze, ma-

teriały w zbiorach bibliotecznych”, [w] Praca zbiorowa: „Mikrobiologia
materiałów”, red. Zyska B., Żakowska Z., Wyd. Politechniki Łódzkiej,
Łódź 2005, s. 137-185.

2. Gutarowska B, Cichocka A.: „Ocena zanieczyszczenia mikrobiologicznego

mas papierniczych oraz wody technologicznej stosowanych w procesie
produkcji papieru”, Przegl. Papiern. 65, 9, 551 (2009).

3. Gutarowska B., Cichocka A.: „Zastosowanie metody oznaczania ergo-

sterolu do szybkiej oceny zanieczyszczenia grzybami na różnych etapach
produkcji papieru”, Przegl. Papiern. 66, 1, 45 (2010).

4. Pinzari F., Pasquariello G, De Mico A.: “Biodeterioration of Paper: A SEM

Study of Fungal Spoilage Reproduced Under Controlled Conditions”,
Macromolecular Symposia 238, 1, 57 (2006).

5. Koziróg A.: „Oporność grzybów strzępkowych na N,N-bis(3-aminopropylo)

dodecyloaminę”, Praca doktorska, Politechnika Łódzka 2006.

6. Koziróg A., Pajewski Z., Żakowska Z., Brycki B.: „Skuteczność działania

biocydów na grzyby strzępkowe rozwijające się na powierzchniach ma-
teriałów”, Ochrona przed Korozją 10s/A, 50, 95-98 (2007).

7. Samson R.A., Hoekstra E.S., Frisvad J.C., Filtenborg O.: “Introduction to

food and air borne fungi”, CBS Baarn, The Netherlands, 1996.

8. Piotrowska M., Żakowska Z.: „Grzyby strzępkowe” [w] Praca zbiorowa:

„Mikrobiologia techniczna”, red. Libudzisz Z., Żakowska Z., Kowal K.,
PWN, Warszawa 2007, s. 60-83.

9. Zyska B.: “Fungi Isolated from Library Materials. A Review of The Lit-

erature”, International Biodeterioration and Biodegradation 40, 1, 43-51
(1997).

10. Fabbri A.A., Ricelli A., Brasini S., Fanelli C.: “Effect of Different Antifungals

on the Control of Paper Biodeterioration Caused by Fungi”, International
Biodeterioration and Biodegradation 39, 1, 61-65 (1997).

11. Block S.S. (ed) 2001. Disinfection, Sterilization, and Preservation,

Lippincott Williams and Wilkins, 5th Edition, Philadelphia, USA.