K
INETYKA
E
NZYMÓW
Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych
• Kwas octowy – C
Wyznaczanie stałej Michaelisa-Menten dla N-acetylo-
-D-glukozaminidazy
ze ślinianek szczura
N-acetylo-
-D-glukozaminidaza (EC.3.2.1.30) hydrolizuje wiązanie
-N-acetyloglukoz-
aminylowe (na nieredukującym końcu łańcucha cukrowego) w oligosacharydach takich jak
kwas hialuronowy czy siarczan chondroityny. W celu wyznaczenia aktywności acetylo-
glukozaminidazy stosuje się substraty syntetyczne: glikozydy np. fenylowe lub p-nitrofenylo-
we.
O
NO
2
O
CH
2
OH
O
OH
NHAc
O
CH
2
OH
OH
HO
NHAc
OH
NO
2
HO
H
2
O
+
p-nitrofe nylo-N-acetylo-
-D-glukozamina
p-nitrofe nol
N-acetylo-
-D-glukozamina
H
O
OH
Uwolniony p-nitrofenol wykazuje charakterystyczne maksimum absorbancji przy długości
fali
= 405 nm.
Bufor do reakcji enzymatycznej:
stężenie końcowe ilość
58 mM kwas cytrynowy 1,520 g
41 mM NaH
2
PO
4
0,707 g 100 ml, doprowadzić przy użyciu
0,1% Triton X-100 0,1 ml NaOH do pH 4.2
Substrat:
p-nitrofenylo-N-acetylo-
-
D-glukozamina 2 mg/ ml buforu
Stoper:
0,4 M glicyna – NaOH pH 10.7
Wykonanie:
Przygotować kolejne rozcieńczenia wyjściowego roztworu substratu o stężeniu 2mg/ml – w
tym celu pobrać do oddzielnej probówki 200
l wyjściowego roztworu substratu i uzupełnić
buforem do objętości 400
l. Całość wymieszać. Z tak przygotowanego rozcieńczenia pobrać
objętość 200
l i uzupełnić buforem do objętości 400
l. Otrzymany roztwór wymieszać.
Postępować analogicznie, aż do otrzymania 5 kolejnych rozcieńczeń.
Do pięciu oddzielnych probówek odpipetować po: 600
l buforu i 180
l homogenatu.
Następnie do każdej mieszaniny dodać substrat o innym stężeniu w ilości 180
l. Wymieszać.
Mieszaniny inkubować w temp. 37
C i po czasie 1, 2, 4, 6 i 8 min pobierać po 160
l
mieszaniny i przenosić do uprzednio przygotowanych probówek zawierających 0.5 ml
stopera. Absorbancję powstałego produktu zmierzyć wobec ślepych odczynnikowych
(przygotowanych dla każdego stężenia substratu) przy długości fali
= 405 nm w
spektrofotometrze Bio-Rad. Ślepe odczynnikowe przygotować następująco: do pięciu
kolejnych probówek odpipetować po 130
l buforu i 30
l odpowiedniego stężenia substratu,
inkubować w temp. 37
C przez 5 min, a następnie zatrzymać reakcje dodając po 0,5 ml
stopera. Mnożąc wartość absorbancji przez stałą k = 1007 otrzymujemy stężenie rozłożonego
substratu (powstałego produktu) w nmol/ml. Masa 1 mola substratu = 342.3 g.
Opracowanie wyników:
Dla każdego z użytych stężeń substratu s wykreślić krzywe kinetyczne wyrażające zależność
przyrostu produktu c od czasu inkubacji t. Znaleźć graficzne szybkości początkowe v
0
i po
sporządzeniu wykresu Lineweavera-Burka wyznaczyć graficznie wartości K
m
i V
max
.
s = 0,125
(mg/ml) =
(mmol/l)
nr
próbki
A
405
c
(
M)
t
(min)
v
0
(
M/min)
1/v
0
(min/
M)
1/s
(1/mM)
K
m
(mM)
V
max
(
M/min)
1
1
2
2
3
4
4
6
5
8
s = 0,250
(mg/ml) =
(mmol/l)
6
1
7
2
8
4
9
6
10
8
s = 0,500
(mg/ml) =
(mmol/l)
11
1
12
2
13
4
14
6
15
8
s = 1,000
(mg/ml) =
(mmol/l)
16
1
17
2
18
4
19
6
20
8
s = 2,000
(mg/ml) =
(mmol/l)
21
1
22
2
23
4
24
6
25
8
Oznaczanie aktywności trypsyny na substracie syntetycznym – wpływ pH i
temperatury na aktywność enzymatyczną.
A. W
PŁYW P
H
Trypsyna (EC 3.4.21.4; enzym proteolityczny soku trzustkowego, endopeptydaza z klasy
hydrolaz) katalizuje m. in. reakcję hydrolizy wiązań peptydowych, utworzonych przez
grupy karboksylowe argininy (Arg) lub lizyny (Lys), w łańcuchu polipeptydów i białek.
