Zjawisko fluorescencji polega na przejściu w sposób promienisty z najniższego poziomu oscylacyjnego stanu S₁ do stanu podstawowego S­₀ po uprzednim wzbudzeniu fluoroforu kwantem światła do jednego z singletowych stanów wzbudzonych.

Diagram jabłońskiego - wypiszę tylko czasy procesów:

Absorpcja 10^-15s, Konwersja wewnętrzna 10^-12s, Fluorescencja 10^-8s, Nieradiacyjne przejście z S₁ do S₀ -10^-8s, Konwersja międzysystemowa 10^-8s, Fosforescencja 10²-10^-4s. Zgodnie z pracą doktorską (którąś) przejście bezpromieniste T₁S₀ jest zabronione, jednak na foliach od niego jest ono pokazane (u Kowalowej też chyba było). Jeśli nastąpią dwie konwersje międzystemowe: S₁T₁S₁ to z S­₁ może zajść tzw. fluorescencja opóźniona. Nie różni się ona od zwykłej fluorescencji widmem emisji różni się tylko natężeniem oraz czasami emisji (to jest podobne jak dla fosforescencji).

Przejście pomiędzy singletem a trypletem - konwersja spinowa

Fosforescencja - większa długość fali, trzeba się pozbyć tlenu bo jest on wygaszaczem fosforescencji.

Teraz wzorki:

Wydajność kwantowa czyli stosunek ilości fotonów emitowanych do absorbowanych. Oznaczana jako Q lub Φ
gdzie n_e/a -ilość fotonów wyemitowanych/zaabsorbowanych, Γ - stała szybkości fluorescencji, k_bp - stała szybkości procesów bezpromienistych, F- liczba kwantów światła fluorescencyjnego, F_∞­ - ilość kwantów światła fluorescencyjnego w przypadku gdyby deekscytacja każdego stanu wzbudzonego zachodziła wyłącznie przez zjawisko fluorescencji. Wydajność rośnie ze wzrostem temperatury układu.

Czas życia fluorescencji - średni czas który cząsteczka spędza w stanie wzbudzonym S₁ zanim powróci do stanu podstawowego. Czas po którym intensywność fluorescencji maleje e-krotnie (zanik eksponencjalny).

Czas życia fluoroforu w nieobecności przejść bezpromienistych nazywa się naturalnym (wewnętrznym) czasem życia
. Dodatkowo

Zanik emisji fluorescencji - charakter wykładniczy:
- to model zaniku monoeksponencjalnego. Jednak zazwyczaj jest trudniej - kombinacja szeregu eksponent:
. Gdzie F₀ natężenie emisji na początku pomiaru, F - natężenie emisji po czasie t, α_i - udział i-tej komponenty opisanej czasem życia τ_i w całkowitym czasie życia τ.

Udział i-tej komponenty w całkowitej emisji fluoroforu:

On opisuje kinetykę zaniku używając N czyli dN/dt=-k[N] i dalej N(t)=N(0)exp(-τ/t) tak ładnie matematycznie to napisał.

Wszystkie procesy konkurujące z fluorescencją mogą skracać czasy życia

Jeśli czas impulsu jest porównywalny z czasem życia to pomiar jest pomiarem technicznym - trzeba oddzielić inne sygnały aby uzyskać sygnał od białka.

Jeśli próbkę oświetlamy to I_A=I₀-I (natężenie padające - wychodzące), ponieważ I=I₀e^-kcl (Lambert Beer)to I_A=I₀(1-e^-kcl). Natężenie fluorescencji jest zależne od ilości pochłoniętego światła:

I_F =QI_A=Q I₀(1-e^-kcl) z rozpisania e^-kcl i pominięcia trudniejszych członów (Skrypt Anal 91) otrzymujemy, że:

I_F=KI₀cl (gzdie K=Qk) - zależność fluorescencji od stężenia fluoroforu.

Wpływ rozpuszczalnika na parametry emisji - zazwyczaj najwyraźniejszy jeśli polarny fluorofor w polarnym rozpuszczalniku. Część zjawisk zależy od specyficznych oddziaływań cząsteczek fluoroforu z jedną lub kilkoma cząsteczkami z najbliższego otoczenia (określana przez właściwości chem. Fluoroforu i rozp.) Są też ogólne wpływy rozpuszczalnika zależne od globalnych właściwości fizycznych rozp. Stałej dielektrycznej (ε) i współczynnika załamania światła (n) oraz od zmiany dipola elektrycznego fluoroforu wskutek wzbudzenia. Często cząsteczki fluoroforu nie mogą tworzyć wiązań wodorowych. Ogólne wpływy dobrze opisuje równanie Lipperta:

Reguła Stockesa - maksimum emisji przesunięte w kierunku fal dłuższych względem maksimum absorpcji

Reguła Wawiłowa/Kashy - wydajność i rozkład widma fluorescencji nie zależą od długości fali światłą wzbudzającego (jeśli wzbudzenie jest w paśmie Stockesowskim). W antystokesowskiej części pasma widma wzbudzającego reguła ta nie jest spełniona - im większa dł. fali światła wzbudzającego tym mniejsza wydajność

Reguła symetrii zwierciadlanej - bardzo często widmo emisyjne wygląda jak odbicie lustrzane widma absorpcji (ściślej pasma absorpcyjnego odpowiadającego przejściu S_oS₁) pod warunkiem, ze oba widma przedstawione są w skali częstości. Pozornie niespełnione gdy wzbudzenie następuje także do poziomów wyższych niż S₁ - np. S₂.

