Metody hodowli i identyfikacji bakterii

Metody stosowane w

diagnostyce

mikrobiologicznej

metody mikroskopowe

metody izolacji na odpowiednich pożywkach

identyfikacja biochemiczna

( testy paskowe API 20 NE, API 20 E, IDE 32 STAPH, inne )

metody immunologiczne

genetyczne ( wykorzystywane coraz

częściej, wykorzystywane w metodach

badawczych )

metody biologiczne ( obecnie rzadko )

( --------

stosowane rutynowo w diagnostyce )

Identyfikacja biochemiczna

drobnoustrojów

Oparta jest na podstawie cech metabolicznych bakterii. Przy

określaniu właściwości biochemicznych wykorzystujemy różnice w

aktywności enzymatycznej pomiędzy gatunkami bakterii,

najczęściej poprzez wykrywanie końcowych produktów

metabolizmu wykrywamy jakie związki drobnoustrój rozkłada.

Identyfikację biochemiczną wykonuje się:

a) na podłożach diagnostycznych, które zawierają:

składniki odżywcze, substrat, w stosunku do którego badamy

               aktywność enzymatyczną, wskaźnik (np. błękit
bromotymolowy,
               czerwień fenolowa itp.), który zmieniając swe
zabarwienie
               informuje o zachodzących zmianach,
b) za pomocą tzw. szeregów biochemicznych,
c) za pomocą gotowych mikrotestów chromogennych
(np. Api STAPH, Api STREP, Api NE, Api E, Api A, ID 32E, ID 32
STAPH, ID 32GN itp.)

Identyfikacja

biochemiczna

testy paskowe API 20

NE, API 20 E, IDE 32

STAPH, inne

STAPH, inne
Testy te zawierają

zliofilizowane

substraty i wskaźniki

biochemiczne, do

których dodaje się

zawiesinę bakteryjną.

Punkty prób

dodatnich tworzą kod

cyfrowy

odpowiadający

konkretnym

bakteriom.

Właściwości danego organizmu

można badać tylko wtedy, gdy

uzyskuje się na podłożu czystą

hodowlę tzw.



MONOKULTURĘ

( wolną od innych szczepów bakteryjnych ).

W każdej metodzie hodowli ważna jest :

• izolacja czystych kultur

• wybór odpowiedniego podłoża

TECHNIKI POSIEWU

Posiewu materiałów oraz posiewu bakterii lub grzybów na

podłoża stałe dokonuje się przy użyciu ezy (platynowe, z

drutu Kanthalowego, plastykowe jednorazowego użytku).

Posiew murawowy

Posiew redukcyjny

Posiew redukcyjny

umożliwia uzyskanie

czystej kultury

bakterii. Wykonuje się

go na podłożu

agarowym na płytkach

Petriego.

Należy pamiętać, że

każdorazowo przed

rozsianiem materiału

opalamy ezę w

płomieniu palnika!!!

Posiew redukcyjny

Warunki hodowli

drobnoustrojów

tlenowe



bakterie psychrofilne - rozmnażają się w

temperaturze 0 - 20





bakterie mezofilne - wzrastają w zakresie

temperatur 20 - 45



C (optimum 35 - 37





bakterie termofilne - wzrastają w zakresie

temperatur 30 - 90



C (optimum 50 - 70



mikroaerofilne - eksykatory, cieplarki z

przepływem CO2

beztlenowe - anaerostaty, GasPak

tioglikolan sodowy

Cechy charakterystyczne

podłoża

Odpowiednia zawartość substancji

odżywczych

Odpowiednie pH ( większość bakterii wymaga

do wzrostu ok. 7 pH,

Vibrio cholerae

pH 8.2 ,

grzyby wymagają do wzrostu kwaśnego pH,

przy którym nie rosną bakterie )

Klarowność

Jałowość

Odpowiednia (optymalna) temperatura

inkubacji

Krzywa rozwoju populacji bakterii w podłożu

płynnym

Faza zastoju (lag faza): przez kilka pierwszych godzin od chwili posiewu

populacja bakterii nie rozwija się. W tym czasie następuje

dostosowanie aparatu enzymatycznego komórki do nowych warunków

środowiska. Komórki powiększają swoją objętość.

Faza wzrostu logarytmicznego (log faza): po kilku godzinach populacja

zaczyna się dynamicznie powiększać. Podziały przebiegają z

maksymalną możliwą częstością np. u

E. coli

co 25 minut. Liczba

bakterii wrasta logarytmicznie.

