ENZYMY JAKO DODATEK PASZOWY
Współczesne środki żywienia zwierząt powinny pozwalać na wyprodukowanie środków spożywczych pochodzenia zwierzęcego o wysokich walorach jakości zdrowotnej (Bonneau i Laarveld, 1999; Eissen i wsp., 2000; Gajęcki, 2000; Villas-Bôas i wsp., 2002). Równocześnie, powinny one być przyjazne zwierzęciu (Ellsmere i wsp., 1999) i środowisku naturalnemu (Kołacz, 2000; Weary i wsp., 1999; Worobec i wsp., 1999; Opaliński, 2003). Potrzeby te wymuszają rozszerzenie badań o nowe obszary tematyczne. Istotnym wyzwaniem ostatnich lat, jest potrzeba zamiany tradycyjnych nośników azotu i fosforu (mączki mięsno-kostne) (Gajęcki, 2001a, 2001b i 2004) na nowe, do niedawna niedoceniane zasoby. Zbyt beztroskie stosowanie materiałów i „dodatków paszowych” doprowadziło do wielu niebezpiecznych zmian w środowisku (antybiotyki, dioksyny, nitrofeny) (Heeschen, 2002; Malinowska, 2001b; Martin i wsp., 1999; Yamamoto i wsp., 2000; Opaliński, 2003), a co gorsza, w następstwie ich stosowania powstały zagrożenia zdrowotne dla człowieka (hormony sterydowe, BSE - vCJD) (Hill i wsp., 2000; Polak i Żmudziński, 2000 i 2001; Schaefer i wsp., 2000; Wrathall, 2000; Żmudziński i wsp., 2002).
W pogoni za poprawą efektów produkcyjnych (Fandrejewski, 2002) nie zwracano uwagi na warunki bytowe zwierząt (dobrostan) (Ellsmere i wsp., 1999; Kołacz, 2000), w związku z czym, w wyniku wieloletniej pracy genetycznej, obecne zwierzęta gospodarcze, a szczególnie świnie, są bardzo wydelikacone (Eissen i wsp., 2000) i wrażliwe na jakość zdrowotną środków żywienia zwierząt (Gajęcki, 2000), warunki środowiska (Kołacz, 1995; Tang, 1997) i sposoby reprodukcji (Bonneau i Laarveld, 1999; Harlow i Hillier, 2002). Stosowanie pasz sporządzonych według nowoczesnych zaleceń (dużo bardziej wyszukanych), ale w niewłaściwych proporcjach i bez przestrzeganiu jakości zdrowotnej przy doborze materiałów i dodatków paszowych (Eissen i wsp., 2000), może bardzo łatwo doprowadzić do: (i) nieoczekiwanych stanów patologicznych u zwierząt (Gajęcki, 2000); (ii) niepożądanej emisji niewykorzystywanych składników (Kołacz, 1995 i 2000; Szprengier-Juszkiewicz, 2002; Opaliński, 2003); (iii) marnotrawstwa cennych środków żywienia zwierząt. Przedstawiona sytuacja, jest bardzo groźna dla człowieka, jako ostatniego ogniwa w łańcuchu żywnościowym i organizmu, który dużo dłużej przebywa w tym środowisku (Kołacz, 1995; Opaliński, 203).
Należałoby sobie zdać również sprawę, że stosowanie substytutów naturalnych składników środków żywienia zwierząt może powodować groźne nie znane nam następstwa (Eissen i wsp., 2000; Thompson, 1993). Obecnie szacuje się, że około 75-80% roślin genetycznie zmodyfikowanych jest wykorzystywana w przemyśle paszowym (Zduńczyk, 2004). Techniki inżynierii genetycznej pozwalają na modyfikację składu chemicznego roślin, czego konsekwencją jest zmiana cech jakościowych i wartości odżywczej (Herbers i Sonnewald, 1999). Genetyczna zmiana profilu aminokwasowego ziarniaków zbóż i innych nasion (Buraczewski, 2001) stwarza możliwość bilansowania dawek pokarmowych bez stosowania dodatków aminokwasów syntetycznych i wyeliminowania z diety mączek pochodzenia zwierzęcego. Zakłada się, że zastosowanie w żywieniu zwierząt roślin zmodyfikowanych stworzy możliwość zwiększenia walorów dietetycznych (Zduńczyk, 2004). Obecność w roślinach związków modyfikujących procesy trawienne lub metabolizm zwierząt może spowodować zmniejszenie ilości leków stosowanych zarówno profilaktycznie jak i terapeutycznie (Malinowska, 2001a). Należy jednak pamiętać, że ingerencja w materiał genetyczny polega na wprowadzeniu nowej, ściśle określonej cechy, co może się wiązać z pewnym ryzykiem wprowadzenia innych nie planowanych cech (Bonneau i Laarveld, 1999). Możliwe jest również zwiększenie ekspresji genu letalnego (uśpionego) lub grupy nieaktywnych genów roślinnych, będące niezamierzonym skutkiem wprowadzenia nowej cechy do DNA modyfikowanej rośliny lub usunięcia fragmentu DNA kodującego pożądaną cechę. Niebezpieczne dla organizmu modyfikacje makrocząsteczek wchodzących w skład roślin genetycznie zmienionych mogą być także wywołane wpływem określonych czynników fizycznych podczas procesów biotechnologicznych roślin przeznaczonych do spożycia lub skarmienia zwierząt (Kosieradzka, 2001). Przedstawione sugestie rodzą obawy (Kossobudzki, 2004), że zmiana struktury genetycznej roślin może w sposób trudny do przewidzenia, wpłynąć negatywnie na organizm zwierząt, a przez to na organizm konsumenta. Tworzenie genetycznie zupełnie nowych białek lub wprowadzanie zmian w strukturze chemicznej poszczególnych składników pokarmowych może stwarzać zagrożenia wynikające z właściwości pozyskiwanych produktów (nie znana aktywność lub np. działanie alergenne - Barej, 1996 - lub immunomodulujące). Można sądzić, że zmiana genetycznych właściwości roślin może zmieniać funkcje poszczególnych tkanek lub całego organizmu zwierzęcego, a w dalszej kolejności i człowieka, który jest ostatnim ogniwem w łańcuchu żywnościowym (Bonneau i Laarveld, 1999).
