Modele transgeniczne jako modele badawcze

Całkowita światowa liczba badań z użyciem
zwierząt może przekraczać 50 mln rocznie.

• USA – około 15 mln procedur
• EU – około 11 mln procedur
• JAPONIA – około 5 mln procedur
• KANADA – około 2 mln procedur
• SZWAJCARIA - >1 mln procedur

- eksperymenty zwierzęce
- procedury /normalne zwierzęta doświadczalne/
- procedury /zwierzęta modyfikowane

genetycznie/

Badania biomedyczne:

• rozwój nowych metod terapii i profilaktyki –

28%

• podstawowe badania biologiczne i

medyczne – 31%

• testowanie bezpieczeństwa

niemedycznych produktów używanych w
gospodarstwie, rolnictwie, przemyśle – 2%

• hodowla zwierząt laboratoryjnych – 37%
• rozwój nowych metod diagnozowania – 2%

Uzyskanie wiarygodnych wyników badań farmakologicznych,
toksykologicznych oraz badań nad procesami fizjologicznymi
wymaga badań „in vivo”, czyli na organizmach żywych.
Najczęściej wykorzystuje się w tym celu modele zwierzęce.
Konieczne jest „dostosowanie” takiego zwierzęcia, których
wyniki mają mieć odniesienie do ludzi. W tym celu wykorzystuje
się modyfikacje genetyczne. Ponadto modele transgeniczne
pozwalają na szeroko rozumiane poznawanie genów, ich
funkcjonowanie, współdziałanie, ekspresje, specyficzność oraz
odpowiedź na bodźce hormonalne. Stosowanie transgenicznych
modeli zwierzęcych jest chętnie wykorzystywanym narzędziem
w badaniach toksykologicznych i farmakologiczntych.

Od wielu lat najczęściej wykorzystywanymi zwierzętami w badaniach
eksperymentalnych są małe gryzonie np. myszy i szczury. Wiele cech
powoduje, że są one równie chętnie wykorzystywane do badań z użyciem
modeli transgenicznych.

Najważniejsze zalety tych gryzoni:
• Małe rozmiary i częste, niezależne od sezonu cykle

rozrodcze

• Możliwość krzyżowania wsobnego
• Długa historia hodowli i dostępność protokołów

hodowlanych

• Istnienie i dostępność licznych odmian genetycznych
• Możliwość zastosowania transgenezy
• Stosunkowo duża wydajność transgenezy

Modele transgeniczne stworzono dla wielu ludzkich chorób, takich

jak różnego rodzaju nowotwory, schorzenia neurologiczne,

choroby układu sercowo-naczyniowego, krwiotwórczego lub

immunologicznego. Odgrywają one bardzo istotną rolę w

badaniach nad chorobami o podłożu genetycznym .

Przykłady badań nad chorobami ludzkimi z wykorzystaniem
zwierząt modyfikowanych genetycznie:
• Mysz podatna na zakażenie wirusem polio
• „Smart mouse” (inteligentna mysz) – badania

biochemicznych podstaw procesów zapamiętywania

• badania mutagenezy toksyczności i metabolizmu

ksenobiotyków

• Badania kancerogenezy i chemoprewencji nowotworów
• „Min mouse” – badania nowotworów jelita grubego
• Badania mechanizmów skórnej kancerogenezy
• Badania nad genem P53

Technika oparta na wirusach

Jest to najstarsza z trzech głównych technologii. Następuje w niej

wprowadzenie wirusa do komórki, po to, aby dostarczył transgen do

docelowych jąder. Obecnie naukowcy z niej rezygnują, ze względu na

jej niedoskonałość: wielokrotne wprowadzanie transgenu do obcego

genomu utrudnia lub wręcz uniemożliwia interpretacje efektów

badań.

Stosowanie tej metody daje niewielką ilość żywych transgenicznych

organizmów. Prowadzi także do produkcji tzw. mozaikowych zwierząt,

których transgen jest przenoszony i dokonuje ekspresji jedynie w

niektórych komórkach ciała. Dodatkowo wiadomo, że materiał

genetyczny wirusów łączy się z sekwencjami DNA obcego genomu, co

w konsekwencji prowadzi do powstania nowych, bardziej zajadłych

wirusów.

