Oczyszczanie białek i badanie ich oddziaływań z kwasami nukleinowymi

Oczyszczanie białek i

badanie ich oddziaływań z

kwasami nukleinowymi

Metody chromatograficzne

– Chromatografia kolumnowa
– Chromatografia cienkowarstwowa
– Chromatografia powinowactwa
– Wysokosprawna chromatografia

cieczowa HPLC)

Chromatografia

powinowactwa

Używane są:
• Przeciwciała
• Jony metali
• Białka rekombinowane
• Lektyny
• Receptory

Chromatografia powinowactwa

Złoże

Ligand związany ze złożem

Cząsteczki wiążące
specyficznie ligand

Cząsteczki o różnym
powinowactwie do liganda

Chromatografia
powinowactwa na
kolumnie

Chromatografia
powinowactwa w
zawiesinie

Białka z motywem polihistydyny

Izolacja immunoglobulin zawierających His-

tag na kolumnie chromatograficznej z

ligandem Ni

Kolumny chromatograficzne są z reguły znacznie
mniejsze, a czasy przepływu - krótsze
Częściej stosowane w metodach analitycznych, ale w
przypadku niewielkiej objętości próby mogą być
stosowane preparatywnie
Rozdzielczość znacznie wieksza niż w klasycznej
chromatografii
W niektórych wypadkach mogą być używane warunki
silnie denaturujące

HPLC (high performance
liquid chromatography)

HPLC (high performance liquid

chromatography) - wysokowydajna

chromatografia cieczowa

Aparaty HPLC

• zbiornik na eluent

• pompa, zapewniająca stałe ciśnienie eluenta w układzie

• injektor - przyrząd umożliwiający wstrzykiwanie

analizowanych próbek bez rozszczelnienia układu

(zwykle dzięki zastosowaniu tzw. martwej pętli)

• prekolumna, która ma usuwać z eleunta wszelkie

zanieczyszczenie, które mogłyby zniszczyć wypełnienie

kolumny

• kolumna z odpowiednim wypełnieniem

• detektor – (spektrometr UV-VIS, fluorescencyjny,

spektrometr mas, laserowy spektrometr

rozproszeniowy)

• zbiornik na zużyty eluent, lub w przypadku aparatów

preparatywnych kolektor frakcji - system zbiorniczków,

które są automatycznie zmieniane, gdy detektor

stwierdza wypływ kolejnego rozdzielanego związku

chemicznego

Wynik rozdziału HPLC

Sekwencjonowanie białek

Sekwencjonowanie białek – metoda

Edman’a

Wiązanie N-końcowej grupy aminowej białka

z odczynnikiem Edmana (fenyloizotiocjanian-PITC);
powstaje fenylotiokarbamylowa pochodna peptydu

Oderwanie N-końcowego aminokwasu jako pochodnej
Przeprowadzenie niestabilnej pochodnej w bardziej

stabilną fenylotiohydantoinę

Rozdział metodą chromatografii HPLC, identyfikacja w

oparciu o wzorce

Degradacja Edmana – metoda sekwencjonowania peptydów

polegająca na kolejnym odrywaniu oznakowanych aminokwasówz

końca N cząsteczki peptydu.

Pierwszy etap to reakcja N-fenyloizotiocjanianu z terminalną grupą
–NH2, która w łagodnym środowisku alkalicznym występuje w formie
obojętnej (niesprotonowanej).
Drugi etap - powstała pochodna tiomocznika w środowisku kwasu
solnego ulega cyklizacji i rozpadowi do produktu degradacji
nazywanego fenylotiohydantoinową pochodną aminokwasu (tzw.
PTH-aminokwasu) oraz peptydu, krótszego o jeden aminokwas.
Trzeci etap - powstające PTH-aminokwasy są identyfikowane za
pomocą chromatografii i wzorców

Sekwencjonowanie białek

Spektrometria mas (MS, Mass Spectrometry) uniwersalna
technika analityczna, której podstawą jest pomiar stosunku
masy cząsteczki do jej (m/z). Pierwszy spektrometr mas został
zbudowany przez J.J. Thompsona w 1911 roku

Techniki jonizacji

•

Jonizacja elektronami (Electron Ionisation - EI) - jonizacja przy pomocy wiązki elektronów.