Rzeczywiste odstępstwa od tej reguły mogą zachodzić w przypadkach:

• różne geometryczne układy jąder w stanie S₀ i S₁ (bo długo przebywa w fazie S₁)

• reakcja stanu wzbudzonego - tworzenie dimerów (ekscimerów) albo kompleksów (eksipleksów) z innymi substancjami

• różnych kwasowości cząsteczki w stanie wzbudzonym i podstawowym.

Gaszenie fluorescencji

F+hνF^* (k_a)

F^*F+hν' (k_f)

F^*F (k_m)

F^*+Q[F^*…Q]F+Q+c (k_q pierwsza strzałka)Q-wygaszacz

Możemy napisać równania kinetyczne: d[F^*]/dt=k_a .... dla pozostałych przypadków -d[F^*]/dt i odpowiednie podstawienie np.: -d[F^*]/dt=k_q[F^*][Q]

Jeśli natężenie światłą wzbudzającego jest stałe to w układzie ustala się równowaga - szybkość wzbudzania = szybkość deekscytacji, zatem:

K_a=(k_f+k_m+k_q[Q])[F^*]

Zatem:
Jeśli nie ma wygaszacza z mianownika usuwamy człon wynikający z jego obecności. τ₀ czas życia przy 0 stężeniu wygaszacza.

- równanie Sterna-Volmera

F/F₀ - natężenia fluorescencji w obecności/braku wygaszacza.

K_sv =k_qτ₀ (stała Sterna Volmera)

- inna postać tego równania

Zatem w ukł. współrzędnych (F₀/F) w funkcji [Q] przewiduje się zależność liniową o nachyleniu równym K_SV. - Przy czym można mierzyć proces bimolekularnego gaszenia jako zmniejszenie intensywności lub skrócenie czasu fluorescencji.

Częstość zderzeń wygaszacza z fluoroforem zależy od stałej szybkości k_D. Która jest związana z procesem dyfuzji równaniem Smoluchowskiego:

(R-promień oddziaływania kolizyjnego w przybliżeniu suma promieni cząsteczkowych wygaszacza i fluoroforu, D suma współczynników dyfuzji zderzających się cząsteczek, N - liczba Avogadro).

Współczynnik D można wyliczyć z równania Stockesa-Einsteina

η-lepkość, k -stała Boltzmana, T-temperatura w Kelwinach, R-promień cząsteczki (chyba).

k_q=k_Dγ γ-wydajność procesu gaszenia dynamicznego. Jeśli stosujemy wydajne wygaszacze (γ=1) to k_q=k_D. (γ=1 m.in. dla tlenu, akrylamidu, dichloroacetamidu i I^-)

Reakcja z wygaszaczem to reakcja drugiego rzędu.

przy czym nie podał żadnego równania w którym pojawia się k₂. k₁ i k_-1 są stałymi tworzenia i rozpadu kompleksu [A^*......Q]

Zależność F₀/F od [Q] jest linią prostą tylko gdy w jednorodnym układzie fluoroforów obniżenie wydajności fluorescencji spowodowane jest wyłącznie gaszeniem dynamicznym (lub tylko statycznym - jedna praca doktorska, druga mówi, ze przy tylko statycznym jest odchylenie w dół...). Zależność jest krzywą wypukłą gdy dochodzi gaszenie statyczne. Jeśli układ jest niejednorodny krzywa odchyla się w dół (kilka fluoroforów lub jeden fluorofor w różnych konformacjach - różniące się czasami życia lub stałymi K_SV)

Powyższy model dotyczy gaszenia dynamicznego. Jeśli uwzględnimy gaszenie statyczne to:

τ i τ_o są sobie równe różni się tylko intensywność fluorescencji. Często równolegle występują oba gaszenia:

V -stała statycznego gaszenia (określa objętość wokół cząsteczki fluoroforu w której musi znaleźć się wygaszacz by doszło do gaszenia statycznego. V=vN/1000. V - rząd kilka M^-1 czyli objętość v około 10 A -porównywalne z odległościami Van der Waalsowksich oddziaływań.

Krzywa dla gaszenia dynamicznego w wyższej temperaturze ma większe nachylenie (większa dyfuzja) zaś dla gaszenia statycznego mniejsze (mniejsza trwałość kompleksu).

Wygaszanie dynamiczne - czyli kolizyjne zachodzi gdy wzbudzony stan fluoroforu ulega dezaktywacji wskutek zderzeń z pewnymi cząsteczkami zawartymi w roztworze . W procesie tym cząsteczki nie ulegają zmianom chemicznym. Wygaszacze takie to np.: I^-, BrO^-₄, tlenki azotu, nitrozwiązki, szereg amin, akrylamid, tlen.

Wygaszanie statyczne - fluorofor tworzy niefluoryzuajcy kompleks z wygaszaczem (przed wzbudzeniem lub w chwili wzbudzenia {cześć źródeł})

Część wygaszaczy może penetrować do wnętrza białka (np. tlen) a część jest za duża - anion jodkowy. Można więc badać strukturę białka - oraz dynamikę - np. po dodaniu liganda reszta Trp może ulec ekspozycji i gaszeniu.

By wygaszacz mógł wejść do środka musi nastąpić zmiana konformacji białka (a tego nie jestem pewien ale tak powiedział)

Rysunek w foliach od niego i w notatkach Weroniki - Taki ze strzałkami.

Dodatkowo inne wersje wzorów są u niego na pierwszej stronie z fluorescencji - są wzory z intensywnością świecenia - zerknijcie tam - przepisywanie ich tu nie ma sensu - symbole które się tam pojawiają są wyjaśnione u mnie. Są tam też wykresy co może pomóc...

Metoda FQRS - Fluorescence Quenching Resolved Spectrum

Warto się nauczyć bo to chyba on ja opracował - tak wynika z bibliografii prac doktorskich.