Kolejnym substytutem są aminokwasy syntetyczne. Wykorzystując je próbujemy skomponować pasze z tak zwanym „białkiem doskonałym” (Jamroz, 2000). Stosując wspomniane aminokwasy, nie potrafimy jednak w sposób satysfakcjonujący skomponować paszy która pozwoliłaby uzyskać podobne efekty ekonomiczne w produkcji zwierzęcej jak podczas stosowania mączek utylizacyjnych (Gajęcki, 2001b) Nasuwa się sugestia, że to nie tylko aminokwasy (Korol, 2001) decydują o przyroście tkanki mięśniowej u tuczników, ale dodatkowo jeden, a może więcej składników produktów utylizacyjnych, których jeszcze nie znamy, a dopiero ich synergistyczne działanie daje określone efekty.
Wiadomo, że obecność egzogennych sterydów w środkach żywienia zwierząt powoduje dysfunkcję układu rozrodczego u loszek i macior. Stan ten określa się jako hiperestogenizm (Gajęcki, 2002b), czyli niekorzystna kompensacja związków estrogennych w jednym czasie w organizmie lochy (El Khisiin i Leclercq, 1999). Do niedawna jeden z egzogennych estrogenów (zearalenon) stosowano jako naturalny stymulator wzrostu, właśnie u świń (Gajęcki, 2002a; Gajęcki i wsp., 2002; Zwierzchowski 2002).
Te przyczyny oraz wiele innych spowodowały, że coraz aktywniej poszukuje się i wprowadza różnego rodzaju kompleksy enzymatyczne, które mają spełniać rolę stymulatorów wzrostu u zwierząt gospodarskich (Pierzynowski i wsp., 1992; Rossi i Théwis, 2001). Preparaty tego typu są bezpieczne, ponieważ ich działanie ogranicza się jedynie do przewodu pokarmowego i w końcowej jego części ulegają one dezaktywacji (Chesson, 1993). Jednym z takich preparatów jest, zastosowany i oceniony w warunkach terenowych kompleks enzymatyczny, który oprócz działania stymulującego na organizm świń, prawdopodobnie w sposób pośredni wpływa również stymulująco na egzokrynną aktywność trzustki. Hipotetycznie zakłada się, że związek ten może działać dwutorowo. Z jednej strony działa przez pobudzenie VIP (Vasoactive Intestinal Peptide), następnie nerw błędny, ośrodkowy układ nerwowy i układ hormonalny na układ pokarmowy i rozrodczy (Adler i Beglinger, 1990; Holst i wsp., 1993). Z drugiej strony przypuszcza się, że badany kompleks może działać na zasadzie odwrotnie proporcjonalnej współzależności z CCK (cholecystokininy), w wyniku czego zmniejsza się stężenie tego hormonu i wzrasta możliwość przyswajania przez organizm substancji odżywczych (Kania, 1994a i b; Pierzynowski i wsp., 1993a; Rychlik, 2002c). Współzależność między funkcjonowaniem przewodu pokarmowego a rozrodem została dostrzeżona już przez Uvnäs-Moberga (1989), który przedstawił przewód pokarmowy jako wielki gruczoł endokrynny. Hormony tego gruczołu mają regulować procesy przemiany materii (Rasmussen i wsp., 1993) szczególnie u samic w okresie ciąży, u płodów i noworodków oraz w niewielkim stopniu i u samców (Valette i wsp., 1992; Rychlik, 2002a). Zaangażowany jest w to również układ autonomiczny. Oba te układy w końcowym efekcie działają silnie bodźcowo na trzustkę, a przez to na jej produkcję substancji endo- i egzokrynnych. Wiadomo również, że u samic (np. macior) i u młodych organizmów (np. prosiąt) występują okresowe spadki aktywności trzustki (Pierzynowski i wsp., 1993a i 1993c). Mają one miejsce w czasie ciąży, w okresie dużych obciążeń fizycznych organizmu, np. podczas porodu, laktacji lub w okresie działania czynników stresotwórczych, takich jak np. odsadzanie prosiąt od maciory lub odwrotnie, odsadzanie macior od prosiąt oraz podczas walk o supremację w kojcu (Gronek i wsp., 1998; Rychlik, 2002b).
