Model kinetyki enzymów zaproponowany
przez Michaelisa i Menten (M-M)
(1913r)
k
1
k
2
Jak wpływa stężenie enzymów [E] na szybkość katalizy
enzymatycznej?
Definicja -
szybkość katalizy (V) to
przyrost ilości substratu w czasie
.
Wyrażany ją jako liczbię
moli produktu na 1 sekundę (mol
-1
x s
-1
). Przy stałym
stężeniu enzymu i niskich
stężeniach substratu [S]
V
rośnie proporcjonalnie do stężenia substratu. Przy
dużym [S] jest prawie niezależne od jego ilości. Model
M-M zakłada, iż w procesie tym istnieje stan
przejściowy/pośredni
ES
stanowiący
kompleks enzymu
i substratu
. Model ten w najprostszej postaci opisuje
proces katalizy enzymatycznej w następujący sposób.
E + S ES E + S
k
1
wyraża stałą szybkości tworzenia kompleksu ES,
k
2
określa stałą szybkości rozpadu ES na
E + S,
k
3
to stała szybkości
uwalniania produktów z ES.
k
3
Musimy znaleźć następujące wyrażenia, które opisują
związek między szybkością reakcji V z 1/ stężeniem
substratu
[S]; ...........................
..........2/ stężeniem enzymu [E]
.....................................3/ z szybkościami
poszczególnych etapów reakcji. Szybkość katalizy równa
się iloczynowi stałej k
3
i stężenia kompleksu ES
to V = k
3
x
[ES]
Szybkość tworzenia kompleksu ES to k
1
x
[E] [S];
Szybkość rozpadu ES to (k
2
+
k
3
)
x
[ES].
W stanie równowagi steady state kiedy stężenie
intermediatów nie zmienia się a zmienia się ilość
substratów i produktów szybkość tworzenia i rozpadu
kompleksu ES jest taka
sama. ...................................k
1
x
[E] [S] = (k
2
+ k
3
) x [ES] - przekształcamy równanie
względem [ES]
[ES] = [E] [S] / {(k
2
+ k
3
)/ k
1
}
Zastępujemy iloczyn (k
2
+ k
3
)/k
1
przez stałą
K
M
zwaną stałą Michaelisa
,
a więc
K
M
= (k
2
+ k
3
)/k
1
.
K
M
umieszczamy w
poprzednim równaniu, które przyjmuje postać:
[ES] = [E] [S] /
K
M
Licznik równania
-
Jeśli stężenie enzymu
jest dużo mniejsze od stężenia substratu to
stężenie nie związanego substratu
[S]
jest prawie
równe całkowitemu stężeniu substratu, podczas
gdy stężenie nie związanego enzymu
[E]
równa
się różnicy między całkowitym stężeniem enzymu
[ET]
i kompleksu ES
E = [ET] – [ES] Podstawiamy to wyrażenie
zamiast [E]
i otrzymujemy równanie [ES] = ([ET] – [ES]) /
[S] /
K
M
Rozwiązujemy go względem [ES]
i otrzymujemy: ES = [ET]
Lub:
[S]/K
M
1 + [S] /
K
M
ES = [ET]
Wyrażenie [ES] podstawiamy do równania V = k
3
x
[ES]
V = k
3
[ET]
Szybkość maksymalną reakcji
V
max
uzyskuje
reakcja wtedy gdy każda cząsteczka enzymu i
wszystkie miejsca aktywne są wysycane substratem
a wtedy [S] jest dużo większe od K
M
w takim razie
[S]/[S] + K
M
jest bliskie
1
.
Więc
V
max
= k
3
[ET] .
Podstawiając
V
max
do poprzedniego
równaniu otrzymujemy równanie Michaelisa-
Menten -
V = V
max
[S]/K
M
[S] / K
M
[S]
[S] /
K
M
[S]
[S] /
K
M
Równanie M-M opisując następujące parametry
kinetyczne enzymu wskazuje, że:
1.
Jeśli
stężenie substratu [S] jest znacznie mniejsze od K
M
to szybkość reakcji V = [S] V
max
/ K
M
co oznacza, że
szybkość reakcji jest proporcjonalna do stężenia
substratu.
2.
Przy dużych
stężeniach substratu większych od K
M
, V = V
max.
W
tym przypadku szybkość reakcji nie zależy już od
stężenia substratu ponieważ jest
maksymalna
.
3.
K
M
opisuje również szczególną sytuację, w której
[S] = K
M
wtedy szybkość działania enzymów [V] o
kinetyce M-M będzie równa
½ szybkości
maksymalnej V
max
!! Wynika to
z następującego rozumowania:
Jeśli
V = V
max
a
K
M
= [S]
to
V
max
więc
V= 1/2 V
max
[S]
[S] /
K
M
[S]
[S] /
[S]
Definicja:
Stała Michaelisa to takie stężenie substratu
przy którym enzym osiąga połowę szybkości
maksymalnej. Wyrażamy ją w
molach na dcm
3/
[mol/dcm
3
].
K
M
charakteryzuje specyficzność substratową a nie
powinowactwo enzymu do substratu i dla większości
enzymów zawiera się w przedziale 10
-1
do 10
-7
M.
Wartość K
M
zależy od
temperatury i stężenia jonów (siły jonowej).
W standardowych warunkach nie
opisuje jednak powinowactwa enzymu do substratu!!.
I.
K
M
oznacza stężenie substratu w którym połowa
miejsc
aktywnych jest obsadzona. Znając wartość tej
stałej możemy
obliczyć ułamek obsadzonych miejsc ƒ
ES
posługując
się
następującym wzorem:
ƒ
ES
= V/ V
max
=
Znaczenie wartości K
M
i V
max
[S]
[S] /
[S]
II. Z definicji K
M
wiąże się ze stałymi szybkości
reakcji ponieważ
K
M
=
k
2
+ k
3
/ k
1.