Heterogeniczny układ fluoroforów należy rozpatrywać jako zbiór komponent, z których każda charakteryzuje się własną fluorescencją F_i a ich suma to całkowita fluorescencja układu

Widmo fluorescencji uzyskane ze stacjonarnych pomiarów możemy rozłożyć na widma składowe poszczególnych komponent znając udział i-tej komponenty f_i w całkowitej fluorescencji
. W technice FQRS rozdziału widma dokonuje się w oparciu o różnice w K_SV pomiędzy poszczególnymi komponentami. Dokonuje się pomiarów widm fluorescencji przy wzrastającym stężeniu wygaszacza po czym dla danej długości fali dopasowuje się dane eksperymentalne do równania Sterna-Volmera przyjmującego dla układu heterogenicznego postać:

Chyba też tutaj pasuje dodać o uwzględnieniu gaszenia statycznego - wtedy mianownik mnożymy przez

Wykonanie tego: widma dla rosnących stężeń wygaszacza, robimy zależność dla wielu (np. 50) długości fali F od [Q]. Potem dopasowujemy równanie Sterna Volmera (dla układów heterogenicznych z uwzględnieniem gaszenia statycznego lub nie) dla każdego z tych zbiorów punktów (zależność F od [Q] w rożnych dl. Fali). Na koniec wykreśla się wykresy FQRS czyli zależność od dl. Fali:

• dopasowanych stałych K_SV (i ew V_i)

• intensywności frakcji:
  

Anizotropia fluorescencji

Jeśli umieścimy polaryzatory przed i za próbka to:

Anizotropia

Polaryzacja

Zależności między nimi:

W praktyce oblicza się uwzględniając poprawki dla różnych ustawień polaryzatorów:

gdzie

G to współczynnik korekcyjny i ponoć (z wykładu) powinien być zwykle bliski 1.

W którejś pracy zdefiniowano stopień depolaryzacji jako:
(F to raczej to samo co I) i r można wyrazić wtedy wzorem:
.

Anizotropia emisji różni się w zależności od tego czy wzbudzamy substancję światłem liniowo spolaryzowanym czy naturalnym. Okazuje się, ze relacja miedzy tymi anizotropiami to r=2r_n gdzie r_n to anizotropia światła naturalnego. (czyli nie trzeba polaryzatorów?? Nie rozumiem tego)

Jak oświetlamy próbkę to światłem liniowo spolaryzowanym to wzbudzeniu ulegają tylko te cząsteczki fluoroforu, których dipol przejścia absorpcyjnego jest równoległy do wektora pola elektrycznego światła padającego na próbkę (fotoselekcja). Podstawą pomiaru anizotropii jest to, że cząsteczki emitują światło spolaryzowane. Intensywność emisji mierzy się prostopadle do kierunku wzbudzenia.

Maksymalna mierzona anizotropia (r₀) Gdyby w ogóle nie było ruchu fluoroforu zależy tylko od kąta między dipolami przejść dla absorpcji i emisji.

I ta zależność w różnych źródłach różnie - u Politowej na ćwiczeniach było, że r­₀ mieści się pomiędzy -0,2 (kąt 90 stopni) a 0,4 (kąt 0 stopni) a wzór jest: r₀=1/5 (3cos²γ-1)

Zaś w pracy doktorskiej jest, że:
z czego wynika że wartości r₀ mieszczą się pomiędzy ½ a -1/3. Oczywiście greckie literki w obu tych wzorkach to ów kąt przejścia. Być może da się te wzory wzajemnie w siebie przekształcić ale ja nie wiem jak.

Wasyl podaje jeszcze wzór® na r w zależności od tego kąta:
chociaż ma tutaj problem z oznaczeniem tych katów i używa różnych literek wiec pewien nie jestem o co chodzi.

„kąt magiczny” jeśli pomiędzy dipolami jest kat 54,7˚ to r₀=0,00

Szereg czynników decyduje o obniżeniu wartość r poniżej maksymalnej. Najczęściej przyczyną jest dyfuzja rotacyjna cząsteczek (zachodzi w czasie życia fluorescencji i przemieszcza dipol przejścia). Im szybciej się obraca fluorofor (np. razem z cząsteczka do której jest przyłączony) tym anizotropia mniejsza. Czyli im wyższa szybkość rotacji tym wyższy stopień depolaryzacji i niższa mierzona anizotropia.

Dla kolistych cząsteczek zjawisko depolaryzacji fluorescencji opisuje równanie Perrina (zakładając, że depolaryzacja tylko przez dyfuzję):

(w pracy doktorskiej postać kiedy obie strony podzielimy przez r₀) gdzie
to czas rotacyjnej korelacji (czyli czas potrzebny na jeden pełny obrót cząsteczki). Czas ten jest globalny (uśredniony) - Polit oznacza go też jako θ albo Θ (nie wiem czy małe czy duże)

Powyższy wzór on rozpisuje jako:
- czyli rozpiska. Znowu problem czy ma być R czy k

Zanik anizotropii w czasie:

Dla elipsoid:
(r_i - funkcja orientacji momentów przejść dla absorpcji i emisji względem siebie oraz względem głównych osi cząsteczki) zaś dla kuli:
. Dla elipsoid czasy korelacji się różnią - ale nie wiem jak bo jest problem w notatkach nie chce napisać źle

Czas korelacji (przy założeniu kolistości cząsteczki)

-kojarzycie, że gdzieś była błąd z tą k i R - ale tak jest chyba dobrze choć głowy sobie nie utnę ...