Podawanie substancji egzogennych może powodować jednak „rozleniwienie” organizmu zwierzęcego i zaprzestanie lub obniżenie produkcji danej substancji lub związku biologicznie czynnego, ważnego dla organizmu (Foxcroft i wsp., 1996). Przykładem tego może być fakt nagminnego profilaktycznego stosowania hormonu oksytocyny w okresie okołoporodowym u macior w fermach przemysłowych. Doprowadza to do sytuacji, że maciory „nie potrafią” naturalnie odbyć porodu, tylko „czekają” na domięśniowe podanie tego hormonu (Alexopoulos, 2001). Być może etiologia takiego stanu jest inna (Rekiel, 2000), gdyż uwolnienie oksytocyny następuje po wyparciu prosięcia, a nie przed czy w trakcie aktu parcia. Odruch uwolnienia tego hormonu, jest bowiem wywoływany zwolnieniem bodźca naprężenia, a nie działaniem tego bodźca na szyjkę lub pochwę. Czyli przeciwdziałanie rozciąganiu kanału rodnego jest tym, co stymuluje uwolnienie oksytocyny. Czynnikiem inicjującym poród jest więc odejście wód płodowych czyli po zmniejszeniu naprężenia ścian macicy. Nasuwa się pytanie, per analogiam, czy podawanie egzogennych kompleksów enzymatycznych per os nie powoduje niekorzystnych zmian w trzustce lub innych narządach organizmu (Bedford, 2000) lub nie uruchamia mechanizmu adaptacji (Kowalski, 2002) w trzustce lub mechanizmów działających na trzustkę w wyniku długotrwałego i stałego nadmiaru egzogennych enzymów w przewodzie pokarmowym.
Rys historyczny
Louis Pasteur (1822 - 1895) był genialnym francuskim biologiem i chemikiem. Oprócz podwalin współczesnej bakteriologii, techniki dezynfekcyjnej i wieku ważnych szczepionek, zawdzięczamy mu również wiedzę o fermentacji. Jako pierwszy stwierdził, że za każdy rodzaj fermentacji jest odpowiedzialny odrębny, specyficzny grzyb fermentacyjny (często są to drożdże). Proces fermentacji można wstrzymać przez zagotowanie, czyli zabicie żywych drożdży. To naprowadziło Pasteura na myśl, że fermentację należy traktować jako jeden z przejawów życia. Nim jednak Pasteur sformułował swe epokowe przemyślenia, niemiecki anatom Theodor Schwann (1810 - 1882) zidentyfikował w soku trawiennym pierwszy ludzki enzym - pepsynę - rozkładający białko. Potem potoczyło się wszystko w miarę szybko: w 1837 r. w gorzkich migdałach stwierdzono występowanie enzymowej mieszanki - emulsyny, w 1839 r. w nasionach gorczycy odkryto myrozynę, a w 1848 r. z soku wydzielanego przez trzustkę udało się wyizolować trypsynę, w rok zaś później - lipazy. Odkrycia te były zarazem podwaliną i warunkiem prowadzenia dalszych badań nad enzymami. Przełom nastąpił w 1896 roku, dzięki niemieckiemu chemikowi Eduardowi Buchnerowi (1860 - 1917), który za swe odkrycie otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii za rok 1907. W trakcie eksperymentu, z drożdży roztartych piaskiem odfiltrował on ekstrakt bezkomórkowy, a więc - zgodnie z kanonami ustanowionymi przez Pasteura -martwą materię. W celu konserwacji chemik dodał do ekstraktu cukier i szybko stwierdził, że doszło do fermentacji. Pasteur pomylił się zatem, proces fermentacji nie wiąże się z życiem, lecz wywołuje go substancja niszczona w wyniku podgrzania. Niedługo potem stwierdzono, że nie jest to jeden związek, lecz cała grupa. Początkowo określano je mianem „fermentów”, od łacińskiego słowa fervere, oznaczającego „burzyć się, kipieć, fermentować”. Obowiązująca obecnie nazwa „enzym” wywodzi się z greki: en - wewnątrz i zymo - wywoływać fermentację.
Do drugiego przełomu w dziedzinie enzymów doszło w 1926 roku, gdy Sumnerowi udało się wyizolować i skrystalizować pierwszy enzym rozkładający mocznik - ureazę. Otworzyło to drogę do stosowania enzymów w medycynie.
Inhibitory enzymów
Obecnie znamy kilka tysięcy enzymów, około stu z nich potrafimy krystalizować, kilka umiemy wytwarzać syntetycznie i w pewnym stopniu znamy ich budowę i oddziaływanie (Rossi i Théwis, 2001). Są związkami białkowymi, wytwarzanymi w komórkach organizmu z aminokwasów. Aminokwasy te są pozyskiwane przez rozkładanie białka przyswojonego ze środków żywienia zwierząt. Muszą one zostać związane w łańcuchy polipeptydowe w kolejności specyficznej dla każdego enzymu. Ów skomplikowany proces biochemiczny odbywa się według określonej informacji genetycznej (Brannon, 1990).
