K

INETYKA

E

NZYMÓW

Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych
• Kwas octowy – C

Wyznaczanie stałej Michaelisa-Menten dla N-acetylo-



-D-glukozaminidazy

ze ślinianek szczura

N-acetylo-



-D-glukozaminidaza (EC.3.2.1.30) hydrolizuje wiązanie



-N-acetyloglukoz-

aminylowe (na nieredukującym końcu łańcucha cukrowego) w oligosacharydach takich jak
kwas hialuronowy czy siarczan chondroityny. W celu wyznaczenia aktywności acetylo-
glukozaminidazy stosuje się substraty syntetyczne: glikozydy np. fenylowe lub p-nitrofenylo-
we.

O

NO

2

O

CH

2

OH

O

OH

NHAc

O

CH

2

OH

OH

HO

NHAc

OH

NO

2

HO

H

2

O

+

p-nitrofe nylo-N-acetylo-



-D-glukozamina

p-nitrofe nol

N-acetylo-



-D-glukozamina

H

O

OH

Uwolniony p-nitrofenol wykazuje charakterystyczne maksimum absorbancji przy długości
fali



= 405 nm.

Bufor do reakcji enzymatycznej:
stężenie końcowe ilość
58 mM kwas cytrynowy 1,520 g
41 mM NaH

2

PO

4

0,707 g 100 ml, doprowadzić przy użyciu

0,1% Triton X-100 0,1 ml NaOH do pH 4.2

Substrat:
p-nitrofenylo-N-acetylo-



-

D-glukozamina 2 mg/ ml buforu

Stoper:
0,4 M glicyna – NaOH pH 10.7

Wykonanie:
Przygotować kolejne rozcieńczenia wyjściowego roztworu substratu o stężeniu 2mg/ml – w
tym celu pobrać do oddzielnej probówki 200



l wyjściowego roztworu substratu i uzupełnić

buforem do objętości 400



l. Całość wymieszać. Z tak przygotowanego rozcieńczenia pobrać

objętość 200



l i uzupełnić buforem do objętości 400



l. Otrzymany roztwór wymieszać.

Postępować analogicznie, aż do otrzymania 5 kolejnych rozcieńczeń.
Do pięciu oddzielnych probówek odpipetować po: 600



l buforu i 180



l homogenatu.

Następnie do każdej mieszaniny dodać substrat o innym stężeniu w ilości 180



l. Wymieszać.

Mieszaniny inkubować w temp. 37



C i po czasie 1, 2, 4, 6 i 8 min pobierać po 160



l

mieszaniny i przenosić do uprzednio przygotowanych probówek zawierających 0.5 ml
stopera. Absorbancję powstałego produktu zmierzyć wobec ślepych odczynnikowych
(przygotowanych dla każdego stężenia substratu) przy długości fali



= 405 nm w

spektrofotometrze Bio-Rad. Ślepe odczynnikowe przygotować następująco: do pięciu
kolejnych probówek odpipetować po 130



l buforu i 30



l odpowiedniego stężenia substratu,

inkubować w temp. 37



C przez 5 min, a następnie zatrzymać reakcje dodając po 0,5 ml

stopera. Mnożąc wartość absorbancji przez stałą k = 1007 otrzymujemy stężenie rozłożonego
substratu (powstałego produktu) w nmol/ml. Masa 1 mola substratu = 342.3 g.


Opracowanie wyników:
Dla każdego z użytych stężeń substratu s wykreślić krzywe kinetyczne wyrażające zależność
przyrostu produktu c od czasu inkubacji t. Znaleźć graficzne szybkości początkowe v

0

i po

sporządzeniu wykresu Lineweavera-Burka wyznaczyć graficznie wartości K

m

i V

max

.

s = 0,125

(mg/ml) =

(mmol/l)

nr
próbki

A

405

c
(



M)

t
(min)

v

0

(



M/min)

1/v

0

(min/



M)

1/s
(1/mM)

K

m

(mM)

V

max

(



M/min)

1

1

2

2

3

4

4

6

5

8

s = 0,250

(mg/ml) =

(mmol/l)

6

1

7

2

8

4

9

6

10

8

s = 0,500

(mg/ml) =

(mmol/l)

11

1

12

2

13

4

14

6

15

8

s = 1,000

(mg/ml) =

(mmol/l)

16

1

17

2

18

4

19

6

20

8

s = 2,000

(mg/ml) =

(mmol/l)

21

1

22

2

23

4

24

6

25

8

Oznaczanie aktywności trypsyny na substracie syntetycznym – wpływ pH i
temperatury na aktywność enzymatyczną.

