Wykład 14

1

Mikrobiologia przemysłowa

Zastosowanie mikroorganizmów w przemyśle farmaceutycznym i medycynie

1

Po pierwsze penicylina



Era

antybiotyków

została

zapoczątkowana przez Alexandra

Fleminga, który w roku 1928

zaobserwował zahamowanie wzrostu

gronkowców na płytce zakażonej

pleśnią z rodziny Penicillium

2

Wykład 14

2

Antybiotyki – parę słów przypomnienia



Antybiotyki – są małocząsteczkowymi substancjami naturalnymi,

najczęściej pochodzenia drobnoustrojowego lub ich półsyntetycznymi

modyfikacjami albo syntetycznymi analogami, które w małym stężeniu

działają wybiórczo na struktury i procesy biologiczne, hamując wzrost

lub rozmnażanie komórek

3

Produkcja antybiotyków przez mikroorganizmy

Mikroorganizmy

Liczba

antybiotyków

Grupa

Rodzaj

Promieniowce

Streptomyces

Micromonospora

Nocradia

>6000

~5000

>400

~300

Inne bakterie

Bacillus

Pseudomonas

>1000

~200

~100

Grzyby

Penicillium

Aspergillus

>2000

~200

~150

4

Wykład 14

3

Produkcja antybiotyków przez
mikroorganizmy



Około

90%

antybiotyków naturalnych, produkowanych przemysłowo

w przemyśle lub obecnie, stanowią produkty metabolizmu

promieniowców

, np. aminoglikozydy, makrolidy, tetracykliny, polieny,

antracykliny, ryfamycyny



Ograniczone znaczenie mają produkty pozostałych bakterii, głównie z
rodzaju Bacillus, należą tu niektóre antybiotyki peptydowe, m.in..
bacytracyna, gramicydyna, polimyksyny

5

Ważniejsze antybiotyki produkowane przez
promieniowce

Promieniowce

Aktywność

Antybiotyk

Micromonospora purpurea
Anycolatopsis mediterranei
(Nocardia mediterranea)
Streptomyces aureofaciens
Streptomyces kanamyceticus
Saccharopolyspora erythraea
Streptomyces floridae Streptomyces
griseus Streptomyces lincolnensis
Streptomyces orientalis

przeciwbakteryjna

gentamycyny ryfamycyny
tetracykliny kanamycyny
erytromycyna wiomycyna
streptomycyna
linkomycyna
wankomycyna

Streptomyces nodosus
Streptomyces noursei

przeciwgrzybowa

amfoterycyny nystatyna

Streptomyces antibioticus
Streptomyces caespitosus
Streptomyces galilaeus
Streptomyces peucetius
Streptomyces verticillus

przeciwnowotworowa

aktynomycyna
mitomycyna aklarubicyna
daunorubicyna
bleomycyna

6

Wykład 14

4

Zarys biotechnologii antybiotyków

Proces produkcji antybiotyków obejmuje:



Przygotowanie wyjściowego materiału posiewowego



Proces biosyntezy antybiotyków w bioreaktorze



Wyodrębnianie antybiotyków z zawiesiny pohodowlanej i ich

oczyszczanie

7

Przygotowanie wyjściowego materiału posiewowego

1.

ETAP

Namnażanie szczepów producenckich na podłożu stałym

(promieniowce i grzyby)

2.

ETAP

Rozmnażanie materiału posiewowego w hodowli wgłębnej

8

Wykład 14

5

Namnażanie szczepów producenckich na podłożu stałym



Pożywki używane do namnażania spór grzybów lub promieniowców
są zestalone agarem i zawierają najczęściej łatwo przyswajalne

- Organiczne źródła węgla i energii
np. sacharozę, glukozę, czasami surowce skrobiowe,

- Źródło azotu
np. jony amonowe i azotanowe, czasami wyciągi mięsne lub inne,

- Zestaw soli nieorganicznych.

9

!!! UWAGA !!!



Zasadą jest używanie pożywek o małym stężeniu związków węgla i

azotu, przy czym szczególnie ważna jest limitacja źródła azotu,

będąca czynnikiem ograniczającym rozmnażanie komórek grzybni i

stymulującym proces sporulacji

Namnażanie szczepów producenckich na podłożu stałym

10

Wykład 14

6

Rozmnażanie materiału posiewowego w hodowli wgłębnej

Rozmnażanie materiału posiewowego w hodowli wgłębnej prowadzi się

dwuetapowo

1.