Równolegle, są prowadzone intensywne badania innych związków biologicznie czynnych, przede wszystkim inhibitorów enzymów, substancji o właściwościach hormonów (El Khissiin i Leclercq, 1999; Székács i wsp., 2000) i polifenolowych antyoksydantów. Inhibitory enzymów są białkami, peptydami, glikoproteinami lub należą do związków polifenolowych (Leontowicz i Kulasek, 1998). Najbardziej poznane są białkowe i peptydowe inhibitory proteaz (Bode i Huber, 2000; Holst i wsp., 1993), chociaż coraz więcej badań dotyczy inhibitorów amylaz, lipaz oraz inhibitorów polifenolowych. Inhibitory enzymów trawiennych gromadzą się głównie w tkankach roślinnych i oprócz funkcji regulacyjnych, spełniają rolę ochronną przed bakteriami, grzybami, owadami i wyższymi zwierzętami roślinożernymi (Herbers i Sonnewald, 1999; Lipiec i Pisarski, 1994; Wolski i Gliński, 1998). Pokarmowe inhibitory enzymów kontrolują metabolizm przez ograniczenie dostępności składników odżywczych z pobranego pokarmu, ale jednocześnie nasilają straty składników endogennych (Marsman i wsp., 1995; Yamazaki i wsp., 2002). Stosowanie inhibitorów enzymów w diecie dla ludzi lub zwierząt może być pomocne w dietoprofilaktyce a nawet w dietoterapii niektórych schorzeń, np. cukrzycy, otyłości lub chorób nowotworowych (Thompson, 1993). Wśród inhibitorów proteaz najbardziej znane to: sojowy inhibitor trypsyny Kunitza (TI) (Sorgentini i Wagner, 2002), inhibitor proteaz Bowmana-Birk (BBI), ziemniaczane inhibitory proteaz, inhibitory roślin dyniowatych i inhibitory proteaz roślin zbożowych (Thompson, 1993). Te ostatnie stwierdzono w jęczmieniu, życie, pszenicy, pszenżycie, kukurydzy, ryżu i owsie. Roślinne inhibitory proteaz hamują proteazy zawierające serynę, np.: trypsynę, chymotrypsynę i inne. Na przykład jedna molekuła inhibitora trypsyny Kunitza łączy się w jelicie cienkim z jedną molekułą trypsyny w podobny sposób jak powstaje kompleks substrat-enzym. O ile kompleks ten w dalszej części przewodu pokarmowego łatwo dysocjuje, o tyle kompleks TI-trypsyna jest połączeniem trwałym i w postaci nie strawionej dostaje się z treścią pokarmową do jelita grubego. Ponadto u ssaków (Sorgentini i Wagner, 2002) i ptaków stwierdzono obecność trzustkowego inhibitora sekrecji trypsyny który został stwierdzony. Fizjologiczna rola tego inhibitora polega na zapobieganiu w trzustce aktywacji zymogenów przez trypsynę.
Mechanizm działania inhibitorów proteaz polega głównie na hamowaniu wzrostu zwierząt, rozroście trzustki i innych procesach, których do końca nie można przypisać tylko inhibitorom proteaz, ponieważ w środkach żywienia zwierząt bardzo często są obecne inne inhibitory enzymów, np. inhibitory α-amylaz, lektyny, taniny itp. Efekt hamujący wzrost masy ciała, wywoływany inhibitorami proteaz, u świń jest powiązany ze wzrostem sekrecji enzymów trzustkowych. Młode zwierzęta są bardziej wrażliwe na niedobór enzymów trzustkowych niż osobniki starsze, ponieważ ich zewnątrzwydzielnicza funkcja trzustki nie jest w pełni wykształcona (Yin i wsp. 2001). Duże ilości inhibitorów trypsyny i chymotrypsyny w pokarmie nasilają wydzielanie soku trzustkowego, powoduje również hipertrofię i hiperplazję trzustki a w skrajnych przypadkach nawet zmiany nowotworowe (Leontowicz i Kulasek, 1998).
W chwili obecnej istnieją przypuszczenia, że mechanizm działania inhibitora trypsyny na zewnątrzwydzielniczą funkcję trzustki polega na tym, że pokarmowy inhibitor trypsyny łączy się trwale z trypsyną, co doprowadza do jej niedoboru w jelicie cienkim. Stan niedoboru powoduje zwiększenie wydzielania soku przez trzustkę, kontrolowane głównie przez sekretynę i cholecystokininę (Kania, 1994a i b). Ilość tej ostatniej jest stymulowana przez peptyd monitorujący, znajdujący się w soku trzustkowym. Jeśli dieta nie zawiera inhibitora trypsyny, peptyd monitorujący jest szybko inaktywowany w jelicie cienkim przez trypsynę. W przypadku związania trypsyny z inhibitorem trypsyny, peptyd monitorujący jest aktywny i nasila wydzielanie cholecystokininy, która pobudza trzustkę do wydzielania enzymów. W mechanizmie nasilenia sekrecji soku trzustkowego uczestniczy także układ cholinergiczny (Barej, 1996; Kania, 1994a i b).
Zmniejszenie aktywności pokarmowych inhibitorów enzymów trawiennych można uzyskać, stosując metody fizyczne, chemiczne, mikrobiologiczne lub genetyczne. Ekstruzja jest jedną z bardziej skutecznych i wydajnych metod inaktywacji inhibitorów (Bańkowska-Czauż, 1999; Latała i wsp., 2000).
Enzymy paszowe
Enzymy paszowe niczym się nie różnią od enzymów stosowanych w przemyśle spożywczym lub w medycynie (Häusler i wsp., 1998; Zaks i Dodds, 1997). Podawane są zazwyczaj jako mieszaniny kilku enzymów (Rossi i Théwis, 2001). Ze względu na specyficzne działanie preparaty enzymatyczne powinny być właściwie dobrane do zadawanej paszy (Kemme i wsp., 1999).
Produkcja enzymów w postaci proszku i płynnej, pozwala je stosować na sucho i na mokro. Istotną rolą przy wyborze sposobu ich podawania może odgrywać gatunek, wiek zwierzęcia i technologia produkcji żywca (Bedford, 1995). U świń dobre rezultaty daje mieszanie enzymów z wilgotną paszą (Eissen i wsp., 2000). System ten został ostatnio udoskonalony przez wykorzystanie techniki komputerowej przy dodawaniu wody i enzymów do paszy. Najlepsze wyniki w tym systemie otrzymuje się, gdy enzymy są dodawane kilka godzin przed karmieniem zwierząt, co jest jednak bardzo trudne do przeprowadzenia ze względu na problemy utrzymania stanu higienicznego paszy i sprzętu używanego podczas jej zadawania. Zdecydowana większość chlewni jest jednak przystosowana do suchego zadawania paszy świniom (Bonneau i Laarveld, 1999).