A. W

PŁYW P

H

Trypsyna (EC 3.4.21.4; enzym proteolityczny soku trzustkowego, endopeptydaza z klasy

hydrolaz) katalizuje m. in. reakcję hydrolizy wiązań peptydowych, utworzonych przez
grupy karboksylowe argininy (Arg) lub lizyny (Lys), w łańcuchu polipeptydów i białek.
Trypsyna katalizuje również wiązania estrowe czy amidowe w substratach syntetycznych
będących pochodnymi Arg lub Lys. Jeśli substratem jest chlorowodorek benzoilo-L-
argininy p-nitroanilidu (BAPNA) to po reakcji hydrolizy uwalnia się wolna p-nitroanilina,
która wykazuje charakterystyczne maksimum absorbancji przy długości fali



= 405 nm.

Wykonanie:

Do siedmiu szklanych krótkich probówek odpipetować po 100



l roboczego roztworu

trypsyny, a do ósmej 100



l 1 mM HCl. Do siedmiu pierwszych probówek dodać po 1 ml

buforów o pH 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, a do ostatniej probówki dodać 1 ml buforu o pH 7.
Następnie do każdej probówki dodać po 20



l substratu BAPNA i inkubowć w łaźni

wodnej w temp. 37



C przez 15 min. Reakcje zatrzymać dodając po 100



l stężonego

kwasu octowego i dokonać pomiaru absorbancji względem próby ślepej (ósma probówka)
przy długości fali



= 405 nm w spektrofotometrze Bio-Rad. Dane pomiarowe wpisać do

tabeli 1.


Tabela 1.

pH

A

405

Aktywość enzymatyczna

U (



mol/min)

Aktywność właściwa

U/mg

5

6

7

8

9

10

11

Opracowanie wyników:
Wykreślić wykres zależności aktywności właściwej od pH roztworu i wyznaczyć
optimum działania trypsyny dla BAPNA jako substratu, przyjmując jako jednostkę

trypsyna

H

2

O

p-

nitroanilina (żółty)

BAPNA (bezbarwny)

Cl

-

Cl

-

aktywności przyrost absorbancji o 0,1 w warunkach doświadczenia. Aktywność właściwa
to ilość jednostek aktywności przypadająca na 1 mg enzymu.

B.

W

PŁYW TEMPERATURY

Do pięciu probówek typu eppendorf (obj. 1.5 ml) odpipetować po 1 ml 0,2 M buforu Tris-
HCl o pH 8,0. Pierwszą probówkę umieścić w lodzie, drugą pozostawić w temp.
pokojowej, trzecią umieścić w termobloku w temp. 37



C, czwartą w termobloku w temp.

48



C, a piąta probówkę umieścić w termobloku w temp. 60



C. Po upływie 10 min., do

każdej z probówek dodać po 50



l roboczego roztworu trypsyny i po 20



l roztworu

substratu BAPNA. Wymieszać i inkubować w odpowiedniej temperaturze przez 30 min.
Reakcję zatrzymać dodając po 100



l stężonego kwasu octowego. Próbę ślepą

przygotować w następujący sposób: do probówki typu eppendorf odpipetować 1 ml 0,2 M
buforu Tris-HCl o pH 8,0, 50



l 1 mM HCl i 20



l roztworu substratu BAPNA.

Wymieszać i inkubować w temp. pokojowej. Po upływie 30 min dodać 100



l stężonego

kwasu octowego. Następnie zmierzyć absorbancję wszystkich próbek względem próby
ślepej przy długości fali



= 405 nm w spektrofotometrze Bio-Rad. Dane pomiarowe

wpisać do tabeli 2.


Tabela 2

Temp. (



C)

A

405

Aktywość enzymatyczna

U (



mol/min)

Aktywność właściwa

U/mg

0

20

37

48

60

Opracowanie wyników:
Wykreślić wykres zależności aktywności właściwej trypsyny od temperatury inkubacji.
Przedyskutować wyniki.

Odczynniki:
0,01 mM trypsyna (2,4 mg trypsyny w 10 ml 1 mM HCl) – przechowywana w lodzie. Roztwór trypsyny
roboczej – rozcieńczyć trypsynę 10 razy przy użyciu 1 mM HCl tzn. odpipetować 100



l wyjściowego

roztworu trypsyny i dodać 900



l 1 mM HCl. Roztwór roboczy enzymu przechowywać w lodzie. Substrat –

25 mM chlorowodorek benzoilo-L-argininy p-nitroanilidu (BAPNA) w dimetylosulfotlenku (DMSO) (11
mg/ml). Stężony kwas octowy do przerywania reakcji enzymatycznej. 0,2 M Tris-HCl bufor o pH: 5, 6, 7, 8,
9, 10 i 11.

Materiały i sprzęt laboratoryjny:
pipety automatyczne, termostatowana łaźnia wodna, termobloki, spekrofotometr, shaker, krótkie szklane
probówki, probówki typu eppendorf (1.5 ml), czasomierze, lód

Literatura:
1) B.D. Hames, N.M.Hooper: „Krótkie wykłady. Biochemia” (red. J. Michajda, A. Augustyniak, K.

Ziemnicki), Wydawnictwo naukowe PWN, Warszawa 2004, str. 95-104.

2) „Techniki badań fizjologicznych” (red. A. Lityńska, M.H. Lewandowski), str. 78-79.