D- wsp. Dyfuzji rotacyjnej,

V - efektywna objętość termodynamiczna cząsteczki (V=M_cz(v_wł.+h)/N)

η - lepkość, k- stała Boltzmana, R-stała gazowa, T - temperatura w Kelwinach

M_cz - masa cząsteczkowa, M - masa molowa, N - liczba Avogadro,

v_wł - objętość właściwa cząsteczki (dla białek zwykle 0,73 ml/g)

h -stopień hydratacji (0,23 g H₂O na 1 g białka)

On ma tu jeszcze wzór na dyfuzję rotacyjna, ale jest konflikt oznaczeń wiec chyba się walnął.

Wykres Perrina - zależność anizotropii od lepkości - powinien być liniowy jeśli cząsteczki nie są kuliste to bark liniowości.

Jeśli czas korelacji wyszedł za krótki to możliwe, ze:

• pozostał niezwiązany znacznik w roztworze (rotuje szybciej)

• w pomiarach stacjonarnych - czas średni po wszystkich ruchach

• znacznik przyłączony do białka tez miał swobodę rotacji (a czas to średnia harmoniczna po ruchach cząsteczki i samego znacznika też to chyba poprzedni punkt o tym mówi)

• krótszy czas i nieliniowa zależność Perrina -znacznik ma dużą swobodę rotacji

w pomiarach rozdzielczych w czasie z krzywej zaniku fluorescencji można rozdzielić czasy pochodzące od poszczególnych (rodzajów ruchów?? Urwana notka)

Pamiętajcie, ze jak się zamrozi i nie zachodzi reorientacja cząsteczek to anizotropia się nie zmniejsza.

By zmieniać tempo reorientacji można zmieniać lepkość r-ru lub temperaturę.

Kolejny wzór na r - gdy jest szereg ruchów: r=∑f_ir_i

Anizotropię możemy mierzyć na dwa sposoby - w oświetleniu ciągłym (wyznaczamy czasy korelacji) lub metodą rozdzielczą w czasie. Tę drugą stosujemy gdy mamy kilka ruchów cząsteczki i nie możemy tego zmierzyć - uzyskujemy uśrednienie po wszystkich ruchach.

Fluorofory naturalne („wewnętrzne)

Aminokwasy aromatyczne (fenyloalanina, tyrozyna [często wygaszana przez inne aminokwasy w białku] i tryptofan, ale Phe bardzo słabo. Najlepszy jest tryptofan - omówiony później)

NADH i NADPH, oraz FMN i FAD, kwas tetrahydrofoliowy (słabo, ale sam układ pteryny jest lepszy), fosforan pirydoksalu. W NADH fluoryzuje zredukowany pierścień nikotynoamidowy. Utl. Forma nie fluoryzuje. W roztworze wodnym pierścień nikotynamidowy zbliża się do pierścienia adeninowego co powoduje wygaszenie fluorescencji (zarówno dynamiczne jak i statyczne) Ryboflawina i FMN mają porównywalne wydajności kwantowe (o rząd wielkości wyższe niż FAD).Wygaszanie fluorescencji flawinowej w FAD wynika z utworzenia wewnątrzcząsteczkowego kompleksu π-π

Porfiryny intensywnie fluoryzują po wzbudzeniu np. w paśmie Soreta pod warunkiem, ze nie zawierają jonu metalu. Wśród metaloporfiryn, właściwościami fluorescencyjnymi wyróżnia się chlorofil. On podał na wykładach, ze fluorescencja mogłaby konkurować z wybijaniem elektronu w fotosystemie.

Chinina - alkaloid - pierwszy odkryty fluorofor.

Nukleotydy i kwasy nukleinowe - zasadniczo brak fluorescencji - wyjątek zasada Y_t (nietypowa, występująca w antykodonowym obszarze drożdżowego tRNA dla Phe).

Białka fluoryzują - zazwyczaj na skutek obecności w nich reszt aromatycznych. (Inna kwestia, że białka mogą też wygaszać fluorescencję). Jednak w GFP trzy różne aminokwasy (grupy boczne) reagują tworząc nowy fluorofor. Białko pochodzi z meduzy Aequorea victoria. W trakcie formowania struktury GFB (β-baryłka) zachodzi spontanicznie (bez enzymu) oksydacyjna cyklizacja tyrozyny, glicyny i seryny (rysunek Anal 112). Zrobiono też białka fluoryzujące na inny kolor.

Kolagen i elastyna - wzbudzane światłem o długości poniżej 340 nm fluoryzują słabo w zakresie widzialnym. Za źródło przyjmuje się ugrupowanie hydroksypirymidyniowe - powstające wskutek tworzenia międzycząsteczkowych wiązań krzyżowych pomiędzy utlenionymi resztami lizyny.

Inne przykłady fluorescencji białek - poprzez przyłączenie fluoryzujących kofaktorów. Np. NADH - tłumaczy się to wymuszeniem przez kieszeń wiążąco rozciągnięcia konformacji koenzymu - mie zachodzi wewnątrzcząsteczkowe wygaszanie fluorescencji. Fluorescencja flawin we flawoproteinach jest zazwyczaj wygaszana przez tworzenie wiązań π-π z pierścieniem izzoalloksazyny (czyli wygaszanie statyczne)

Dlaczego tryptofan jest taki super?

• stosunkowo wysoka wydajność kwantowa (w 23˚C wynosi 0,13 w wodzie)

• Możliwość selektywnego wzbudzenia w paśmie absorpcji powyżej 295 nm

• Występuje w białkach dosyć rzadko (a do tego robi się mutanty w których usuwa się jedną/kilka reszt Trp) - upraszcza to interpretacje danych pomiarowych

• Najwyższy spośród fluoryzujących aminokwasów molowy współczynnik absorpcji - 5,6x10^-3dm³M^-1cm^-1 przy wzbudzeniu 280 nm

• Duże przesunięcie widma emisji w stosunku do pasma absorpcji

• Bardzo wrażliwy na polarność mikrootoczenia

• Wysoka anizotropia fluorescencji przydatna do badania procesów dyfuzji rotacyjnej makrocząsteczek.

