Barwienie rozmazu krwi
Często stosowane są barwniki takie jak Wrighta lub
Wrighta-Giemsy .
Są barwnikami polichromicznymi ponieważ zawierają dwie
składowe: eozynę i błękit metylenowy
Zawarty w nich metanol utrwala komórki i przykleja do
szkiełka.
Bufor ułatwia wybarwianie
Barwienie jest zależne od pH.
Błekit metylenowy ma zasadowe pH i wybarwia
kwaśne elementy komórki jak RNA i DNA.
Eozyna jest kwaśna i wybarwia zasadowe
komponenty komórek jak hemoglobinę czy
ziarnistości eozynofilowe.
Różnicowe liczenie krwinek
białych
Wykrywanie zmian w liczebności cyrkulujących
białych krwinek (WBC) . Ocena procentowości.
Niezbędne w ocenie infekcji, zatruć, leukemii, zakażeń
pasożytniczych, reakcji alergicznych i podczas
chemioterapii.
Normalna liczba białych krwinek:
neutrofile 60-70% (podwyższona w infekcjach
bakteryjnych)
limfocyty 20-25% (podwyższona w infekcjach
wirusowych)
monocyty 3 -- 8 % (podwyższona w
grzybiczych/wirusowych infekcjach )
eozynofile 2 -- 4 % (podwyższona w zakażeniach
pasożytniczych i w alergii)
bazofile <1% ( podwyższone w reakcjach alergicznych.)
Eozynofile
Neutrofile
Monocyty
Monocyty
mały
Średni
duży
Limfocyty
Dr Barbara
Dr Barbara
Szkudlińska
Szkudlińska
Chemotaksj
a
Fagocytoza
Test NBT
CHEMOTAKSJA
CHEMOTAKSJA
Ukierunkowany ruch komórek ( np.
granulocyty, monocyty, makrofagi )
stymulowany gradientem czynnika
chemotaktycznego.
CZYNNIKI CHEMOTAKTYCZNE
CZYNNIKI CHEMOTAKTYCZNE
Egzogenne
:
antygeny i metabolity bakterii ( f-
MLP, peptydoglikany, LPS), kazeina
Endogenne
:
- pochodne aktywacji dopełniacza - C3a i
C5a,
- Il8, RANTES, PAF i inne cytokiny
„
„
Agarozowa
Agarozowa
„
„
metoda
metoda
chemotaksji
chemotaksji
Schemat płytki
agarozowej z układem
wyciętych dołków
zawierających: I - czynnik
chemotaktyczny, II -
zawiesinę badanych
komórek, III - płyn
kontrolny.
B
A
I
II
III
I
II
III
Schemat pomiaru
chemotaksji ( A ) i
migracji spontanicznej
( B ).
Płytka z
chemotaks
ją. met.
agarozowa
STREFY CHEMOTAKSJI
STREFY CHEMOTAKSJI
- METODA
- METODA
AGAROZOWA
AGAROZOWA
POMIAR
POMIAR
CHEMOTAKS
CHEMOTAKS
JI
JI
Zawiesina
komórek
Roztwór czynnika
chemotaktyczneg
o
Filtr
miliporowy
Schemat komory do badania
chemotaksji wg Boydena
Komórki po
przejściu przez
filtr ( do
liczenia)
Kierunek
chemotaksji
KOMORA
KOMORA
BOYDENA
BOYDENA
Filtr po chemotaksji - met.
Filtr po chemotaksji - met.
Boydena
Boydena
Filtr po chemotaksji
Filtr po chemotaksji
(kontrola) - met. Boydena
(kontrola) - met. Boydena
ETAPY FAGOCYTOZY
ETAPY FAGOCYTOZY
Animation of Phagocytosis by Enhanced Attachment (Opsonization
Opsonizacja i fagocytoza
pseudopodia –
wypustki
błony
cytoplazmatyc
znej którymi
makrofag
wchłania
czerwoną
krwinkę
Wewnątrzkom
Wewnątrzkom
ó
ó
rkowe
rkowe
zabijanie i trawienie
zabijanie i trawienie
-
-
killing
killing
Niezależny od tlenu
ziarnistości lizosomalne
lizozym,
defensyny,
laktoferynę,
białka kationowe
enzymy:
kwaśna fosfataza,
peroksydaza,
zmiana Ph na kwaśne
Zależny od tlenu - Związany z
wytwarzaniem rodników tlenowych –
O
2-
, OH
.
, H
2
O
2
i NO.
oksydaza NADPH
Test NBT
W przebiegu pobudzenia fagocytów
procesami chemotaksji i fagocytozy ulega
aktywacji mechanizm wybuchu tlenowego,
(wybuch oddechowy) związany z
oksydazą
NADPH
W fagocytach wzrasta poziom nukleotydów
NADH i NADPH
.
Nukleotydy te wykazują zdolność redukcji
pochłoniętego przez komórki roztworu
błękitu nitrotetrazoliowego ( NBT) do
formazanu
.
Formazany
, związki nierozpuszczalne w
wodzie, odkładają się w cytoplazmie komórek
w postaci
ciemnoniebieskich złogów
.
Test NBT
PMNs od pacjenta zdrowego.
PMNs od pacjenta z
CGD
Defekty funkcjonalne
leukocytów
Defekty adherencji :
Defekt cząsteczek adhezyjnych LFA-1 i Mac-1
upośledza adhezję (LAD-1)
Brak sialyl-Lewis X, i defekty selektyny E- i P-
(LAD-2)
Defekty of chemotaksji/fagocytozy:
Defekt gromadzenia się mikrotubuli upośledza
poruszanie się i degranulację lizosomów. (Syndrom
Chediak-Higashi )
Fizjologicznie obniżona aktywność chemotaktyczna
neutrofilów występuje u noworodków i niemowląt
Defekt killingu
Nieaktywna oksydaza NADPH ( przewlekła choroba
ziarniniakowa)
Defe
Defe
kty funkcjonalne
kty funkcjonalne
leukocyt
leukocyt
ó
ó
w
w
Leukocyte Adhesion
Deficiencies
-zaburzenia interakcji
leukocyta z endotelium
naczyniowym
Defekt gromadzenia się
mikrotubuli upośledza
poruszanie się i degranulację
lizosomów. Defekty killingu i
chemotaksji
Zaburzenia killingu
zwiazane z defektem
oksydazy NADPH
Ocena komórkowych komponentów układu
immunologicznego człowieka
Limf.B
Limf.T
Fagocyty
Prawidło
wa liczba
(x10
9
/
litr
krwi)
Ocena
funkcji
in vivo
Ocena
funkcji
in vitro
Ocena humoralnych komponentów układu
immunologicznego człowieka
Immunoglobuliny
Dopełniac
z
Składni
k
Normalny
poziom u
dorosłych