Początkowo mikroorganizmy namnaża się w kolbach

wstrząsanych aż do osiągnięcia wskazanych wartości OD hodowli

(optical density),

11

2.

Następnie w mikroorganizmy hoduje się w bioreaktorach o
pojemności od kilku do kilkudziesięciu litrów na podłożach
wzbogaconych w kompleksowe surowce, takie jak:

- namok kukurydziany,

- wyciągi lub hydrolizaty mięsne

- wyciągi drożdżowe

obecne w pożywce stosowanej na etapie hodowli wybranego

mikroorganizmu i produkcji przez niego antybiotyku

Rozmnażanie materiału posiewowego w hodowli wgłębnej

12

Wykład 14

7

Proces biosyntezy antybiotyków w bioreaktorze



Proces biosyntezy antybiotyków polega na prowadzeniu hodowli

drobnoustrojów w bioreaktorze z mieszaniem i napowietrzaniem, w

podłożu zapewniającym pełne wykorzystanie metabolicznego

potencjału szczepu produkcyjnego

13

Jak osiągnąć

pełne wykorzystanie metabolicznego

potencjału szczepu produkcyjnego

Z jednej strony należy stworzyć

optymalne warunki rozwoju

aktywnej biomasy i biosyntezy

produktu

WYBÓR PODŁOŻA PRODUKCYJNEGO

Z drugiej natomiast surowce

użyte do sporządzenia podłoża

powinny być możliwie tanie

14

Wykład 14

8

WYBÓR PODŁOŻA PRODUKCYJNEGO

Podłoża produkcyjne przygotowuje się zazwyczaj z wystandaryzowanych
surowców kompleksowych, takich jak:



mąka sojowa lub kukurydziana,



namok kukurydziany,



wyciągi mięsne

do których dodawane są wybrane dla konkretnego szczepu producenckiego
źródła węgla, azotu, soli mineralnych, czynniki wzrostowych i prekursorów
syntezy bioproduktu

15

Źródło Węgla



Podstawowym składnikiem podłoża jest źródło węgla i energii, wykorzystywane do

rozmnażania komórek i syntezy produktu; mogą to być



monosacharydy np. glukoza



disacharydy np. sacharoza, laktoza.



Jeżeli w procesie używane są drobnoustroje wytwarzające enzymy amylolityczne

np. bakterie z rodzaju Bacillus czy promieniowce, wówczas do przygotowania

podłoża wykorzystuje się skrobię ziemniaczaną lub kukurydzianą

16

Wykład 14

9

Źródło Azotu



Źródłem azotu mogą być sole amonowe, woda amoniakalna, ale w

praktyce przemysłowej są nim najczęściej surowce kompleksowe,

takie jak namok kukurydziany lub mąka sojowa.

N

2

17

Inne istotne czynniki wzrostowe



Podłoża produkcyjne mogą zawierać specjalne składniki, takie jak czynniki

wzrostowe np. wybrane aminokwasy i witaminy potrzebne dla wzrostu szczepu

producenckiego będącego najczęściej mutantem auksotroficznym



Poza tym wprowadza się odpowiednio zoptymalizowany zestaw soli mineralnych

potrzebnych do wzrostu komórek i biosyntezy antybiotyku oraz CaCO

3

jako czynnik

neutralizujący powstające kwasy organiczne.

18

Wykład 14

10

Prekursory wzrostu

Produkcja penicyliny



L-cysteina



L-walina



Kwas L-α-aminoadypinowy

19

Prekursory produktu końcowego

Produktem naturalnej biosyntezy

antybiotyków jest zwykle kompleks

kilku lub nawet kilkunastu

podobnych metabolitów o różnej

aktywności

antybiotycznej,

toksyczności i innych cechach

farmakologicznych

Przykładem jest powstawanie

kompleksu kilku naturalnych

penicylin w normalnej hodowli

Penicillium chrysogenum

20

Wykład 14

11

Prekursory produktu końcowego

Celem procesu biotechnologicznego

z użyciem Penicillium chrysogenum

powinno być natomiast wytwarzanie z

największą wydajnością jednego tylko

produktu penicyliny benzylowej

(penicyliny G)

Jej selektywne powstawanie uzyskuje

się, dodając do bioreaktora prekursory

zawierające resztę fenylooctanową

Kwas
fenylooctowy

Penicylina G

21

Prekursory produktu końcowego

Gdy substrat zawiera resztę

fenoksyoctanową,

wynikiem

biosyntezy jest fenoksymetylowa

penicylina V, nowa biosyntetyczna

penicylina, nie występująca wśród

produktów biosyntezy naturalnej.