Premiksy i pasze zawierające enzymy nie powinny być długo przechowywane, ponieważ enzymy zmniejszają stopniowo swoją aktywność. Stabilizowane na odpowiednich nośnikach preparaty enzymatyczne można przechowywać w temperaturze pokojowej do 6, a nawet 9 miesięcy, jednak po zmieszaniu ich z premiksem witaminowo-mineralnym lub z paszą następuje stopniowe zmniejszanie się ich aktywności ze względu na działanie niektórych składników mineralnych.
Enzymy paszowe mają formę proszku lub mikrogranulek o kolorach od białego do żółtobrązowego. Mogą mieć specyficzny, lekko fermentacyjny zapach. Podczas wprowadzania ich do paszy lub premiksów należy unikać rozpylania i wdychania, gdyż mogą spowodować rekcje uczuleniowe (Tang, 1997). Z białkowego charakteru enzymów wynika, że podawanie ich w paszy jest zupełnie bezpieczne dla zwierząt. Podobnie jak enzymy endogenne, ulegają one rozłożeniu w jelicie cienkim do aminokwasów, a następnie są wchłaniane przez nabłonek jelit (Korol, 2001). Nie pozostają zatem żadne szkodliwe produkty rozpadu, w związku z czym enzymy mogą być stosowane aż do dnia uboju bez zachowania okresu karencji (Bedford, 2000).
Wykorzystanie enzymów paszowych
Enzymy egzogenne mają wiele potencjalnych zastosowań w przemyśle paszowym (Rossi i Théwis, 2001) i obecnie są powszechnie stosowane na świecie jako dodatki w żywieniu zwierząt, zwłaszcza w paszach dla zwierząt nieprzeżuwających (Villas-Bôas i wsp, 2002).
Enzymy paszowe są stosowane w celu zwiększenia wykorzystania karmy przez zwiększenie wartości odżywczej środków żywienia zwierząt (ZoBell i wsp., 2000). Enzymy te są szczególnie nakierowane na: (i) eliminację czynników antyżywieniowych obecnych w wielu materiałach paszowych (Lipiec i Pisarski, 1994); (ii) wzrost dostępności węglowodanów, białka i składników mineralnych, które znajdują się w bogatej we włókno ścianie komórkowej lub są związane w formy chemiczne niedostępne dla zwierząt (Grela i wsp., 2002; Grela i Kumek, 2002); (iii) uzupełnienie własnych enzymów trawiennych, szczególnie u młodych zwierząt, u których występują one w zbyt skąpych ilościach (Yin i wsp., 2001); (iv) zmniejszenie odchyleń w wartości odżywczej pomiędzy poszczególnymi środkami żywienia zwierząt, co w konsekwencji może zmniejszyć wahania w produkcyjności zwierząt i zwiększyć jednorodność grup zwierząt, a więc łatwiejsze zarządzanie i zwiększenie korzyści (Rossi i Théwis, 2001): (v) ogólny stan zdrowia zwierząt, przez likwidowanie lub łagodzenie niespecyficznych objawów zaburzeń ze strony układu pokarmowego lub zaburzeń stanu ogólnego, które często są powodowane przez niepożądane lub niespecyficzne składniki włókna w paszy (Gajęcki, 2000); (vi) osiągnięcie korzyści dla środowiska przez lepsze wykorzystanie paszy przez zwierzęta, zmniejszenie ilość wydalin, zmniejszenie ilości nawozu oraz zmniejszenie poziomu skażenia azotem i fosforem (Jakobsen i Hedemann, 2002).
Mimo, że dowiedziono dużą skuteczność i zasadność stosowania enzymów, to skala ich wykorzystania jest wciąż niewystarczająca (Rooke i wsp., 1998). Trzeba rozwiązać wiele problemów, by móc wykorzystywać ich pełne możliwości lub by dojść do pełnych możliwości ich wykorzystania. Jednym z problemów, jest znaczenie enzymów w obecnym przemyśle paszowym, gdy źródła fosforu, jakimi są mączki mięsno-kostne są zakazane, a temperatury i ciśnienie przy produkcji pasz są coraz wyższe (Zarkadas i Wiseman, 2002).
Obecny zakaz stosowania mączek mięsno-kostnych w EU (Gajęcki, 2001b i 2004; Kołodziej, 2002; Żmudziński i wsp., 2002) gdzie jeszcze niedawno stosowano rocznie 3 mln ton, co ma wpływ na dostępność i ceny alternatywnych źródeł fosforu i białka. Ceny większości źródeł białka od końca 2001 roku wzrosły od 10 do 25%. Enzymy mogą być na pewno brane pod uwagę jako zamienniki innych składników. Jednak by zaczęto składać na nie większe zapotrzebowanie, jest potrzebne uzupełnienie paszowych kompleksów enzymatycznych, takich jak fitaza (Grela i wsp., 2002; Grela i Kumek, 2002) lub proteaza o enzymy zwiększające ilość źródeł białka roślinnego (Cowan i wsp., 1996). W związku z tym substrat dla enzymów musi być lepiej zdefiniowany, by umożliwić rozwój enzymów towarzyszących, które będą współdziałać w degradacji docelowych substratów wydajniej i szybciej. Pozwoli to na określenie najbardziej optymalnej dawki enzymów (Yin i wsp., 2001).