Ponadto, znany jest
fenomen zwany
„wprowadzoną
onkogenezą”, oparte na
tym, że komórki, do
których zostały
wprowadzone obce
genomy wirusów, ulegają
zrakowaceniu

Pronuklearne mikroiniekcje

Ta często stosowana metoda stanowi normę badawczą, ze względu

na jej skuteczność w porównaniu do wirusowej transgenezy –

chociaż jej średnia skuteczność wynosi 1-10%, co oznacza, że nadal

90-99% zwierząt jest zabijana.

W tej technice samice zwierząt (np. myszy) otrzymują zastrzyk

hormonalny, wywołujący wzmożoną produkcje komórek jajowych. Po

takiej sesji hormonalnej zapładnia się naturalnie samice, które po

określonym czasie zabija się w celu uzyskania embrionów.

Następnie za pomocą iniekcji wprowadzone zostają do nich

transgeny. 20 lub 30 embrionów jest wówczas transferowanych do

odpowiedniej liczby samic myszy, które były uprzednio

przygotowane do przyjęcia ciąży. Jest ich tyle, gdyż zazwyczaj tylko

4-5% początkowych embrionów zawiera transgen. Następnie po

trzech tygodniach od wykonanego transferu następuje poród

zwierząt, które przeżyły ten proces.

Embrionalne jądro komórkowe

Ta metoda posługuje się jądrem zarodowych komórek

macierzystych, we wczesnym stadium rozwoju, zwanym

blastocytem. Blastocyty to embriony, które rozwinęły się kilka

dni po zapłodnieniu i składają się z ok. 100 zarodowych

komórek, które jeszcze się nie zagnieździły.

Embriony, które mają tylko kilka dni, są pobierane z

wcześniej zabitego zwierzęcia. Komórki są izolowane i

przechodzą proces inkubacji in vitro.
W tym czasie wprowadzany jest

transgen za pośrednictwem

zaprojektowanego wirusa lub

prądu elektrycznego. Transgen jest

wprowadzany razem z innym

genem, tzw. markerem, który

pozwala zidentyfikować jądro

komórkowe zawierające transgen,

oraz je wyselekcjonować

antybiotykiem – tylko komórki

zawierające transgen będą na

niego odporne. Następnie zostają

one połączone z nowym, „obcym”

blastocytem i transferowane do

ciężarnej samicy.

Podstawowe standardy zwierzętarni:
• Oświetlenie

-Optymalne natężenie – 60 luksów (natężenie 1 000-2 000 luksów wywołuje
ślepotę u zwierząt)
-Odległość od źródeł światła – szczególnie istotna u zwierząt
albinotycznych
-Ciemność – szyszynka pobudzona do produkcji enzymu HIOMT – synteza
melatoniny – hamowanie wydzielania z podwzgórza LHRH – hamowanie
działania przysadki mózgowej

• Temperatura – 20 – 22stopni C (strefa obojętności cieplnej –

charakterystyczna dla gatunku – oddawanie i wytwarzanie ciepła
optymalne)

• Wilgotność – optymalna dla zwierząt laboratoryjnych wynosi około 55±5%

wilgotności względnej (powiązanie z temperaturą)

• Ciśnienie – czynnik bardzo trudny do standaryzacji, regulowany systemami

wentylacyjno-klimatyzacyjnymi

• Skład powietrza – właściwy skład powietrza osiąga się przez określoną

liczbę wymian powietrza na godzinę (pomieszczenie o kubaturze 60 m3 –
10 - 20 wymian w ciągu godziny, powietrze filtrowane przez zespół 3 filtrów)

• Kilkukrotnie filtrowana woda pitna
• Konieczne ubrania ochronne: fartuchy, ochraniacze na buty, czepki,

rękawice

Standardy pracy przy hodowli za wyższą barierą:

• pracownicy przechodzą przez 3-stopniową śluzę:

1. szatnia – zdjęcie wszystkich rzeczy, łącznie z okularami,
2. 20 minutowy prysznic – środek dezynfekujący + woda,
3. założenie jałowego ubrania roboczego,

• pomieszczenia dla zwierząt są monitorowane –

przechodząc z jednego do drugiego należy zmieniać
maskę, rękawiczki etc.,

• osoby pracujące w części hodowlanej nie mogą posiadać

zwierząt domowych, które mają kontakt z gryzoniami,

• osoby z objawami chorobowymi nie mogą przebywać w

części hodowlanej,

• wychodząc przechodzi się przez podobne procedury, ale

bez mycia.
Wszystkie środki ostrożności stosuje się, ponieważ
zwierzęta te mają bardzo słabą odporność i nie posiadają
naturalnej flory bakteryjnej.