Trypsyna katalizuje również wiązania estrowe czy amidowe w substratach syntetycznych
będących pochodnymi Arg lub Lys. Jeśli substratem jest chlorowodorek benzoilo-L-
argininy p-nitroanilidu (BAPNA) to po reakcji hydrolizy uwalnia się wolna p-nitroanilina,
która wykazuje charakterystyczne maksimum absorbancji przy długości fali
= 405 nm.
Wykonanie:
Do siedmiu szklanych krótkich probówek odpipetować po 100
l roboczego roztworu
trypsyny, a do ósmej 100
l 1 mM HCl. Do siedmiu pierwszych probówek dodać po 1 ml
buforów o pH 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, a do ostatniej probówki dodać 1 ml buforu o pH 7.
Następnie do każdej probówki dodać po 20
l substratu BAPNA i inkubowć w łaźni
wodnej w temp. 37
C przez 15 min. Reakcje zatrzymać dodając po 100
l stężonego
kwasu octowego i dokonać pomiaru absorbancji względem próby ślepej (ósma probówka)
przy długości fali
= 405 nm w spektrofotometrze Bio-Rad. Dane pomiarowe wpisać do
tabeli 1.
Tabela 1.
pH
A
405
Aktywość enzymatyczna
U (
mol/min)
Aktywność właściwa
U/mg
5
6
7
8
9
10
11
Opracowanie wyników:
Wykreślić wykres zależności aktywności właściwej od pH roztworu i wyznaczyć
optimum działania trypsyny dla BAPNA jako substratu, przyjmując jako jednostkę
trypsyna
H
2
O
p-
nitroanilina (żółty)
BAPNA (bezbarwny)
Cl
-
Cl
-
aktywności przyrost absorbancji o 0,1 w warunkach doświadczenia. Aktywność właściwa
to ilość jednostek aktywności przypadająca na 1 mg enzymu.
B.
W
PŁYW TEMPERATURY
Do pięciu probówek typu eppendorf (obj. 1.5 ml) odpipetować po 1 ml 0,2 M buforu Tris-
HCl o pH 8,0. Pierwszą probówkę umieścić w lodzie, drugą pozostawić w temp.
pokojowej, trzecią umieścić w termobloku w temp. 37
C, czwartą w termobloku w temp.
48
C, a piąta probówkę umieścić w termobloku w temp. 60
C. Po upływie 10 min., do
każdej z probówek dodać po 50
l roboczego roztworu trypsyny i po 20
l roztworu
substratu BAPNA. Wymieszać i inkubować w odpowiedniej temperaturze przez 30 min.
Reakcję zatrzymać dodając po 100
l stężonego kwasu octowego. Próbę ślepą
przygotować w następujący sposób: do probówki typu eppendorf odpipetować 1 ml 0,2 M
buforu Tris-HCl o pH 8,0, 50
l 1 mM HCl i 20
l roztworu substratu BAPNA.
Wymieszać i inkubować w temp. pokojowej. Po upływie 30 min dodać 100
l stężonego
kwasu octowego. Następnie zmierzyć absorbancję wszystkich próbek względem próby
ślepej przy długości fali
= 405 nm w spektrofotometrze Bio-Rad. Dane pomiarowe
wpisać do tabeli 2.
Tabela 2
Temp. (
C)
A
405
Aktywość enzymatyczna
U (
mol/min)
Aktywność właściwa
U/mg
0
20
37
48
60
Opracowanie wyników:
Wykreślić wykres zależności aktywności właściwej trypsyny od temperatury inkubacji.
Przedyskutować wyniki.
Odczynniki:
0,01 mM trypsyna (2,4 mg trypsyny w 10 ml 1 mM HCl) – przechowywana w lodzie. Roztwór trypsyny
roboczej – rozcieńczyć trypsynę 10 razy przy użyciu 1 mM HCl tzn. odpipetować 100
l wyjściowego
roztworu trypsyny i dodać 900
l 1 mM HCl. Roztwór roboczy enzymu przechowywać w lodzie. Substrat –
25 mM chlorowodorek benzoilo-L-argininy p-nitroanilidu (BAPNA) w dimetylosulfotlenku (DMSO) (11
mg/ml). Stężony kwas octowy do przerywania reakcji enzymatycznej. 0,2 M Tris-HCl bufor o pH: 5, 6, 7, 8,
9, 10 i 11.
Materiały i sprzęt laboratoryjny:
pipety automatyczne, termostatowana łaźnia wodna, termobloki, spekrofotometr, shaker, krótkie szklane
probówki, probówki typu eppendorf (1.5 ml), czasomierze, lód
Literatura:
1) B.D. Hames, N.M.Hooper: „Krótkie wykłady. Biochemia” (red. J. Michajda, A. Augustyniak, K.
Ziemnicki), Wydawnictwo naukowe PWN, Warszawa 2004, str. 95-104.
2) „Techniki badań fizjologicznych” (red. A. Lityńska, M.H. Lewandowski), str. 78-79.