Równocześnie, unowocześnianie poszczególnych etapów obróbki termicznej podczas produkcji pasz i potrzeba pełnego nadzoru łańcucha żywnościowego spowodują, że będą musiały być oferowane przemysłowi inne ulepszone rozwiązania, systemy płynnego zadawania enzymów do pasz po obróbce termicznej. Ponadto, ceny sprzętu i obowiązkowe odstępy czasu narzucą wynalezienie nowych produktów enzymatycznych, które będą tolerować temperaturę i będą miały lepszy w standard jakości zdrowotnej (Morgavi i wsp., 2000). Ostatecznie, ocena korzyści powinna być zgodna z końcowymi produktami aktywności enzymu (ZoBell i wsp., 2000). Uważa się, że większość reakcji bardziej zależy od zmian w mikroflorze jelitowej, niż od bezpośredniego wpływu enzymu per se na strawność karmy. Co więcej, odnośnie decyzji władz Unii Europejskiej o zakazie stosowania większości antybiotykowych promotorów wzrostu i konkurencji pomiędzy wszelkimi możliwymi alternatywami, ten „nowy sposób” może być niezbędny i powinien prowadzić do wyboru produktów enzymatycznych, które mogłyby pomóc w utrzymaniu korzystnej mikroflory (Bedford, 2000).
Właściwości enzymów paszowych
Bez enzymów niemal nic w organizmach żywych by nie działało. Nie poruszałby się żaden mięsień, składniki pokarmowe nie byłyby rozkładane a na komórkowym poziomie nie byłoby możliwe pozyskiwanie energii inne wykorzystywanie przyswojonych substancji. Bez enzymów organizmy nie radziłyby sobie nawet z przyswajaniem tak podstawowych substancji, jak woda i tlen (Bedford, 1995).
Enzymy działają wyłącznie w określonych warunkach, przy czym decydującą rolę odgrywa temperatura. Zimno powoduje, że enzymy stają się nieczynne, a uaktywniają się ponownie po ogrzaniu do dostatecznej temperatury. Skuteczność enzymów rośnie poczynając od 0oC, osiągając optimum w temperaturze ciała. W temperaturze około 40oC następuje rozpad pierwszych enzymów, a powyżej 70oC jakiekolwiek działanie nie jest już możliwe.
Niektóre enzymy pozyskiwane z mikroorganizmów są szczególnie oporne na temperatury (tzw. termostabilność) i nie tracą tak szybko aktywności nawet w wyższych temperaturach. Używa się ich do produkcji „bioaktywnych” proszków do prania. Jednak by enzymy te zadziałały konieczne jest włączenie w pralce programu „bio”, co zapobiega nadmiernemu podgrzaniu roztworu.
Procesy hydrotermicznej obróbki (Medel i wsp., 2002), zwłaszcza ekspandowanie i ekstruzja pasz, oddziałują na składniki odżywcze (Latała i wsp., 2000). Wpływ ten może być dodatni, obojętny, a nawet niekorzystny, destrukcyjny. Istotne czynniki działające podczas omawianych procesów obróbki pasz, to: temperatura, wilgotność (para wodna), ciśnienie (tarcie) i mechaniczne oddziaływanie elementów aktywnych urządzeń. W przetwórstwie paszowym największe znaczenie mają następujące procesy: granulowanie (mieszanki paszowe), ekspandowanie (mieszanki paszowe), ekstruzja (nasion roślin oleistych, mieszanki paszowe specjalne). Ważna jest ocena wpływu powyższych procesów na mikroskładniki i dodatki stosowane do pasz przemysłowych, zwłaszcza witaminy, stymulatory wzrostu, probiotyki i preparaty enzymatyczne (Zarkadas i Wiseman, 2002) oraz na jakość zdrowotną pasz (Latała i wsp., 2000). Warunki obróbki hydrotermicznej w różnym stopniu oddziałują na dodatki paszowe, najmniej stabilne są enzymy i probiotyki (Kander, 2001; Prost, 1999; Usajewicz, 1999).
Badania stabilności enzymów stosowanych do celów paszowych w czasie obróbki hydrotermicznej mieszanek paszowych są trudne do przeprowadzenia, głównie z względu na problemy w oznaczaniu ich aktywności po dodaniu do paszy. Ekspandowanie prowadzone w temperaturze ponad 850C i granulowanie w temperaturze powyżej 700C może powodować stopniową utratę aktywności enzymów aż do poziomu zerowego przy temperaturach ekspandowania i granulowania odpowiednio: 1150 i 900C. Uważa się, że temperatura powyżej 800C powoduje rozkład hydrolaz. Pomimo obniżania aktywności pod wpływem temperatury, enzymy wykazują działanie już podczas procesu przetwarzania, po nawilżeniu paszy wodą lub parą wodną. Producenci paszowych preparatów enzymatycznych zabezpieczają je przed utratą stabilności, stosując termostabilne nośniki. Efektywność tych zabiegów jest zróżnicowana (Rossi i Théwis, 2001), dlatego interesującym rozwiązaniem może być nanoszenie enzymów w postaci ciekłej na granulowaną lub ekspandowaną mieszankę paszową poddaną chłodzeniu.
Termostabilność finalnego produktu enzymatycznego (Medel i wsp., 2002) zależy od następujących czynników: termostabilności swoistej enzymu, zwiększenia oporności na wysoką temperaturę przez „usztywnienie” struktury enzymu, granulację preparatu oraz pokrycie preparatu warstwą ochronną. „Usztywnienie” struktury enzymu odbywa się przez ustabilizowanie go na substracie, który wypełniając centrum aktywne enzymu zwiększa jego wytrzymałość na niesprzyjające warunki, występujące podczas procesu produkcji paszy. Jeśli chodzi o termostabilność swoistą, to do produkcji najbardziej obecnie termostabilnej ksylanazy, stosowanej w produkcji pasz, użyto enzymów produkowanych przez pleśnie żyjące w gejzerach Islandii, a więc przystosowane do życia w wysokich temperaturach. Dalsze zwiększenie termostabilności można uzyskać, stosując granulowanie ustabilizowanego produktu. Na przykład mikrogranulat (Zerkadas i Wiseman, 2002) ma termostabilność o około 100C wyższą niż ten sam enzym w formie płynnej. Otoczkowanie mikrogranulatu zwiększa jego termostabilność o dalsze około 100C.