Penicylina V

Kwas
fenoksyoctowy

22

Wykład 14

12

Synteza penicylin – warunki prowadzenia procesu



Biosynteza antybiotyków „nie jest związana” ze szlakami
metabolicznymi odpowiedzialnymi za wzrost drobnoustrojów



Klasycznym

sposobem

prowadzenia

procesu

biosyntezy

antybiotyków, których powstawanie nie jest bezpośrednio związane
ze wzrostem drobnoustrojów, stanowi hodowla okresowa z zasilaniem
(FBC, ang. feed batch culture).

23

Synteza penicylin – warunki prowadzenia procesu



Proces biosyntezy penicyliny prowadzony jest zazwyczaj w

bioreaktorach o pojemności 150 -200 m

3

wyposażonych w

mechaniczne mieszadło tarczowo-łopatkowe i bełkotkę oraz w układy

regulacji temperatury, szybkości przepływu powietrza, natlenienia

podłoża, dozowania pożywek i prekursorów

24

Wykład 14

13

Synteza penicylin – etap I procesu produkcji

Pierwsza faza - namnażanie grzybni,
trwająca 36-40 godzin, charakteryzuje
się szybką asymilacją składników
podłoża i intensywnym oddychaniem
komórek,

Podczas początkowego namnażania
komórek korzystna jest temperatura
około 27°C, po czym obniża się ją do
24-25°C.

faza wzrostu
(trofofaza)

faza

przej

ściowa

faza produkcji (idiofaza)

%

1

0
0

zasilanie hodowli
glukozą,
źródłem azotu
i prekursorem

25

Synteza penicylin – etap II procesu produkcji

Po wyczerpaniu się zasadniczej

ilości

łatwo

przyswajalnych

składników podłoża, a zwłaszcza

glukozy, może występować krótka

faza przejściowa, w której zachodzi

ograniczenie wzrostu grzybni i

derepresja syntezy enzymów

szlaku biosyntezy penicyliny

faza wzrostu
(trofofaza)

faza

przej

ściowa

faza produkcji (idiofaza)

zasilanie hodowli
glukozą,
źródłem azotu
i prekursorem

26

Wykład 14

14

Synteza penicylin – etap III procesu produkcji

Faza produkcji (idiofaza)

Charakteryzuje

się

ona

zredukowaną szybkością wzrostu
biomasy i intensywną syntezą
penicyliny.

Stosuje się ciągłe, powolne
dozowanie laktozy (eliminując w
ten sposób mechanizm represji
katabolicznej)

oraz

kwasu

fenylooctowego (prekursora).

faza wzrostu
(trofofaza)

faza

przej

ściowa

faza produkcji (idiofaza)

zasilanie hodowli
glukozą,
źródłem azotu
i prekursorem

27

Regulacja źródłem węgla

Produkcja penicyliny przez Penicillium chrysogenum

Wymaga zniesienia ogólnometabolicznego układu

represji katabolicznej

Decyduje nie rodzaj źródła węgla, ale szybkość jego

metabolizmu

Represja kataboliczna



synteza kwasu L-α-aminoadypinowego (L-α-AA)



synteza

syntetazy

L-α-aminoadypinoilo-L-

cysteinylo-D-waliny (syntetazy ACV)



synteza syntazy izopenicyliny N (syntazy IPN)

28

Wykład 14

15

Regulacja fosforanowa

Produkcja penicyliny przez Penicillium chrysogenum

Wymaga zniesienia ogólnometabolicznego

układu represji katabolicznej

Nadmiar jonu fosforanowego pogłębia efekt

represji katabolicznej



stymuluje transport glukozy do komórki



stymuluje metabolizm glukozy

29

Regulacja związkami azotu

Produkcja penicyliny przez Penicillium chrysogenum

Wymaga obecności glutaminy jako

donora grupy aminowej w syntezie

aminokwasowych

prekursorów

penicyliny

Nadmiar jonu amonowego powoduje

represję syntetazy glutaminowej

30

Wykład 14

16

Synteza penicylin – etap III procesu produkcji



Wydajna produkcja penicyliny wymaga utrzymania szybkości wzrostu biomasy

podczas fazy produkcji na określonym poziomie



W tradycyjnej technologii w fazie produkcji powolny wzrost grzybni pozostaje w

ścisłej korelacji z asymilacją wolno przyswajanej laktozy.

