Oznaczanie aktywności

wieloenzymowego układu

fotosyntetycznego

Chloroplasty

• Eukariotyczne organellum

komórkowe otoczone podwójną błoną
białkowo-lipidową,

• rodzaj plastydów,
• zawierają zielony barwnik – chlorofil-

zlokalizowany w granach,

• w ich wnętrzu przebiegają reakcje

składające się na proces fotosyntezy.

Fotosynteza

• proces anaboliczny,
• zależna od światła asymilacja

dwutlenku węgla i wody z
utworzeniem węglowodanów i tlenu
cząsteczkowego,

• zachodzą dwa rodzaje reakcji

świetlnych wynikające z aktywności
dwóch fotosystemów.

Fotosystem

• jest kompleksem barwnikowo-lipidowo-

białkowym absorbującym kwanty światła

• chlorofil występujący w centrum reakcji

PSI wykazuje maksimum absorbancji

światła przy 700nm, a chlorofil z

centrum reakcji PSII ma maksimum

absorbancji przy 680nm,

• te dwa fotosystemy łączy łańcuch

transportu elektronów.

• proces rozpoczyna się od fotosystemu II.

Pomiar aktywności

fotosystemów

• Aktywność obydwu układów mierzy

się stosując sztuczne donory i
akceptory elektronów,

• odpowiednio dostarczając dzięki

temu lub pobierając elektrony w
różnych miejscach łańcucha
fotosyntetycznego.

Pomiar aktywności PS II

• Produkt reakcji zachodzącej w PS II –

tlen,

• Aktywność = szybkość wydzielania

tlenu przez chloroplasty,

• Do pomiarów używamy elektrody

tlenowej Clarka.

Pomiar aktywności PS I

• Aktywność można oznaczać również

za pomocą elektrody Clarka stosując
sztuczne donory i akceptory
elektronów,

(zredukowana forma drugiego

akceptora elektronów ulegając
samoutlenieniu wytwarza rodnik
ponadtlenowy, co wymaga obecności
tlenu => jest to reakcja Mehlera)

Elektroda tlenowa Clarka

• Jest dość czuła, potrafi zmierzyć stężenie

tlenu, wynoszące nawet:0,1 mmol/l.

• Składa się z:
Katody– polaryzująca się, pomiarowa,
Anody – niepolaryzująca, elektroda

odniesienia.

• Obie elektrody zanurzone są w roztworze

elektrolitu (nasycony roztwór KCl) i
oddzielone od badanej zawiesiny błoną
teflonową.

• Prąd pomiędzy nimi płynie jedynie przez płyn

elektrodowy, a tlen dyfunduje przez błonę do

elektrolitu.

•  Sygnałem wyjściowym elektrody jest natężenie

prądu, które jest proporcjonalne do ciśnienia

parcjalnego tlenu lub stężenia w elektrolicie.

• W chwili doprowadzenia napięcia do elektrod w

roztworze następuje elektrolityczna redukcja

tlenu, początkowo do nadtlenku wodoru, a

następnie do jonu hydroksylowego. Źródłem

elektronów redukujących tlen jest utleniająca

się anoda.

Charakteryzacja układu

fotosyntetycznego

• Dzięki zastosowaniu szeregu

inhibitorów, np. DBMIB, kwas
tłuszczowy, hydroksyloamina

• Kontrola fotosyntetyczna = stosunek

szybkości transportu elektronów przed
dodaniem ADP i fosforanu do szybkości
transportu elektronów po ich dodaniu

• Jony amonowe rozprzęgają specyficznie

fosforylację fotosyntetyczną.

Wykonanie pomiarów

• Przyjmujemy następujące wartości

dotyczące nasycenia mieszanin tlenem:

100% - napowietrzona w temp.25 stopni

mieszanina rekacyjna

0% - mieszanina reakcyjna nasycona

azotem w temp. 25 stopni

Pomiary wykonujemy wyłączając źródło

światła po dodaniu zawiesiny
chloroplastów.

Pomiary wydzielania tlenu –

PS II

• Mieszanina nasycona azotem +

chloroplasty => otrzymać przebieg
prostoliniowy wydzielania tlenu

• Dodajemy DCMU – dalsze oznaczenia
• Dodajemy kwas linolenowy – dalsze

oznaczenia.