Drugim istotnym czynnikiem powodującym optymalne działanie enzymów jest stałe określone pH środowiska, w którym enzym lub enzymy mają działać. Na przykład zawarta w soku żołądkowym pepsyna wymaga kwaśnego środowiska, podczas gdy enzymy wydzielane do jelit potrzebują środowiska zasadowego. W zdrowym organizmie enzymy w miejscach swego oddziaływania mają zapewnione optymalne warunki. Gdy jednak równowaga kwasowo-zasadowa zostaje zachwiana (na przykład podczas choroby lub pod wpływem złej jakości zdrowotnej środków żywienia zwierząt) skuteczność enzymów ulega upośledzeniu bądź ich czynność całkiem zanika (Yin i wsp., 2000a i 2000b).
Enzym może działać tylko po połączeniu się z innym związkiem chemicznym. Związki takie to substraty. Gdy w organizmie występuje nadmiar substratu, dochodzi do substratowego stłumienia czynności enzymu. Jeśli enzym w normalnych warunkach oddziałujący na kilka substratów ma do czynienia z występowaniem jednego z nich w zwiększonych ilościach, dochodzi do tzw. stłumienia kompetycyjnego. Następuje skoncentrowanie się na związku występującym w nadmiarze, w efekcie czego enzym przestaje działać na pozostałe, występujące w mniejszych ilościach substraty.
Celem stosowania enzymów w żywieniu zwierząt monogastrycznych (Officer, 1995; Rooke i wsp., 1998), jest: (i) uzupełnienie enzymów wytwarzanych przez zwierzęta (endogennych); (ii) poprawa strawności składników pokarmowych paszy; (iii) zwiększenie energii w dawce pokarmowej; (iv) zwiększenie przyrostów masy ciała i lepsze wykorzystanie paszy; (v) redukcja substancji antyżywieniowych (antymetabolitów); (vi) zastosowanie tańszych pasz.
Inne stymulatory wzrostu zwierząt
W ostatnich latach wyraźnie zmienił się stosunek zarówno świata nauki, jak i hodowców zwierząt do hormonalnych, antybiotykowych (Sokolnicka, 1999; Yamamoto i wsp., 2000) lub chemioterapeutycznych stymulatorów wzrostu. W wielu krajach świata obowiązuje zakaz stosowania środków hormonalnych w produkcji zwierzęcej. Szczególnie dotyczy to hormonów sterydowych i ich analogów. Od czasu ogłoszeniu raportu Komisji Swanna zaleca się także ograniczanie stosowania antybiotyków, a niektórych, np. tetracykliny, chloramfenikolu lub cyklosporyny A, wręcz zabrania. Wymienione antybiotyki były stosowane przez lekarzy weterynarii w celach profilaktyczno-leczniczych oraz przez hodowców zwierząt jako stymulatory wzrostu. Powszechne stosowanie powodowało i nadal powoduje zmniejszenie skuteczności ich działania (jest to pewnego rodzaju tachyfilaksja) (Posyniak i wsp., 1994). Istnieje również możliwość ich kumulacji w organizmie zwierząt karmionych paszami z tego rodzaju dodatkiem (Szprengier-Juszkiewicz, 2002). Toksyczne działanie skumulowanych w organizmie stymulatorów wzrostu na różne narządy, zarówno zwierząt, jak i ludzi jest doskonale znane.
Adaptacja trzustki
Teoretycznie, koordynacja regulacji enzymów trawiennych przez środki żywienia zwierząt mogłaby optymalizować trawienie i wykorzystanie tych środków (Lizardo i wsp., 1997), lecz i tak trzustka syntetyzuje i wydziela 10-krotnie więcej enzymów trawiennych niż potrzeba. Dotychczas fizjologiczne znaczenie adaptacji trzustki nie zostało określone (Soriani i wsp., 1995). Z badań przeprowadzonych do chwili obecnej wynika, że kinetyka procesu adaptacyjnego trzustki przy zmianie diety jest podobna u różnych gatunków zwierząt bez względu na sposób określania aktywności trzustki; aktywność enzymatyczna na trzustkę, lub na gram trzustki, lub na miligram białek trzustki. Pierwsze zmiany po wprowadzeniu nowej diety mają miejsce po 24 godzinach i utrzymują się przez około 5 - 7 dni. Przy wysokobiałkowej diecie wzrasta synteza chymotrypsyny i trypsyny o 50 - 70%, przy równoczesnym spadku syntezy amylazy o 25%. Przy bardzo wysokiej diecie białkowej (64 - 71% kazeiny) wzrasta zawartość trypsynogenu i chymotrypsynogenu w granicach 80-600%, lecz procesy syntezy wzrastają od 250 do 1800%. Tego rodzaju reakcje trzustki mogą mieć miejsce u świń, gdy podawane jest białko o wysokiej wartości - typu kazeiny lub białko rybie.