31

Synteza penicylin – etap III procesu produkcji



Zbyt niskie stężenie glukozy, a także źródła azotu i siarki w fazie produkcji

penicyliny prowadzi do autolizy grzybni i obniżenia wydajności antybiotyku,



Dozowanie tych składników do podłoża podczas intensywnej produkcji penicyliny

umożliwia natomiast znaczne przedłużenie procesu biosyntezy i uzyskanie wyższej

wydajności produktu.

32

Wykład 14

17

Synteza penicylin – podsumowanie



Morfologia grzybni Penicillium chrysogenum w procesie biosyntezy penicyliny

zależy od



szczepu,



składu podłoża,



pH



warunków mieszania (typu bio-reaktora);

mogą tworzyć się luźne kłaczki, mniej lub bardziej zwarte kuleczki (pellets) o

wymiarach poniżej 1mm (w większych pojawia się centralna strefa autolizy

grzybni na skutek niedotlenienia) lub rozwija się grzybnia nitkowata, tworząca

gęstą zawiesinę w podłożu hodowlanym

33

Synteza penicylin – podsumowanie



Dlatego przez cały czas fermentacji penicylinowej prowadzi się intensywne

napowietrzanie podłoża (0.5-1.0 wm), utrzymując stopień natlenienia hodowli

powyżej 30% stanu nasycenia.

34

Wykład 14

18

Synteza penicylin – podsumowanie



Wzrost w postaci kuleczek, względnie gęstych kłaczków, sprzyja obniżeniu lepkości

zawiesiny hodowlanej, a to ułatwia mieszanie i napowietrzanie hodowli, a następnie

oddzielenie grzybni od podłoża pohodowlanego. Taka postać grzybni może jednak

powodować limitację procesów metabolicznych na skutek dużych oporów na drodze

dyfuzji substratów i produktów, a zwłaszcza tlenu wewnątrz zwartych skupisk

komórek. Jeżeli jednak kuleczki grzybni są małe i dostatecznie luźne, można

uzyskać wydajną produkcję penicyliny.

35

Produkcja dekstranu



Dekstran jest α-glukanem, zawierającym różne wiązania, zależnie od organizmu,

który go wytwarza; jest produkowany przez wiele bakterii gram-dodatnich i gram-

ujemnych, włącznie z Leuconostoc mesenteroides i różnymi gatunkami

Streptococcus



Wytwarzany z sacharozy przez enzym

zewnątrzkomórkowy – dekstranosacharazę,

która prowadzi reakcję polimeryzacji glukozy,

pochodzącej z sacharozy z uwolnieniem

fruktozy do pożywki

36

Wykład 14

19

Produkcja dekstranu



Właściwości dekstranów mogą być zmieniane przez hydrolizę polimeru po jego

strąceniu z roztworu z użyciem egzo- i endodekstranaz lub przez traktowanie

słabymi kwasami, w celu uzyskania produktu charakteryzującego się masą

cząsteczkową o założonym zakresie

37

Produkcja dekstranu



Dekstran był pierwszym polisacharydem bakteryjnym produkowanym na skalę

przemysłową i jest wytwarzany przez firmę Pharmacia od około 50 lat.



Początkowo stosowany jako płyn krwiozastępczy



Obecnie dekstrany mają wiele zastosowań w medycynie m.in.



w zapobieganiu zakrzepicy



w opatrunkach jako absorbent płynu wysiękowego



również wykorzystywane w laboratoriach jako baza złoża stosowanego w

filtracji żelowej (Sephadex)



również stosowane jak dodatki do żywności

38

Wykład 14

20

Białka terapeutyczne



Składniki wielu tradycyjnych lekarstw



Naturalnie wystepujące białka otrzymywane ze zwierząt, roślin lub mikroorganizmów,

jak również z ciała ludzkiego (krwi, moczu, łożyska lub gruczołu przysadki), np.:



świńska insulina,



VIII i IX czynnik krzepnięcia krwi z frakcjonowania krwi ludzkiej,



pankreatyna jako wspomagacz trawienia



proteazy Ancrod i Batroxobin uzyskiwane z jadu żmii

Obce białka są immunogenne dla człowieka, co może prowadzić do gwałtownej interakcji i

uniemozliwiac powtórną aplikacje leku białkowego. Również izolacja tych białek z płynów i

tkanek niesie za sobą możliwość zakażenia wirusowego prowadząc do ryzyka infekcji

pacjentów innymi chorobami, np. wirusem HIV

39

Białka terapeutyczne



Białka terapeutyczne, takie jak hormony, czynniki wzrostu i różnicowania, odgrywają
rolę w przekazywaniu sygnałów, podczas gdy inne funkcjonują jako biokatalizatory
(enzymy) lub inhibitory, lub efektory układu immunologicznego (przeciwciała). Dlatego
używane są, by zastąpić, wzmocnić lub zahamować procesy fizjologiczne.