Jeśli jednak k
2
jest >>> k
3
to
dysocjacja
kompleksu ES do E + S jest szybsza od tworzenia
E + P możemy
więc powiedzieć, że K
M
= k
2
/k
1.
Oznacza to, że w
tych
warunkach
K
M
jest równe stałej dysocjacji
kompleksu ES
bowiem:
Jest więc miarą siły tworzenia kompleksu ES i
decyduje o
stabilności tego kompleksu.
K
ES
=[S][E]
[ES
]
=
k
2
/k
1
Duże K
M
oznacza więc słabe wiązanie, a małe silne
wiązanie substratu do enzymu. Może określić jego
powinowactwo do substratu tylko w takim
przypadku kiedy k
2
jest wielokrotnie większe od k
3
.
Liczba obrotów enzymu
Liczba obrotów enzymu
to liczba cząsteczek substratu
przekształcona w produkt reakcji w jednostce czasu w
warunkach pełnego wysycenia enzymu
. Jej wartość jest
równa stałej k
3
zgodnie z równaniem: V
max
=
k
3
[ET]. Jeśli stężenie miejsc aktywnych [ET] jest znane
to V
max
ujawnia liczbę obrotów enzymu.
Jak obliczamy stężenie miejsc
aktywnych?
Enzymy o kinetyce M-M mają jedno miejsce aktywne na
cząsteczkę
enzymu.
A/ Do tej analizy możemy stosować tylko jednorodny
preparat
enzymu.
B/ Musimy znać stężenie białka tego enzymu w
analizowanym
roztworze.
C/ Jego masę molowa (cząsteczkową).
Dzieląc ilość białka w preparacie przez masą
cząsteczkowa obliczymy ilość cząsteczek enzymu.
Znając liczbę cząsteczek w
mieszaninie reakcyjnej oraz ilość powstającego
produktu w jednostce czasu wyliczymy ile produktu
powstało z udziałem jednej cząsteczki enzymu w
ciągu sekundy.
Np. 10
-6
M anhydrazy węglanowej w warunkach
wysycenia substratem katalizuje syntezę 0,6M
H
2
CO
3
/sekundę oznacza to, że k
3
= 6 x 10
5
s
-1
. Jeden
cykl katalityczny przebiega w ciągu 1,7s.
Perfekcja kinetyczna – kryterium K
kat
/K
M
Jeśli stężenie substratu [S] jest wielokrotnie większe
od K
M
to szybkość reakcji jest równa k
3.
Jednak w
warunkach fizjologicznych enzymy nie są wysycone
substratem a stosunek [S]/K
M
= od 0,1 do 1,0.
Gdy
stężenie [S] jest znacznie mniejsze od
k
3
=
V
max
[ET
]
K
M
to szybkość reakcji jest wielokrotnie mniejsza od k
3
.
Jak możemy opisać kinetykę tych enzymów w takich
warunkach? Jakie liczby ją opiszą. Przypomnijmy
równania 1/ [ES] = [E] [S] / K
M
;
i 2/
V = k
3
x [ES]. Oba równania możemy połączyć
i otrzymamy
V= (k
3
/K
M
) [E][S],
a gdy [S] jest <<<K
M
to stężenie wolnego enzymu [E]
jest bliskie całkowitemu stężeniu enzymu [ET], więc
V = (k
3
/K
M
) [S] [ET]
Tak więc gdy [S] jest wielokrotnie mniejsze od K
M
szybkość reakcji zależy od wartości
k
3
/K
M
oraz od
[S]
!!
Co ogranicza tę szybkość?
Wiemy, że stosunek k
3
/K
M
zależy od k
1
, k
2
i k
3
bowiem
K
M
= (k
2
+ k
3
)/ k
1
więc po uwzględnieniu
tej zależności
otrzymujemy
k
3
/K
M
= k
3
k
1
/(k
2
+ k
3
)
Załóżmy, że k
3
jest znacznie większe od k
2
to wartość k
2
możemy pominąć i wtedy iloraz k
3
/K
M
zbliża się do
wartości k
1
.
To oznacza, że górna granica wartości k
3
/K
M
zbliża się do k
1.
A stała k
1
określa nam szybkość tworzenia
kompleksu ES. Jaką wartość może osiągnąć ta stała
szybkości? Nie może być ona większa niż kontrolowana
przez dyfuzje szybkość –częstotliwość z jaka spotykają
się enzym i substrat!!! Zakładając, że każde spotkanie
jest efektywne !!! Wartość ta wynosi 10
8
– 10
9
M
-1
s
-1
.
Ograniczenie to dotyczy wszystkich enzymów.
Kryterium K
kat
/K
M
Rozpatrzy co się dzieje jeśli, przeciwnie, substrat jest w
stężeniu, które wysyca całkowicie enzym o mechanizmie
reakcji bardziej złożonym niż ten który omawialiśmy. W
tym przypadku maksymalna szybkość enzymu oznaczona
jako k
kat
zależy nie tylko od k
3
lecz od innych stałych
szybkości. Dla tych enzymów odpowiednim parametrem
kinetycznym jest k
kat
/K
M.
Dla szczególnie perfekcyjnie i
szybko działających enzymów wartość ta wynosi 10
8
–
10
9
M
-1
s
-1
, a ich szybkość ogranicza tylko szybkość
efektywnych zderzeń. Dalszy wzrost szybkości enzymy
osiągają przez skrócenie czasu dyfuzji. Jak?
Document Outline