• Szczególnie wrażliwy na procesy kontrolowanego bimolekularnego gaszenia fluorescencji. Reszta Trp w stanie wzbudzonym jest efektywnym donorem elektronów uczestniczących w tych procesach

Fluorescencja tryptofanu pochodzi od obecnego w jego budowie pierścienia indolowego. W wodzie w naturalnym pH Trp ma maks. Emisji w 355 nm. W białkach w zależności od polarności mikrootoczenia może mieć od 308 nm (hydrofobowe wnętrze białka np. azuryny) do 350 (a nawet 352 kiedy jest wyeksponowany tyle w ACTH). Hydrofobowe - fale krótkie, hydrofilowe, polarne - fale długie

Złożone właściwości spektralne tryptofanu i jego szczególna wrażliwość na polarność mikrootoczenia wynikają z istnienia 2 rodzajów przejść w długofalowym paśmie absorpcji pierścienia indolowego. Przejścia te oznacza się ¹L_a i ¹L_b. Odpowiadające im stany wzbudzone mają podobną energię, ale różne momenty dipolowe. ¹L_a ma większy moment dipolowy i dlatego w polarnym środowisku (oddziaływanie z cząsteczkami rozpuszczalnika) stan ten ma niższą energię więc zgodnie z regułą Kasha'y z niego jest powrót do stanu podstawowego (nie wiem jaki to ma związek z regułą Kasha'y mi bardziej podpada pod Stockesa). W apolarnym środowisku dominuje przejście ¹L_b charakteryzujące się większą energią przejścia (??). Przy wzbudzeniu powyżej 295 nm występują jedynie przejścia typu ¹L_a­ (kolejny powód do stosowania tej długości). On pisał na wykładach o apoazurynie. Jako przykład pośredni dał rybonukleazę T1 gdzie po wzbudzeniu w 295 nm była emisja w 325 nm (otoczenie hydrofobowe, ale mniej niż w apoazurynie)

Badania wykazały, że monoeksponencjalny model zaniku fluorescencji Trp w czasie jest rzadki. Sam Trp w roztworze wykazuje heterogeniczną fluorescencję, którą w pewnych warunkach da się nawet opisać jako sumę eksponent. W pH=7 Trp to jon obojnaczy - zanik dwueksponencjalny z czasami życia 3,1 i 0,53 ns. Forma krótkożyciowa ma widmo przesunięte w kierunku fal krótszych (335 nm) zaś długożyciowa w okolicy 350 nm. Tłumaczy się to istnieniem izomerów rotacyjnych Trp. Możliwość rotacji bocznych grup tryptofanu wokół wiązania C_α - C_β. (w doktorskiej piszą też o rotacji C_β-C_γ) Oczywiście w białku wszystko się komplikuje przez dodatkowe oddziaływania.

Badano też fluorescencję innych pochodnych indolowych i samego indolu.

Fluorofory obce („zewnętzrne”)

Dodaje się do układów niefluoryzujacych lub mających złe parametry fluorescencji.

Można znakować białka, błony, kwasy nukleinowe - wszystko przydatne do różnych badań. Białka mogą być znakowane kowalencyjnie (pochodne dansylu, 5-(jodoacetamido)fluoresceina (inne pochodne fluoresceiny też są wykorzystywane), 6-izotiocjanian tetrametylorodaminy) lub niekowalencyjnie (1,8 ANS - kwas 1,8-anilinonaftalenosulfonowy, TNS - kwas 6-(p-toluidynylo)naftaleno-2-sulfonowy). Pierwszy do znakowania białek został użyty chlorek dansylu. Barwniki do znakowania niekowlaencyjnego słabo fluoryzują w wodzie, natomiast po związaniu przez hydrofobowe obszary na powierzchni białka ich fluorescencja ulega wielokrotnemu wzmocnieniu.

Błony lipidowe znakuje się np. przez rozpuszczenie w błonie fluoroforu nierozpuszczalnego w wodzie (np. DPH). Innym podejściem jest przyłączenie lipofilowego znacznika do kwasu tłuszczowego lub fosfolipidu i wbudowanie takiego koniugatu w błonę - można lokalizować fluorofor na różnej głębokości - różne mikrootoczenia. Mierniki potencjału błonowego - ich fluorescencja jest bardzo wrażliwa na transbłonowy potencjał elektryczny. Do znakowania błon - znaczniki związane z fospolipidami -fluoresceina-PE, Texas red- PE, Pyrenyl -PC, Fluorenyl-PC, i wiele innych

Do znakowania DNA używa się np. bromku etydyny (interkaluje pomiędzy pary zasad - rozpycha je). Intensywność jego misji 30-krtonie wzrasta po związaniu DNA. Można też zastępować naturalne zasady ich fluoryzującymi analogami: 2-aminopuryna (zamiast adeniny), izoksantopteryna 9zamiast guaniny). Stosuje się też YOYO-1 i tOTO-1 które wiążą się trwale.

Chemiczne wskaźniki fluorescencyjne - fluorofory, których właściwości zmieniają się pod wpływem substancji nie mających użytecznych właściwości spektroskopowych. Pozwala to wykrywać i/albo oznaczać ilościowo te substancje.

Związki fluorogenne - klasa barwników, która sama nie fluoryzuje (lub fluoryzuje słabo), ale ulega przekształceniu w silne fluorofory na drodze określonych reakcji chemicznych. M.in. związki reagujące z grupami aminowymi (np. w peptydach, białkach) z utworzeniem fluoryzującego adduktu.