Najbardziej popularne są:



Erytropoetyna



Insulina



Somatotropina (ludzki hormon wzrostu)



Czynnik pobudzający wzrost kolonii granulocytów (G-CSF)



Interferon α



Przeciwciała monoklonalne

40

Wykład 14

21

Białka terapeutyczne



Najczęściej używanymi gospodarzami do produkcji białek

heterologicznych są



komórki ssaków



komórki owadów



drożdże



bakterie

41

Białka terapeutyczne



komórki ssaków



komórki jajnikowe chomika chińskiego (CHO), komórki nerki młodego chomika

(BHK) lub komórki szpiczaka myszy (NS0, SP/0)



można uzyskać wysoki poziom ekspresji białek (do 100 pg/dzień/komórkę)

wydzielanych do pożywki fermentacyjnej, poprawnie sfałdowanych i zazwyczaj z

modyfikacjami potranslacyjnymi zbliżonymi do ludzkich



Rozwój stabilnych linii komórkowych o wysokim poziomie ekspresji białek

terapeutycznych może wymagać wielu rund amplifikacji i zabierać wiele miesięcy

czasu, a koszty produkcji są duże



Stosowane głównie do produkcji glikozylowanych białek terapeutycznych, gdzie

wymagana jest poprawna modyfikacja białka, istotna dla efektu terapeutycznego

42

Wykład 14

22

Białka terapeutyczne



komórki ludzkie



Jednym ze sposobów zagwarantowania identyczności rekombinowanego produktu

białkowego z oryginalnym białkiem ludzkim jest użycie jako systemu ekspresji

komórek ludzkich



Zamiast klonować gen lub sekwencję DNA kodującą pożondane białko do komórki

gospodarza, manipuluje się promotorem w celu aktywacji ekspresji endogennego

genu ludzkiego

43

Białka terapeutyczne



komórki owadów



Gen kodujący pożądane białko jest wstawiany do genomu bakulowirusa, który bardzo

wydajnie infekuje komórki owada i wykorzystuje jego aparat metaboliczny do

przejściowej produkcji dużych ilości białka (do 500 mg/litr pożywki hodowlanej) w

ciągu 2-3 dni po infekcji



Wykorzystywany często do uzyskiwania w szybkim czasie małych ilości białka do

badań przedklinicznych

44

Wykład 14

23

Białka terapeutyczne



drożdże



Saccharomyces cerevisae, Pichia pastoris



Organizmy eukariotyczne rutynowo hodowane na dużą skalę



Rekombinantowe białka zazwyczaj znajdują się wewnątrz komórki, jednak

dołączenie odpowiednij sekwencji liderowej umożliwia sekrecję większości białek do

medium hodowlanego



Białka są poprawnie zwinięte i mają mostki disiarczkowe, ale glikozylacja różni się od

wzoru glikozylacji ssaków



Obecnie tylko jedno wprowadzone na rynek białko terapeutyczne – insulina – jest

produkowana z wykorzystaniem drożdży

45

Białka terapeutyczne - przykłady

Grupa leków

Przykłady białek

cytokiny i
antagoniści

Interferon alfa-2a
Interferon alfa-2b
Interferon alfacon-1
Peginterferon alfa-2a
Peginterferon alfa-2b
Interferon beta-1a
Interferon beta-1b
Interferon gamma-1b
Aldesleukin (IL-2)
Filgrastim (G-CSF)
Pegfilgrastim
Lenograstim (G-CSF)
Molgramostim (GM-CSF)
Sargramostin (GM-CSF)
Tasonermin (TNF-α)
Becaplermin (PDGF-BB)
Oprevelkin (IL-II)
Anakinra (IL-IRA)

Grupa leków

Przykłady białek

hormony i peptydy

Insulina
Insulina lispro
Insulina aspart
Insulina glargine
Epoetyna alfa (erytropoetyna)
Epoetyna beta (erytropoetyna)
Epoetyna delta (erytropoetyna)
Darbepoetyna-alfa
Folitropina alfa
Folitropina beta
Glukagon
Somatotropina
Lutropina-alfa
Teriparatide (PTH I-34)
Kalcytonina z łososia
Tyrotropina-alfa
Choriogonadotropina A2
Osteogeniczne białko 1
Dibotermina alfa (BMP-2)
Pegvisomat (antagonista hGH)
Nesirtide (peptyd natriuretyczny)