Mechanizm zmiany składu enzymatycznego soku trzustkowego spowodowany dietą odbywa się na poziomie genów (Curran i Murray, 2000), na zasadzie transkrypcji mRNA, a następnie przepisania (translacji) przez rybosomy na cząsteczkę swoistego białka (enzymu) (Soriani i Freiburghaus, 1996). Muszą też istnieć mediatory procesów adaptacyjnych trzustki (Fukuoka i wsp., 2002; Herzig, 1998). Są one wzbudzane czy prowokowane czynnikami wchodzącymi w skład diety (Lizardo i wsp., 1997), działającymi na komórki pęcherzykowe. Zakłada się, że są trzy podstawowe typy mediatorów: (i) uwolnione hormony żołądkowo-jelitowe w odpowiedzi na obecność treści pokarmowej lub jej zhydrolizowanych produktów w świetle przewodu pokarmowego (Herzig, 1998); (ii) uwolnione hormony w wyniku wchłonięcia zhydrolizowanych składników pokarmowych lub ich metabolitów (Valette i wsp., 1992); (iii) składniki pokarmowe lub ich metabolity które zostały wchłonięte bezpośrednio w początkowych częściach przewodu pokarmowego (Brannon, 1990).
Stopień aktywności wydzielniczej trzustki można określić na podstawie zmiany poziomów mRNA (Brannon, 1990; Rasmussen i wsp., 1993; Wickier-Planquart i Puigserver, 1992) i cholecystokininy (Zabielski i wsp., 1994). Jedną z możliwości oceny stopnia aktywności trzustki jest sposób pośredni, przez ocenę zawartości ziaren zymogenu w komórkach pęcherzykowych.
Hipotezy reakcji trzustki na proteazy egzogenne
Poznając ujemny wpływ na ludzi hormonów, antybiotyków i chemioterapeutyków zawartych w środkach spożywczych pochodzenia zwierzęcego, zaczęto zauważać obecność substancji antyżywieniowych (antymetabolitów) w poszczególnych roślinnych materiałach paszowych. Niekorzystne działanie inhibitorów proteaz polega głównie na ograniczeniu wykorzystania białek z pasz przez zwierzęta w wyniku blokowania enzymów proteolitycznych, z którymi tworzą one nieaktywne kompleksy.
Wielkość egzokrynnej aktywności trzustki zależy również od udziału w dawce pokarmowej podstawowych składników odżywczych (O'Keefe i wsp., 2000). Oprócz nich mają również wpływ fitostymulatory zawarte w środkach żywienia zwierząt. Najczęściej są to: witaminy, kwas pantotenowy, flawonoidy, karotenoidy, fitosterole, związki aminowe (m. in. histamina, acetylocholina lub serotonina). Zawarte substancje czynne działają bezpośrednio lub w interakcji z czynnikami endogennymi, dając w końcowym efekcie określone działanie stymulujące (Pierzynowski i wsp., 1993c). Na przykład acetylocholina endo- i egzogenna bierze udział w procesie sprzężenia pobudzeniowo-wydzielniczego, w którego wyniku w komórkach gruczołowych wzrasta poziom Ca+2, zapoczątkowując proces wydzielania. Egzogenna histamina obniża efektywność dekarboksylazy histydynowej i wytwarzanie endogennej histaminy, ponadto uczula komórki okładzinowe na działanie gastryny oraz acetylocholiny. Flawonoidy przedłużają działanie adrenaliny i noradrenaliny (unieczynniając oksydazę adrenalinową), podwyższają poziom wapnia we krwi oraz mają właściwości odtruwające (Gajęcki i wsp., 1996). Jeżeli oprócz tego, ma miejsce zwiększone stężenie hormonu cholecystokininy (CCK) w śluzówce dwunastnicy (co jest fizjologiczne) (Herzig, 1998), to następuje wzmożenie wydzielania enzymów trzustkowych (Resch-Sedlmeier i Sedlmeier, 1999) oraz jednocześnie opóźnienie przechodzenia treści żołądkowej, odwrotnie niż w stanach biegunkowych (Rychlik; 2002a i 2002b), i hamowanie zdolności przyswajania pokarmu. Wszystko to razem powoduje wystąpienie odruchu sytości. Wiadomo również, że proteazy trzustki hamują uwalnianie CCK (Pierzynowski i wsp., 1993a). To ujemne sprzężenie zwrotne wydzielania enzymów trzustki kontroluje liberator peptydowy (CCK - RP) wrażliwy na trypsynę (Kania, 1994a i 1994b).
W opisanym mechanizmie, na zasadzie odruchu, dużą rolę odgrywa miejscowy układ autonomiczny związany z neuronami cholinergicznymi i impulsami przesyłanymi z ośrodkowego układu nerwowego za pośrednictwem nerwu błędnego (jako efekt odblokowania uczucia głodu). W rezultacie, prawdopodobnie zwiększeniu ulega stężenie wazoaktywnego peptydu jelitowego (VIP), który nasila bezpośrednie działanie acetylocholiny na komórki gruczołów żołądkowych, powodując wzrost wydzielania kwasu solnego i pepsyny (Fölsch, 1990; Rychlik, 2002c).
Po przeanalizowaniu wyżej wymienionych argumentów, słuszne wydaje się zastosowanie egzogennych proteaz (Rooke i wsp., 1998), które teoretycznie powinny obniżyć stężenie CCK. W efekcie powinien zostać zablokowany odruch sytości i wzrosnąć apetyt, co w konsekwencji powinno doprowadzić do wzmożenia pracy żołądka oraz zwiększenia zdolności przyswajania substancji odżywczych w jelitach. Tego rodzaju substancje stymulujące są bezpieczne, ponieważ nie przenikają w głąb organizmu a ich działalność ogranicza się do przewodu pokarmowego. Rodzi się jednak pewna wątpliwość: co dzieje się z ziarnistościami zymogenu produkowanymi w komórkach pęcherzykowych trzustki? Czy jest to sytuacja obojętna dla pęcherzyków zewnątrz wydzielniczych? Czy mimo odpowiedniej ilości enzymów proteolitycznych (egzogennych) w świetle przewodu pokarmowego, ich produkcja trwa nadal?