Strukturalne analogi biomolekuł - użyteczne związki fluoryzujące, muszą mieć ugrupowanie fluoroforowe wbudowane w cząsteczkę tak, aby zaburzenie oddziaływania z drugą nie znakowaną cząsteczką (np. białkiem) było minimalne.

Fluoryzujące białka jako znaczniki fluorescencyjne - np. dopinanie do innych białek GFP - modyfikacja genetyczna. Białka fuzyjne - białka błonowe przyczepiane do C-końca

Znakowanie kowalencyjne - np. 1,5-I-AEDANS znakuje grupy sulfhydrylowe (spisuję z konkretnej pracy):

• białko w odpowiednim roztworze miesza się ze znacznikiem w stosunku 1:5

• długa inkubacja próbki (najpierw 2 godziny w temp pokojowej a potem noc w 4 stopniach Celsjusza).

• Oddzielenie białka od znacznika - sączenie na kolumnie (używali Sephadex G-25 - czyli chyba białko od razu wyleci, a znacznik będzie zwlekał). Frakcję z białkiem identyfikowano wstępnie w świetle UV - wykorzystując właściwości fluorescencyjne znacznika

• W celu całkowitego usunięcia niezwiązanego znacznika - dializa - błony o granicy przepuszczalności do 12 kDa

• Stopień wyznakowania białka i stężenie spektrofotometrycznie przy długościach fali 278 i 340 nm.

Widma absorpcyjne znacznika i białka pokrywały się w znacznym stopniu, ale abs. 1,5-I-AEDANS-u przy 278nm stanowi 25%jego abs. Przy 340 nm. Stąd abs. Samego białka w 278 nm liczono:

A₂₇₈=A₂₇₈^w - 0,25 A₃₄₀

A₂₇₈^w - absorbancja wyznakowanego białka w 278 nm. A₃₄₀ - abs. Znacznika 2 340 nm

Stężenie znacznika wyznaczono korzystając z jego molowego współczynnika absorpcji dla 340 nm.

Stopień wyznakowania białka wyliczono:

gdzie ε₂₇₈ to molowy współczynnik abs. Białka w 278 nm.

Analiza stopnia wyznakowania reszt cysteinowych - metoda opisana przez Gardnera i Matthewsa - trawienie znakowanego białka na krótkie peptydy (trypsyną i alfa-chymotrypsyną) a potem rozdział HPLC z detekcją fluorescecnycjną i absorpcyjną.

Pomiar czasó życia fluorescencji - 2 metody:

Metoda fazowa:

Światło ciągłe (np. laserowe) modulujemy sinusoidalnie (częstość modulacji rzędu MHz) i oświetlamy próbkę. Dochodzi do przesunięcia modulacji przy przejściu przez próbkę - jest zatrzymane na czas życia fluorescencji. Czas otrzymujemy mierząc kąt φ (czymkolwiek jest) i głębokość modulacji można wyznaczyć ten czas.

Aby otrzymać wartości wszystkich parametrów funkcji opisującej zanik to jest α_i i τ_i należy wykonać pomiary dla wielu częstości modulacji.

Teraz zabawa matematyczna:

Próbkę wzbudzano światłem harmonicznie zmodulowanym funkcja ta (F(t)) miała postać (głupie oznaczenie może się mylić)

F(t)=A+Bcos(ωt)

ω- częstość kontowa modulacji. A i B - składowa stała i zmienna natężenia światła wzbudzającego. Stopień modulacji M= B/A

Natężenie sygnału wyjściowego ma postać:

F(t)_s/ref=(DC)_s/ref+(AC)_s/refcos(ωt-f_s/ref­)

(DC)_s/ref i (AC)_s/ref sa odpowiednio składową stałą I zmienną natężenia fluorescencji próbki (indeks s) lub referencji (indeks ref).

Mierzy się przesunięcie fazowe:

DF = (f₀-f_s)-(f₀-f_ref)

f₀ = faza wiązki wzbudzającej - padającej na próbkę I referencję

f_s­ - faza światłą fluorescencji próbki

f_ref - faza światłą fluorescencji roztworu referencyjnego

i mierzy się głębokość modulacji:

dalej robi się analizę komputerową dopasowując krzywą wieloeksponencjalną

f(t) - dopasowana krzywa zaniku fluorescencji próbki

α_i - cząstkowa amplituda związana z czasem życia τ_i komponenty „i”

Wiadomo potem dopasowanie i chi². Na koniec oblicza się czasy życia i relatywny udział f_i każdego z fluoroforów (wzory na początku opracowania gdzieś są).

Takie luźne wzory do zastosowania chyba i w tej metodzie i w następnej.. u niego niesprecyzowane gdzie się je stosuje

Podaje też wzory na Chi² i błąd ważony:

Rzucam dwa hasła - dekonwolucja (wszyscy wiemy) oraz residua - funkcja resydualna w analizie danych, powinna być równomiernie rozłożona.

Mierząc czasy życia w różnych temperaturach lub przy różnych długościach fali możemy dopasowywać funkcje w przestrzeni, a nie tylko na płaszczyźnie.

Metoda pojedynczego zliczania fotonów (chyba to się nazywa rozdzielcza w czasie)

Impulsowe źródło światła np. lampa azotowa (wyładowcza). Można też stosować droższe impulsy światła laserowego - rzędu fs. Laser może być przestrajany - od widzialnego do UV - praktycznie każda długość fali. Tańsze lasery diodowe - rząd ps - wystarczają do pomiarów białka w układach biologicznych.

• konwerter czas-amplituda (działa jak super szybki stoper) mierzy napięcie proporcjonalne do czasu.