46

Wykład 14

24

Białka terapeutyczne - przykłady

Grupa leków

Przykłady białek

czynniki
krzepliwości i
inhibitory

Eptacog alfa
Czynnik antyhemofilowy
Moroktokog alfa (muteina FVIII)
Nonacog alfa
Desirudyna
Lepirudyna
Drotrekogina alfa (aktywowana białkiem C)
Inhibitor α1-proteinazy

Grupa leków

Przykłady białek

enzymy

Alteplaza (t-PA)
Reteplaza (muteina t-PA)
Tenekteplaza (muteina t-PA)
Monteplaza (muteina t-PA)
Dornaza-alfa (RNaza)
Imigluceraza
Agalzydaza alfa
Agalzydaza beta
Resburykaza
Laronidaza

47

Białka terapeutyczne - przykłady

Grupa leków

Przykłady białek

szczepionki

Szczepionka przeciw zapaleniu wątroby
Szczepionka przeciw boreliozie
Szczepionka di-per-te (przeciw błonicy,
teżcowi I krztuścowi)
Szczepionka przeciw rotawirusom

Grupa leków

Przykłady białek

białka fuzyjne

Denileukin diftitoks
Etanercept
Alefacept

48

Wykład 14

25

Białka terapeutyczne



Bakterie



Jako systemy ekspresyjne zapewniają szybki rozwój, dużą wydajność i względnie
niedrogą produkcję



Białka mogą być akumulowane wewnątrzkomórkowo lub wydzielane do przestrzeni
periplazmatycznej (E. coli) lub do pożywki fermentacyjnej (Bacillus spp.)



Brak modyfikacji potranslacyjnych i prawidłowego zwijania białek eukariotycznych,
ponadto na końcu aminowym, gdzie może być obecna reszta N-formylometioniny
(można ominąć to dołączając koniec fuzyjny np. His-tag, który po ekspresji może być
wykorzystany przy oczyszczaniu i jest odcinany za pomocą odpowiedniej proteazy)



Niekiedy białka eukariotyczne mogą być błędnie fałdowane i akumulują się w
nierozpuszczalne tzw. ciała inkluzyjne, wymagające dalszej obróbki



System nadaje się do produkcji białek nie wymagających obróbki potranslacyjnej

49



Szczepionki – mają na celu przygotowanie organizmu do obrony przed

mikroorganizmami chorobotwórczymi; są to preparaty biologiczne pobudzające

odpowiedź immunologiczną organizmu prowadząc do wytworzenia swoistych

przeciwciał skierowanych przeciw określonemu patogenowi.



W przypadku wirusów najczęściej antygenami są białka kapsydu lub otoczki

wirusów i to one odpowiadają za wytworzenie odpowiednich przeciwciał

Wykorzystanie wirusów w medycynie

50

Wykład 14

26

Szczepionki pierwszej generacji:



Inaktywowane – tworzone z całych cząstek wirusowych, traktowanych związkami chemicznymi

lub z cząstek poddanych działaniu czynników fizycznych, w celu pozbawienia właściwości

chorobotwórczych, ale z zachowaniem właściwości antygenowych; np. szczepionki przeciwko

wściekliźnie, kleszczowemu zapaleniu mózgu, czy poliomyelitis (choroba Heinego-Medina)



Atenuowane – zawierają całe cząstki wirusowe, ale osłabione, najczęściej przez delecje genów

odpowiedzialnych za chorobotwórczość wirusów; np. szczepionki przeciwko odrze czy różyczce;

zaletą tych szczepionek jest możliwość podawania małej dawki wirusów i wysoka stymulacja

układu odpornościowego , wynikająca z zachowania zdolności wirusa do namnażania się

Wykorzystanie wirusów w medycynie

51

Szczepionki drugiej generacji:



Podjednostkowe – zawierają jedynie najbardziej immunogenne antygeny, czyli białka otoczki

wirusa; np. szczepionka przeciw WZW typu B i grypie

Szczepionki trzeciej generacji:



Szczepionki DNA – wywołują bardzo silną reakcję układu immunologicznego; immunizacja

następuje na drodze bezpośredniego wprowadzenia genów kodujących białka antygenu, które

następnie ulegają ekspresji w komórkach gospodarza; szczepionki są w fazie badań

klinicznych; np. szczepionki przeciwko wirusom HIV, WZW B i C, cytomegalii, opryszczki,

wścieklizny, grypy, HPV.