• Związki te działają jako inhibitory

fotosyntezy.

Pomiary pobierania tlenu

• Wykonujemy w celu oznaczenia

aktywności całego łańcucha
fotosyntetycznego.

• Natlenowana mieszanina reakcyjna +

chloroplasty:

• + metyloamina – przeprowadzić

oznaczenia

• + DBMIB – przeprowadzić oznaczenia
• -związki te są inhibitorami systemu.

Oznaczanie aktywności PS I

• Mieszanina reakcyjna (zawierająca

Tris, askorbinian sodu, TMPD, MV) +
DCMU + chloroplasty.

• Reakcję przeprowadzać aż do

wyczerpania się tlenu.

WYNIKI

1.

2.

3.

Układ pomiarowy

(fotosystem/donor/

akceptor/inhibitor)

Aktywność

%

Aktywność

%

Aktywność

%

PSII, H

2

O, fenylo-p-benzohinon

0,995

100%

2,82

100%

1,3

100%

PSII, H

2

O, fenylo-p-benzohinon

(przed dodaniem kwasu

linolenowego)

0,652

100%

2,19

100%

1,3

100%

PSII, H

2

O, fenylo-p-benzohinon,

kwas linolenowy 0.12 nM (do 20 s

po podaniu inhibitora)

0,413

63,34%

2,81

128,40%

0,56

56%

PSII, H

2

O, fenylo-p-benzohinon,

kwas linolenowy (po 20s od

dodania inhibitora)

0,413

63,34%

0,52

35,44%

0,56

56%

PSII, H

2

O, fenylo-p-benzohinon

DCMU

0,444

44,62%

Nie

wyszło

Nie

wyszło

0,51

61%

PSC, H

2

O, metylowiologen

0,297

100%

0,56

100%

-

-

PSC, H

2

O, metylowiologen,

metyloamina 3 mM

0,681

229,3%

2,02

362,28%

0,8

160%

PSC, H

2

O, metylowiologen,

DBMIB 8,3 µM

0,166

64,84%

0

0%

-

-

PSI, TMPD, metylowiologen

1,102

100%

4,13

100%

1,26

100%

Wyniki wykonywanych pomiarów przez 3 niezależne zespoły:

Oznaczanie aktywności PSII- pomiar

wydzielania tlenu

Fenylo-p-benzochinon – akceptor
elektronów

Oznaczanie aktywności PSII- pomiar

wydzielania tlenu

Na wykresie wyróżnić możemy dwa odcinki prostoliniowe –
reakcja w zależności od ilości donora elektronów przebiega z
różną szybkością.

Pierwszy odcinek prostoliniowy- początek reakcji- szybkość
reakcji wysoka ( 0.1183 mV/s)-dostępny donor.

Drugi odcinek prostoliniowy- szybkość reakcji (0.068 mV/s) –
szybkość reakcji niższa ponieważ mniejsza jest ilość donora
elektronów.

O

H

2

Donor
elektronów

Fenylo-p-benzochinon – akceptor elektronów

Oznaczanie aktywności PSII- pomiar

wydzielania tlenu w obecności DCMU (0.025

mM)

DCMU jest inhibitorem fotosystemu PSII. Wiąże się z plastochinonem
uniemożliwiając przepływ elektronów i przerywając ich transport w
łańcuchu fotosyntetycznym.

DCMU powoduje zwolnienie tempa wydzielania tlenu, a wraz ze wzrostem
stężenia tego inhibitora w mieszaninie reakcyjnej obserwujemy spadek
aktywności fotosystemu PSII.

Przy stężeniu DCMU ok. 0.1
mM

a

stężenie wydzielanego tlenu

wynosi 50 %.

Oznaczanie aktywności PSII- pomiar

wydzielania tlenu w obecności DCMU

Dodanie
chloroplastów

Na wykresie zobrazowano zmianę napięcia [mV] w czasie [s].
Wyróżnić można 4 odcinki prostoliniowe – 4 etapy reakcji.