To jest chyba time-resolved fluorescence czyli single photon counting ... jakoś tak

Pamiętacie to robiliśmy z tym kolesiem. Liczy się pierwszy foton który wzbudzi napięcie na fotopowielaczu. Wykreśla się krzywą i komputerowo analizuje uwzględniając współczynnik chi².

Metoda pojedynczego zliczania fotonów jest lepsza, dokładniejsza, ale droższa.

W pracy doktorskiej znalazłem jeszcze jedną metodę wyznaczanie czasu życia - ale nie wiem czy to nie przykład którejś z powyższych - mianowicie pomiary anizotropii.

F(t)=G F_VV(t)+2F_VH(t)

Otrzymano wartości F(t), które dopasowano do całki splotu:

czyli inaczej

h(t) - funkcja odpowiedzi aparatury (profil lampy)

f(t) założona funkcja zaniku fluorescencji wyrażona równaniem wieloeksponencjalnym (wzorek już był wielokrotnie ten z alfa i exp)

Potem dekonwolucja i cacy porównanie różnych parametrów i bla bla

Aparatura

Tu nie ma co dużo pisać - polecam skrypt do anala. Ja tylko dam wskazówki co i jak:

Źródło światłą - wiadomo lampa, albo laser to mówiliśmy.

Monochromator - może być siatka lub pryzmat. stosuje się dwusiatkowe czasami. Szczelina wejściowa i wyjściowa.

Za monochromatorem może też znajdować się polaryzator. Może być też płytka światłodzieląca, która część światła (np. około 4%) emituje na próbkę referencyjną. - tak mieliśmy z tym dziwnym kolesiem od czasów życia. Referencją może być np. rodamina - o znanej wydajności - obecność referencji pociąga za sobą obecność drugiego fotopowielacza.

Dalej komora pomiarowa (polecam zwrócić uwagę na geometrię oświetlania - efekt filtru wewnętrznego - anal).

Za próbka może być polaryzator (oczywiście oba polaryzatory stosuje się w pomiarach anizotropii). Może być też filtr odcinający przepuszczający tylko światło powyżej jakiejś długości - uniknięcie rozproszenia światła padającego na próbce może być też monochromator, ale to droga sprawa oczywiście.

Dalej detektor i układ analizujący. Zazwyczaj fotopowielacz podpięty do kompa.

Całość można termostatować. Zwrócić warto uwagę na geometrię układu - fluorescencję mierzy się pod kątem prostym względem wzbudzenia.

Jak to wszystko działa to wiecie nie będę się rozpisywał.

Różne rzeczy z wykładu których gdzie indziej nie wcisnę

Okno czasowe fluorescencji - kilka ns.

Białko zmienia konformacje. Czas życia konformacji dłuższy niż fluorescencji - dlatego widzimy odrębne indywidua..

Jeśli mamy szereg dyskretnych czasów życia fluorescencji faktycznie mamy szereg dyskretnych stanów konformacyjnych.

Dystrybucja czasów życia fluorescencji - różne stany konformacyjne białek, duża dynamika, szereg zmian - w orientacji III rzędowej struktury. Fluktuacje struktur. Im więcej stanów tym szersza dystrybucja.

Wydajność kwantowa zwykle nie jest równa 1 rozproszenie na ciepło. Ale to też można mierzyć. On pisał to pod anizotropią, ale nie widzę związku.

Metoda fotoakustyczna.

Impuls laserowy cząsteczka drga wykonuje ruchy oscylacyjne - ciepło przez roztwór propaguje się fala akustyczna powstająca w wyniku drgań cząsteczkowych super czuły mikrofon (detektor) - kryształ piezoelektryczny - gdy się go ściśnie powstają napięcia w sieci krystalicznej.

W mioglobinie - światło powoduje fotodysocjację tlenu od hemu - można śledzić przemieszczanie się tlenu w kieszeni hemowej. Uwolnienie tlenu powoduje zmiany objętości. Można mierzyć zmiany konformacji białka i zmiany drgań. Na skutej szybkiej zmiany uporządkowania cząsteczek wody następuje zmiana objętości - powstaje fala akustyczna. Jeśli się to dzieje w wodzie to będzie taka temperatura, ze nie zaobserwujemy tego efektu. Woda ma współczynnik przenikalności w 4˚C równy 0.

Analizując falę akustyczna możemy wyznaczyć czas życia fluorescencji. Pomiary fotoakustyczne są rozdzielcze w czasie.

Z pracy doktorskiej zjawisko „red-edge”. Jak mówimy o gaszeniu to udział f_i może zależeć od długości fali wzbudzającej. Jeśli zmiana udziału frakcji zachodzi pod wpływem zwiększenia długości fali wzbudzenia to mówimy o zjawisku „red-edge” czyli efekcie wzbudzenia po czerwonej stronie widma absorpcji fluorescencji. wtedy obserwuje się też przesunięcie maksimum emisji w kierunku fal dłuższych wraz ze wzrostem długości fal wzbudzenia powyżej 295 nm. Interpretuje się to wzbudzaniem przy czerwonej krawędzi tych reszt tryptofanowych, które uprzednio w stanie podstawowym weszły w oddziaływania z polarnymi grupami lub molekułami (np. woda) znajdującymi się w bezpośrednim otoczeniu Trp.

Jest jeszcze na folii Edge effect - ale to chyba co innego - ale jest tylko wykres i brak wyjaśnienia.

Emisja ekscimerów. W foliach taki głupi przykład. Ze jak robisz hybrydyzację to robisz 2 próbki oligonukleotydowe wyznakowane pyrenem (pirenem??). I jak one obie się przyłączą do badanego fragmentu DNA to wtedy te dwa znaczniki są obok siebie i dopiero wtedy następuje emisja. Z ekscimeru.