Wykorzystanie wirusów w medycynie

52

Wykład 14

27

Wykorzystanie wirusów w medycynie



Terapia genowa:



SUPLEMENTACYJNA – dostarczenie komórce prawidłowej kopii genu, który

będzie ulegał transkrypcji obok genu wadliwego



SUPRESYJNA – hamowanie ekspresji genu, który wymknął się spod kontroli,

wprowadzany jest gen, którego toksyczny produkt prowadzi do śmierci

zainfekowanej komórki, np. w komórkach nowotworowych

53

Wykorzystanie wirusów w medycynie



Najczęściej stosowanymi wektorami w terapii genowej są wirusy, ponieważ:



naturalnie wprowadzają swój materiał genetyczny do komórki gospodarza



samodzielnie replikują z wykorzystaniem aparatu metabolicznego gospodarza



infekują kolejne komórki

54

Wykład 14

28

Wykorzystanie wirusów w medycynie



Dostarczenie genu do wybranych komórek umożliwiają dwie metody:



ukierunkowanie transdukcyjne - takie przekształcenie wirusów, aby

infekowały tylko komórki nowotworowe, np. poprzez dołączenie cząsteczek

rozpoznających komórki chorobowo zmienione do białkowej osłonki wirusa



ukierunkowanie transkrypcyjne - takie przekształcenie wirusów, aby

transkrypcja genu zachodziła tylko w komórkach nowotworowych; polega na

zastosowaniu promotorów aktywowanych białkami, wytwarzanymi przez chore

komórki, tak aby geny niesione na wektorze ulegały ekspresji wyłącznie

wewnątrz takich komórek

55

Wykorzystanie wirusów w medycynie



Najczęściej wykorzystywane są genomy pochodne :



Adenowirusów



Herpeswirusów



Parwowirusów



Retrowirusów



Modyfikacje tych wirusów obejmują usunięcie genów odpowiedzialnych za wirulencję,
rekombinację i replikację



Należy jednak pamiętać, że DNA wirusowe może połączyć się z DNA ludzkim w innym
miejscu, niż oczekiwane, co może mieć poważne niepożądane skutki. Również istnieje
ryzyko wystąpienia silnej odpowiedzi immunologicznej, przez co wektory te nie są w
pełni bezpieczne.

56

Wykład 14

29

Prezentacja białek:



Technika prezentacji białek na powierzchni fagów (phage display) jest wydajną

metodą przesiewową stosowaną w badaniach nad oddziaływaniem pomiędzy

białkami



Po raz pierwszy zastosowana w 1985 roku do ekspresji antygenów w fagu M13



Znajduje ona szerokie zastosowanie w poszukiwaniu i identyfikacji różnych białek –

począwszy od krótkich peptydów, aż po fragmenty przeciwciał, czy hormony



Umiejscowienie białka na zewnątrz kapsydu umożliwia również wykrycie i

charakterystykę ligandów, które oddziałują z badanym białkiem

Wykorzystanie bakteriofagów w medycynie

57

Prezentacja białek:



Obecnie najczęściej używanym fagiem jest fag M13 infekujący bakterie E. coli



Fag typu filamentowego z genomem (6407 nt) w postaci kolistego, jednoniciowego DNA o

dodatniej polarności



Otoczony płaszczem białkowym



Najczęściej określone sekwencje nukleotydowe klonuje się w obrębie genów kodujących

drugorzędowe białko płaszcza (gpIII) lub genu głównego białka płaszcza (gp VIII)

Wykorzystanie bakteriofagów w medycynie

58

Wykład 14

30

Wykorzystanie bakteriofagów w medycynie

Terapia fagowa



Pionierskimi placówkami naukowymi o ogromnym wkładzie w terapię fagową były

ośrodki w Gruzji i w Polsce. Kraje te nie zaprzestały badań nad terapeutycznym

wykorzystaniem fagów po odkryciu i wprowadzeniu antybiotyków do powszechnego

leczenia.



W Polsce pierwsza publikacja na temat terapii fagami „O bakteriofagji” Jerzego

Jasieńskiego ukazała się w „Chirurgii klinicznej” w 1927 roku,

59

Wykorzystanie bakteriofagów w medycynie

Terapia fagowa



W Polsce pierwszy udokumentowany przypadek wyleczenia chorego z

wykorzystaniem fagów odnotowano w roku 1942. Pacjentką była Maria Dąbrowska

(pisarka), którą wyleczono z ropnego zapalenia miedniczek nerkowych,

spowodowanego infekcją bakteriami Escherichia coli.

