Wymagania wzrostowe komórek. Podłoża hodowlane

Podłoża hodowlane (media, pożywki)

Do hodowli In vitro

komórki potrzebują
mieszaniny składników
odżywczych, soli
mineralnych, czynników
wzrostowych,
transportujących i
ochronnych, czyli tzw.
Medium. Odzwierciedlają
one warunki panujące In
vivo i są niezbędne do
przeżycia, wzrostu i
różnicowania komórek.

Skład:
• Woda
• Węglowodany
• Aminokwasy
• Witaminy i prekursory

nukleotydów

• Białka
• Lipidy i kwasy

tłuszczowe

• Sole nieorganiczne
•

Surowica

Woda

Ultra czysta woda – do pożywek z proszku

lub koncentratów. Podwójnie destylowana,
przepuszczana przez wymieniacze jonowe
i filtry z węgla aktywnego. Czystość wody
monitorujemy poprzez:

• Pomiar oporności - co najmniej 18 mW/cm.
• Pomiar TOC (total organic carbon) < 10

ppb

• Wolna od cząsteczek > 0,22 mm

Węglowodany:
• Źródło energii. Najczęściej fruktoza, galaktoza,

maltoza lub glukoza (metabolizowana na
drodze glikolizy prowadzi do powstania kwasu
mlekowego, obniżającego pH pożywki). W
zależności od wymagań komórek 1 do 4.5 g/l.

• Dodawany dodatkowo pirogronian sodu
Aminokwasy:
• Glutamina, arginina, cysteina, lizyna itp.

Źródło energii (glutamina) i materiał
wyjściowy do produkcji innych związków.
Szczególnie potrzebne aminokwasy
egzogenne.

Witaminy - Grupa B
•witamina B1 (tiamina)
•witamina B2

(ryboflawina)

•witamina B3 (PP - niacyna)
•witamina B5 (kwas

pantotenowy)

•witamina B6 (pirydoksyna)
•witamina B7 (H -

biotyna)

•witamina B9 (kwas foliowy)
•witamina B12

(cyjanokobalamina)

•Kwas askorbinowy
•Inozytol

Hormony i czynniki wzrostu:

• FGF - Fibroblast growth factor
• EGF - Epidermal growth factor
• PDGF - platelet-derived growth

factor

• IGF-I i II -insulin-like growth factors
• Insulina

Prekursory kwasów nukleinowych:

Nukleozydy:
Adenozyna
Guanozyna
Cytydyna
Tymidyna
Urydyna
Pentozy (ryboza)

Białka

• Fetuina, kolagen, laminina – czynniki adhezyjne, składniki

macierzy pozakomórkowej, ułatwiające przyleganie komórek i
pobudzające proliferację i różnicowanie.

• Albuminy – białko nośnikowe dla kwasów tłuszczowych,

witamin rozpuszczalnych w tłuszczach, hormonów, jonów Ni,
Zn, Cu, metali ciężkich i inhibitorów wzrostu (chroni komórki
przed wpływem toksyn), działa jako bufor i chroni przed
uszkodzeniami mechanicznymi, zapewnia izotoniczność płynu.

• Transferyna – transport metali, wanad, mangan i przede

wszystkim Fe. Zapobiega jego właściwościom toksycznym i
hamuje infekcje bakteryjne.

• Antyproteazy – a-antytrypsyna i a2-makroglobulina.

Zapobiegają uszkodzeniu komórek na skutek działania proteaz.

Lipidy i kwasy

tłuszczowe:

• Kwas liponowy

(unieszkodliwia wolne
rodniki, bierze udział
w przekształcaniu
pirogronianu)

• Cholesterol – budowa

błony komórkowej

• Niezbędne do hodowli

niektórych linii
komórkowych
(Szpiczak mnogi NS-1,
NS-0)

Sole mineralne:
Na, K, Cl, Zn, Cu, Se, Fe -

kofaktory reakcji
enzymatycznych,
stabilizacja potencjału
błonowego, usuwanie
wolnych rodników,
pomagają utrzymać
odpowiednie ciśnienie
osmotyczne

, Ca

– niezbędne

do prawidłowej
konformacji białek
macierzy
zewnątrzkomórkowej

Surowica

Funkcje:
1.Stymuluje wzrost, proliferację i różnicowanie

komórek.

2.Ułatwia adhezję komórek do powierzchni

wzrostowej.

3. Zapewniają dystrybucję hormonów, soli

mineralnych i lipidów.

4.Neutralizuje toksyczne produkty przemiany

materii, metale ciężkie, enzymy proteolityczne,
endotoksyny, działa jako układ buforujący.

Zawiera niezbędne do hodowli:
• Białka (albuminy, transferyna, antyproteazy,

czynniki adhezyjne)

• Czynniki wzrostu FGF, EGF, PDGF IGF-I i II

(zwłaszcza FBS!)

• Hormony (insulina, glikokortykoidy)

W zależności od linii komórkowej 5-15 %

objętości podłoża

Produkcja – krew zwierzęca – atest

pochodzenia zwierząt z obszarów
wolnych od BSE i Scrapie.

•Surowica bydlęca – calf serum/ bovine

serum - BS

•Surowica płodowa – fetal bovine serum

– FBS

•Surowica końska – Horse serum - HoS

Przechowywać w -20

C – jak najrzadziej

rozmrażać

Inaktywacja – (Heat inactivation) polega

na trzymaniu surowicy przez 30 min w
temperaturze 56

C w łaźni wodnej. Cel:

inaktywacja układu dopełniacza i
immunoglobulin, osłabienie wirusów i
mykoplasm.

Hodowla komórek – pożywki bez surowicy

Wady związane z używaniem

surowicy:

• Zmienność (między płodami,

wiekiem, pochodzeniem,
karmieniem zwierząt, porą roku
itp.)

• Intensywne testy określające

jakość – ryzyko zanieczyszczenia
bakteriami, grzybami, wirusami =
duże koszty.

• Ryzyko interakcji składników z

badanymi związkami.

• Oczyszczanie końcowego

produktu np. w przypadku
biofarmaceutyków

• Stosunkowo krótki okres ważności

Pożywki bez surowicy

Zalety:
• Niższe ryzyko zanieczyszczeń

(wirusowe, bakteryjne, grzybowe,
priony).

• Łatwiejsze oczyszczanie produktu.
• Zdefiniowany i powtarzalny skład.

Zwiększenie powtarzalności wyników.

• Osiągnięcie selektywnego wzrostu

poprzez dodanie czynników wzrostu
swoistych dla danego typu komórek.

Wady związane z używaniem

pożywki bez surowicy:

• Nie działa tak dobrze jak pożywka z

surowicą

Układy buforujące i

antybiotyki

• NaHCO

• HEPES - (4-(2-hydroxyethyl)-1-

piperazineethanesulfonic acid ) - jon
obojnaczy (zwitterjon)

• PBS - Phosphate buffered saline
• HBSS - Hank's Balanced Salt Solution

Antybiotyki:
streptomycyna (100 mg/ml), penicylina (100

mg/ml)

Przykładowe podłoża

• MEM (Minimal Essential

Medium) i DMEM -
Dulbecco

• IPL-41, TC- 100, TNM -

FH– hodowle komórek
owadzich.

• RPMI (Roswel Park

Memorail Institute)
1640

• Media dla określonych

komórek: Hepatopan,
Melanopan, Neuropan

Document Outline