Jonizacja odbywa się w próżni. Metoda ta powoduje zwykle fragmentację badanych

cząsteczek. EI charakteryzuje się stosunkowo małą wydajnością - poniżej 1% cząsteczek

ulega jonizacji.

•

Elektrorozpylanie (Electrospray, ESI), polegające na rozpylaniu cieczy zawierającej badaną

substancję z igły, do której przyłożono wysokie napięcie (zwykle 1 - 5 kV) pod ciśnieniem

atmosferycznym. Jest to jedna z łagodnych metod jonizacji - zwykle nie powoduje

fragmentacji badanych cząsteczek. Metoda ta jest bardzo często stosowana w badaniach nad

biopolimerami

•

Termorozpylanie (Termospray, TE) - jonizacja przez podgrzanie przy pomocy prądu

elektrycznego roztworu zawierającego sól i analizowaną substancję wewnątrz stalowej

kapilary. Gorąca substancja jest rozpylana w komorze próżniowej z prędkością naddźwiękową.

•

Jonizacja chemiczna (Chemical Ionisation, CI) - jony wytwarzane są na skutek zderzeń

cząsteczek badanego związku chemicznego z jonami pierwotnymi obecnymi w źródle jonów.

Jest to metoda nie powodująca fragmentacji cząsteczek (łagodna jonizacja). Jonizacja odbywa

się zwykle przy ciśnieniu rzędu 60Pa.

•

Bombardowanie szybkimi atomami (Fast-Atom Bombardment FAB), polegającą na

bombardowaniu cząsteczki obojętnymi atomami o wysokiej energii (zwykle 17 lub 70eV).

Cząsteczki mogą znajdować się w fazie gazowej lub być rozpuszczone w ciekłej, mało lotnej

substancji (matrycy) np.glicerolu.

•

Bombardowanie jonami (spektrometria mas jonów wtórnych - Secondary Ion Mass

Spectrometry - SIMS) Metoda ta początkowo była stosowana do substancji przewodzących

prąd lub substancji naniesionych na metalowe płytki. Obecnie metodę SIMS stosuje się z

powodzeniem do substancji nie przewodzących prądu. Istnieje odmiana techniki SIMS, w

której badana substancja jest rozpuszczona w ciekłej matrycy (najczęściej glicerolu). Technika

ta jest nazywana czasami LSIMS (Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry) lub FIB (Fast Ion

Bombardment).

•

Desorpcja laserowa (Laser Desorption - LD) - w której jonizacja następuje przez

naświetlanie próbki silnym laserem, a zatem bombardującymi cząstkami są

wysokoenergetyczne fotony.

•

Desorpcja laserowa z udziałem matrycy (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation -

MALDI) - w której stosuje się jonizację laserową, ale z tak dobraną energią wiązki, aby nie

doprowadzać do fragmentacji cząsteczek (łagodna metoda jonizacji), lecz tylko do ich

"wybijania" ze specjalnie przygotowanej matrycy. Matryca absorbuje energię lasera, która jest

później przekazywana do analizowanych cząsteczek. Metoda ta jest bardzo często stosowana

w badaniach nad biopolimerami i polimerami syntetycznymi.

ESI MS

(Electrospray

ionization

Mass

Spectrometry

)

Desorpcja laserowa z udziałem matrycy (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation
- MALDI)

Typy analizatorów stosunku masy do

ładunku

•

Analizator czasu przelotu

(Time Of Flight TOF)

• Sektor magnetyczny (Magnetic sector)

• Sektor elektryczny

• Kwadrupol

• Pułapka jonowa (Ion trap - IT)

• Liniowa pułapka jonowa (Linear Ion Trap,

Linear Trap Quadrupole - LTQ)

• Analizator cyklotronowego rezonansu jonów

(Ion Cyclotron Resonance ICR)

• Analizator cyklotronowego rezonansu jonów

z fourierowską transformacją wyników

(Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance FT-

ICR)