Zastosowanie i ćwiczenia

• Dostarcza informacji o zmianach strukturalnych - np. wygaszanie - może nastąpić ekspozycja fluoroforu na zewnątrz - stanie się dostępny dla jonów jodku, Można dzięki temu wykryć dwa różne tryptofoany np. itp. Dodatkowo można się bawić w zmianę fluorescencji tryptofanu po ekspozycji na zewnątrz do srodka itp.

• Sekwencjonowanie DNA - metoda dideoksynukleotydów Sangera - w jednym wariancie startery znakuje się fluorescencyjnie - do kazdje miesznainy inny znacznik - szczegóły w Stryerze coś chyb 124 strona

• Sondy fluorescencyjne można wprowadzać - wiec wszelkie badania białek, ligandów, błon itd. - to było wspominane - można badać bardzo wiele.

• Pomiary ilości białka, ale także stężeń innych substancji - patrzcie FIA na analu

• Badania błon biologicznych (dzięki sondom oczywiście)- wyznaczanie mikrolepkości błony, a z jej związku z temperaturą - można wyznaczyć temperaturę przejścia fazowego w błonie (metoda anizotropii), Innymi metodami: fluorescencja dyfuzja rotacyjna i translacyjna, zderzenia z wygaszaczami, tworzenie kompleksów z rozpuszczalnikami i ligandami, reorientacja środowiska otaczającego fluorofor

• Wykorzystuje się do badń tworzenia kompleksów białko-biłako, białko-DNA, białko-ligand - to najlepsza metoda - robiliśmy na ćwiczeniach i nie wyszło

• Wykorzystuje się anizotropię do badania związania immunoglobuliny z błona

• Mikroskopia fluorescencyjna i konfokalna. Metoda FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) - chodzi o to, ze jak się bardzo silnie naświetli barwnik w paśmie absorpcji to potem on nie świeci. Robi się tak punktowo w preparacie, a potem obserwuje powrót fluorescencji - ruch fluoroforu z miejsc przyległych: http://www.bio.davidson.edu/courses/Molbio/FRAPx/FRAP.html

• Wykorzystanie do identyfikacji pasków w elektroforezie - np. DNA czy RNA

Ćwiczenia:

Pomiar wewnętrznych czasów życia fluorescencji białek:

• całość prosta wkładamy próbkę, mamy też referencję. Zliczamy pierwszy foton wzbudzający napięcie. Mamy krzywą. Komputerowo dopasowujemy różne modele - tak by zyskać jak najlepszą wartość Chi² mamy też funkcję rezydualną do pomocy. Staramy się by dopasowano jak najmniej eksponent. Pamiętamy, ze najpierw była dekonwolucja danych. Otrzymujemy czasy życia i udział poszczególnych frakcji fluoroforu/fluoroforów

wygaszanie fluorescencji

• dodawaliśmy wygaszacz do fluoroforu. Stężenia liczymy bardzo dokładnie z uwzględnieniem zmiany objętości. Sporządzono wykresy Sterna Volmera dla różnych długości fali - wyznaczono z nich K_SV i potem uśredniono wynik.

Anizotropia fluorescencji

• r-ry o różnej lepkości. Wyznaczono dla każdego anizotropię. Potem wykres 1/r od 1/lepkość

• współczynnik b dopasowanej prostej to 1/r₀ - wyliczamy wartość anizotropii granicznej

• policzono wartość czasu korelacji z wzoru Perrina i z wartość teoretyczna. Porównano wyniki. Z rosnącą lepkością r-ru wzrasta wartość r zbliżając się do r₀ - czyli zgodnie z teorią. Był pewien błąd bo arz r wyszło większe od r_0­ i czas korelacji wyszedł ujemny - ale to błąd wykonania jak sadze. Niestety wartości teoretyczne i doświadczalne się znacząco różniły.

Anizotropia fluorescencji do wyznaczenia przejść fazowych w błonach

• pomiary anizotropii we wzrastającej temperaturze od kilku stopni do 40 kilku

• wykreślamy wykresy zależności: r=f(T),
  =f(T) i
  =f
  . Do nich dopasowuje się sigmoidy. Punkt przegięcia sigmoidy wyznacza nam temperaturę przejścia. Możemy też zróżniczkować otrzymane krzywe - i do tego dopasować Gaussa - ekstremum Gaussa - temperatura przejścia. Najlepiej wyszło to dla wykresu pierwszego (w pozostałych dwóch po różniczkowaniu strasznie niskie wychodziły R²).

Oddziaływanie białko ligand:

Ktoś to robi wiec tylko dodam uwagi z ćwiczenia:

- znakowano cysteinę pochodną dansylową

• wykonujemy widma, buforu, buforu +białko. Ponieważ robiliśmy na CRP wiec potem bufor+białko +cAMPpotem dopiero właściwy ligand - czyli DNA.

• Odejmujemy widmo buforu od reszty.

• Porównaliśmy zmianę Fluorescencji po dodaniu cAMP - przesunięcie w kierunku fal krótszych (wzmocniła się też lekko emisja)

• Po dodawaniu kolejnych porcji DNA zmieniała się intensywność - zatem nie zachodziły zmiany konfirmacyjne wpływające na ekspozycję tego znacznika dansylowego. Nam nie wyszło, ale potem się robiło tak:

• Z pól pod kolejnymi wykresami fluorescencji (po dodawaniu kolejnych porcji DNA) wykreślało się wykres w zależności od stężenia DNA. To powinna być prosta i dalej powinno się zrobić z tego Scatcharda - ale o tym jak się go robi ktoś pisze... ja niezbyt wiem.

---