Mutageneza oparta na 

reakcji PCR

Mutageneza

  Metoda wprowadzona wkrótce po odkryciu techniki PCR i 

termostabilnych polimeraz (1988-1989)

  Mutageneza ukierunkowana:

- zamiana jednego lub kilku nukleotydów w określonym miejscu 

sekwencji DNA

- delecja określonego fragmentu DNA
- insercja określonego fragmentu DNA

    Mutageneza przypadkowa:

       - najczęściej zamiana różnych zasad w wielu miejscach

  Określenie ważności poszczególnych sekwencji – np. dla 

struktury białka, aktywności katalitycznej, wiązania ligandów

  Określenie funkcji całego genu/białka
  Modyfikacja (ulepszenie) znanych białek

Cel mutagenezy

Ogólna zasada mutagenezy 

ukierunkowanej wykorzystującej 

oligonukleotydy jako nośniki 

mutacji

  Syntetyczny oligonukleotyd (starter) zawierający 

żądaną mutację przyłącza się do określonego regionu 
matrycy DNA, gdzie zapoczątkowuje syntezę in vitro

  Polimeraza wydłuża oligonukleotydową sekwencję 

syntetyzując podwójną nić DNA, zawierającą żądaną 
mutację

  Zmieniony DNA jest włączany do odpowiedniego 

miejsca w genie

  Weryfikacja mutacji (sekwencjonowanie)
  Selekcja zmutowanych klonów
  Ekspresja zmienionego białka i jego charakterystyka

NH

2

COOH

Asn-Xaa-

Ser/Thr

Przykład – mutageneza punktowa 

miejsca N-glikozylacji

Mutacja miejsca nr 3 w triplecie aminokwasów  (zamiana Ser lub 
Thr na inny aminokwas, np. alaninę) –  wykluczenie lub 
potwierdzenie znaczenia glikozylacji

N-
glikan

Insercja 
fragmentu DNA 
do docelowego 
genu

Gen z dodanym 
fragmentem DNA

p

p

p

5’

Zamiana jednej lub kilku zasad 

(substytucja)

Delecja

Insercja

Matryca – plazmid z 
wklonowanym genem

PCR

DpnI, polimeraza DNA 
Pfu

p

p

Pocięta 
matryca  i 
hybryda DNA

Liniowy DNA

T4 ligaza DNA

ExSite PCR-

based Site-

directed 

Mutagenesis 

kit 

(Stratagene)

p

Transformacja bakterii i 
hodowla bakterii na 
płytce

Zamiana jednej lub kilku zasad 
(substytucja)

Delecja

Insercja

1. Denaturacja 

plazmidu

2. Przyłączenie 

starterów

3. Synteza nowych 

nici plazmidu

4. Trawienie enzymem 

restrykcyjnym DpnI

5. Transformacja 

bakterii E. coli 
mieszaniną 
reakcyjną

6. Hodowla bakterii na 

płytce z podłożem 
agarowym 
zawierającym 
antybiotyk

QuikChange 

Mutagenesis 

kit 

(Stratagene)

Mutageneza 
przypadkowa

GeneMorph 

Mutagenesis 

kit 

(Stratagene)

Zastosowanie polimerazy DNA o 
zwiększonej właściwości 
wprowadzania błędów w 
syntetyzowaną nić DNA – 
substytucja, czyli zamiana 
pojedynczych zasad

Amplifikacja genu 
poprzez PCR

Ligacja

Transformacja

Selekcja klonów

Zmutowany gen

Mutageneza 
przypadkowa