Analizatory masy

Analizator czasu przelotu (TOF,
Time Of Flight)
Analizatory TOF charakteryzują się
stosunkowo dużymi
rozdzielczościami rzędu
kilkudziesięciu tysięcy daltonów (do
100000) oraz dosyć dużą czułością.
Są najczęściej stosowane przy
analizie jonów wzbudzanych
metodą MALDI, która nie powoduje
rozpadu analizowanych cząsteczek

Jony, generowane w jonizatorze są przyspieszane w
analizatorze przy pomocy impulsu elektrycznego i zaczynają
dryfować przez jego komorę. Na końcu analizatora znajduje
się detektor połączony z urządzeniem rejestrującym czas od
impulsu przyspieszającego do momentu uderzenia
określonego jonu w detektor. Czas przelotu jest przeliczany
na stosunek masy cząsteczkowej jonu do jego ładunku
elektrycznego (m/z). Czym większy stosunek masy do
ładunku tym wolniej poruszają się analizowane jony.

Analizator z sektorem magnetycznym

Tor lotu jonów jest zakrzywiany, stopień zakrzywienia lotu zależy

od stosunku masy do ładunku (m/z) i prędkości jonu a także od

parametrów pola magnetycznego. Sektor magnetyczny

charakteryzuje się stosunkowo małą rozdzielczością - mniej niż

5000 thomsonów. Związane jest to głównie z dużymi różnicami

prędkości cząsteczek wpadających do urządzenia. Problem ten

rozwiązuje przez zastosowanie sektora elektrycznego przed

sektorem magnetycznym, w którym cząsteczki są rozpędzane,

dzięki czemu różnice prędkości są mniejsze

Poszukiwanie sekwecji nukleotydowych wiążących
się z białkiem
Metoda „footprint”

1. Znakowanie końca
2. Reakcja z białkiem
3. Trawienie DNA

kontrolnego

4. Trawienie DNA

skompleksowanego

5. Reakcja

sekwencjonowania
DNA kontrolnego

6. Elektroforeza

Powielanie cząstek
DNA ze znakowaniem
końcow i
kompleksowanie z
białkiem

Trawienie DNAzą

Elektroforeza fragmentów

„DNA footprint”

Metoda służy
określaniu sekwencji
nukleotydowej
fragmentów
reagujących z
białkami

Do cięcia używa się
nukleaz (DNazy I)
lub metod chemicznych
(z rodnikiem
hydroksylowym)

Badanie regulacji ekspresji genów

• Badanie mechanizmów regulacji ekspresji

genów polega na poszukiwaniu sekwencji

regulatorowych i detekcji czynników, które

z nimi oddziałują

• Geny reporterowe – to geny, których

ekspresję można łatwo wykryć,

wprowadzane metodami inżynierii

genetycznej do komórek lub organizmów

Przykłady genów reporterowych

Gen
reporterowy

Właściwości
systemu

Niedogodności

CAT (bakterie)

Nie występuje u
eukartiontów, tani

Wąski zakres
liniowości odpowiedzi

β-galaktozydaza
(bakterie)

Stabilny, odczyt
kolorymetryczny

Aktywność
endogenna

Lucyferaza (świetlik)

Nie występuje w
komórkach ssaków,
wysoka specyficzność

Wymaga substratu
(lucyferyny)

Alkaliczna fosfataza

(człowiek)

Białko wydzielane

przez łożysko, tania
reakcja
kolorymetryczna

Aktywność

endogenna w
niektórych komórkach

GFP
(meduza)

Autofluoryzujące
białko, nie występuje
u ssaków

Niska czułość

•Gen acetylotransferazy chloramfenikolu (CAT) jest genem
bakteryjnym.

•Funkcją białka kodowanego przez ten gen jest neutralizacja
antybiotyku – chloramfenikolu przez jego acetylację.

•Gen acetylotransferazy chloramfenikolu jest powszechnie
używanym w badaniach sekwencji promotorowych i regulujących
transkrypcję genem reporterowym.

•Konstrukt zawierający badaną sekwencję promotorową umieszcza
się przed genem CAT i wprowadza do komórek

•Aktywacja promotora w komórkach może być obserwowana jako
pojawienie się mRNA dla acetylotransferazy lub/i pojawienie się
produktu – enzymu katalizującego reakcję

Test acetylo transferazy

chloramfenikolu

CAT Assay - Chloramphenicol Acetyl

Transferase