• I etap – reakcja bez dodania DCMU- szybkość reakcji wysoka. Aktywność – 100%

•Etap II, III, IV – po kolejnych dawkach inhibitora- szybkość reakcji każdego z etapów
jest niższa od szybkości w etapie poprzedzającym – towarzyszy temu spadek
aktywności fotosystemu.

Oznaczanie aktywności PSII- pomiar

wydzielania tlenu w obecności kwasu

linolenowego (10mg/ml)

Kwas linolenowy rozprzęga transport protonów ( wnikając do
błon tylakoidów zaburza ich strukturę ).

Oznaczanie aktywności PSII- pomiar

wydzielania tlenu w obecności kwasu

linolenowego (10mg/ml)

•Na podstawie wykresu i wyników zespołu
drugiego możemy zauważyć, że w
pierwszych 20 sekundach po dodaniu kwasu
linolenowego szybkość reakcji jest wyższa
niż szybkość reakcji bez tego inhibitora
[ poczatkowo0.0919, po dodaniu kwasu –
0.118 mV/s].

• Taki wynik jest spowodowany faktem, że
tuż po podaniu kwasu linolenowego jeden z
enzymów kompleksu enzymatycznego
fotosystemu PSII zwiększa swoją aktywność
(by przeciwdziałać rozprzęganiu transportu
elektronów).

*Wyniki pozostałych zespołów mogą nie uwzględniać tego etapu, gdyż mógł być on
bardzo krótki i praktycznie nie zauważalny,

Oznaczanie aktywności PSII- pomiar

wydzielania tlenu w obecności kwasu

linolenowego (10mg/ml)

•

Po 20 sekundach od dodania do

mieszaniny kwasu linolenowego
obserwowany jest znaczny spadek
szybkości reakcji (do 0.02119 mV/s).
Aktywność fotosystemu spada, w
przypadku zespołu 2, do 35%. W
przypadku pozostałych zespołów spadek
ten nie jest tak znaczny, ale również
zauważalny (ok. 60%).

• Dłuższe działanie kwasu linolenowego /
większe stężenie, powoduje znaczące
uszkodzenie tylakoidów.

Oznaczanie aktywności PSII- pomiar

wydzielania tlenu w obecności kwasu

linolenowego (10mg/ml)

Oznaczanie aktywności całego łańcucha

fotosyntetycznego – pomiar pobierania tlenu

Metylowiologen- akceptor elektronów

Szybkość
pobierania tlenu
0.014 mV/s

Oznaczanie aktywności całego łańcucha

fotosyntetycznego – pomiar pobierania tlenu

w obecności metyloaminy ( 3mM)

Metyloamina jest stymulatorem- znosi gradient protonowy w
chloroplastach – jej dodanie powoduje wzrost szybkości
pobierania tlenu

•Dodanie metyloaminy do
mieszaniny reakcyjnej powoduje
ponad dwukrotny wzrost
aktywności łańcucha
fotosyntetycznego (229,3 ;
362,28%) i czterokrotny wzrost
szybkości pobierania tlenu ( z
0.014 do 0.0413 mV/s)

Oznaczanie aktywności całego łańcucha

fotosyntetycznego – pomiar pobierania tlenu

w obecności DBMIB (5mM)

DBMIB - inhibitor kompleksu cytochromów cyt.b

6

f

[ odpowiedzialnego za przenoszenie elektronów z PSII na PSII.

•Dodanie inhibitora powoduje znaczny
spadek aktywności całego łańcucha
fotosyntetycznego i spadek szybkości
pobierania tlenu ( z 0.014 do 0.0073
mV/s)

Oznaczanie aktywności PSI z DCMU

• Oznaczanie aktywności – do
momentu wyczerpania tlenu w
mieszaninie reakcyjnej.

•Wyznaczenie szybkości
pobierania tlenu przez układ w
obecności DCMU- inhibitora
fotosystemu PSII

Aktywność fotosystemu PSI jest wyższa od aktywności fotosystemu PSII.
Szybkość pobierania tlenu wynosi 0.0843, w przypadku całego łańcucha
fotosyntetycznego szybkość ta była wielokrotnie niższa- 0.014 mV/s.

TMPD- donor elektronów; metylowiologen- akceptor elektronów