60

Wykład 14

31

Wykorzystanie bakteriofagów w medycynie

Terapia fagowa



Bakteriofagi (wirusy bakterii) są bardzo specyficzne wobec gatunków i konkretnych

szczepów bakterii, a jednocześnie łagodne dla makroorganizmu, w którym rozwija

się infekcja



W przypadku ich użycia muszą być spełnione dwa warunki:



Konieczna jest dobra i szybka diagnostyka dla zidentyfikowania szczepu

gospodarza



Bakteriofag musi być natychmiast dostępny dla tego szczepu

61

Wykorzystanie bakteriofagów w medycynie



Zalety stosowania terapii fagowej:



Są specyficzne dla konkretnych gatunków, a nawet szczepów bakterii



Efekty uboczne są minimalne, ponieważ bakteriofag nie atakuje komórek

makroorganizmu



Bakteriofag ulega fagocytozie (usuwanie przez pochłonięcie i zniszczenie przez

białe ciałka krwi), tak więc usunięcie ich z organizmu jest szybkie



Alternatywa dla antybiotykoterapii, zwłaszcza w walce z bakteriami

antybiotykoopornymi

62

Wykład 14

32

Wykorzystanie bakteriofagów w medycynie



Wady stosowania terapii fagowej:



Wąskie spektrum działania – łatwiej i szybciej można zastosować antybiotyki o

szerokim spektrum działania



Konieczność wcześniejszego przygotowania odpowiednich preparatów

skierowanych na konkretny gatunek lub szczep bakterii



Może pojawić się odpowiedź immunologiczna ze strony makroorganizmu, u

którego już wcześniej został zastosowany dany preparat bakteriofagowy, co

może być problematyczne przy powtórnym jego użyciu

63

Wykorzystanie bakteriofagów w medycynie

Terapia fagowa



Potencjalnym zagrożeniem przy zastosowaniu preparatów fagowych może być

wstrząs wywołany przez uwolnienie endotoksyn i egzotoksyn z bakterii, zlizowanych

przez fagi



in vivo (w organizmie poddanym terapii fagowej) – prowadzone są badania mające na celu

zminimalizowanie tego efektu; antybiotyki również mogą wywoływać taka reakcję



in vitro (przy produkcji preparatów fagowych) – preparaty są odpowiednio oczyszczane i

eliminowane są ewentualne toksyny

64

Wykład 14

33

Bakteriofagi i antybiotyki w terapii

BAKTERIOFAGI

ANTYBIOTYKI

Bezpieczne w stosowaniu, nie powodują poważnych

efektów ubocznych

Różne efekty uboczne, m.in. zaburzenia w

funkcjonowaniu układu pokarmowego, alergie, infekcje

wtórne

Replikują i koncentrują się w miejscu infekcji, tak długo,

jak długo obecne są wrażliwe na nie bakterie

Są metabolizowane i eliminowane z organizmu, nie

koncentrują się w miejscu infekcji

Wysoko specyficzne i bardzo efektywne w niszczeniu

docelowych komórek bakterii patogennych, pozwalają na

uniknięcie infekcji wtórnej; nie niszczą naturalnej

mikroflory bakteryjnej

Mogą być używane bez znajomości szczepu bakterii

wywołującej chorobę

Niszczą zarówno bakterie patogenne, jak i mikroflorę

naturalną, co może prowadzić do poważnych infekcji

wtórnych

Bakterie oporne na jeden typ faga pozostają wrażliwe na

inne fagi

Stosowanie antybiotyków może wywołać

wyselekcjonowanie bakterii lekoopornych, zarówno

będących celem ich działania, jak i innych

Wyselekcjonowanie nowych fagów jest procesem krótkim,

trwa kilka dni – tygodni, i stosunkowo niedrogim

Wytworzenie nowego antybiotyku jest procesem

długotrwałym, trwa kilka lat i jest bardzo kosztowne

65

Wykorzystanie bakteriofagów w medycynie



Innym podejściem w terapii fagowej jest zastosowanie jedynie enzymu pochodzenia

fagowego, skierowanego przeciw konkretnym bakteriom



Vincent Fischetti (Uniwersytet Rockefellera, USA) zastosował enzym fagowy lizynę

z faga C1, skierowany przeciwko bakteriom z rodzaju Streptococcus z grup A, C i E,

powodujących zapalenie gardła. Wyniki badań wskazały na bardzo dużą

skuteczność takiej terapii.



Naukowcy z tego Uniwersytetu również posłużyli
się fagową lizyną PlyG, skierowaną przeciwko
Bacillus anthracis w celu wykrywania tej bakterii
oraz przy leczeniu wąglika

66