Faza stacjonarna: tempo podziałów stopniowo spada, coraz więcej

komórek obumiera wskutek nagromadzenia w podłożu szkodliwych

metabolitów i wyczerpywania się składników odżywczych. Liczba

bakterii ≈ const

Faza starzenia się (zaniku, inwolucji): podłoże staje się coraz uboższe w

składniki odżywcze i coraz bardziej zanieczyszczone metabolitami.

Czas generacji wydłuża się, obumieranie zaczyna przeważać nad

podziałami, liczba bakterii w podłożu wyraźnie spada. Komórki tracą

swe charakterystyczne właściwości.

Podział podłóż

ze względu na konsystencję

płynne ( bulion mięsny, bulion drożdżowy)

półpłynne ( 0,5 – 1% agaru - w takich

podłożach badamy ruchomość bakterii,

posiewa się przez nakłucie )

stałe ( 1,5 – 3% agaru, żelatyna, żel

krzemionkowy)



płytki Petri’ego



skosy

Podziały podłóż:

ze względu na zawartość substancji

syntetyczne - znamy skład

chemiczny jakościowy i ilościowy

półsyntetyczne - znamy tylko skład

związków nieorganicznych

naturalne - skład ilościowy i

jakościowy znamy w przybliżeniu,

składniki pochodzenia naturalnego

np. mleko, krew

Podział podłóż

ze względu na ilość i jakość składników odżywczych

PROSTE

( podstawowe) -

woda

peptonowa, bulion, agar

- rosną na

nich organizmy o niskich wymaganiach

odżywczych

ZŁOŻONE

(

wzbogacone

)

- agar z

krwią

(5% krew barania)

– rosną

organizmy o wysokich wymaganiach

odżywczych

- pożywka Muellera-Hintona

(do

antybiogramów)

Podział podłóż

ze względu na ilość i jakość składników odżywczych

WYBIÓRCZO-NAMNAŻAJĄCE

(

bulion z żółcią,

podłoże SS )

Rosną na nich tylko wybrane bakterie, podstawą

tych pożywek są podłoża proste lub wzbogacone

przyspieszające wzrost jednych bakterii, a

hamujące innych np. bulion z żółcią ( dla

Salmonella), podłoże SS

( dla Shigella, Salmonella ) sole żółciowe hamują

wzrost E. coli i bakterii G (+) – kolonie przejrzyste,

bezbarwne, gładkie.

WYBIÓRCZO-RÓŻNICUJĄCE

(

poż. Chapmana,

poż,. Löwensteina i Jensena

)

Rosną na nich wybrane bakterie i są one

różnicowane na drodze właściwości biochemicznych

Pożywka Chapmana

dla gronkowców

zwiększona zawartość 7.5% NaCl hamuje

wzrost większości innych drobnoustrojów

czynnikiem różnicującym jest mannitol



Staphylococcus aureus rozkłada mannitol i zakwasza środowisko -

duże kolonie otoczone żółtą strefą.



Staphylococcus epidermidis małe kolonie bez żółtego zabarwienia.

Podłoże McConkeya

dla pałeczek G (-) z rodziny

Enterobacteriaceae – podłoże

zawiera fiolet krystaliczny,

który hamuje wzrost bakterii G

(+), rosną tylko pałeczki G(-).

Czynnikiem różnicującym jest

laktoza – bakterie które

rozkładają laktozę ( większość

szczepów E. coli ) dają kolonie

różowe, laktozo (-) kolonie

przezroczyste. Pałeczki, które

rozkładają dezoksycholan sodu

dają wokół kolonii strefę

wytrąconego kw.

dezoksycholowego.

Podłoże dla enterokoków

z azydkiem sodu – czynnik selekcyjny

rosną tylko paciorkowce kałowe

( Enterococcus faecalis , E. faecium ).

Podłoże zawiera

eskulinę

, która

rozkładana przez enterokoki i

paciorkowce gr. D daje zaczernienie

podłoża.

Sabourauda

wybiórcze dla

grzybów

zawiera antybiotyki

hamujące wzrost

bakterii, pH podłoża

kwaśne – hamuje

wzrost bakterii.

PODŁOŻA SPECJALNE

hodowla bakterii o wysokich wymaganiach

wzrostowych, rosną bakterie wybredne,

podłoża te zawierają czynniki wzrostowe



Agar czekoladowy

dla Haemophilus i

Neisseria, podłoże to tworzy się przez podgrzanie

agaru z krwią co rozkłada krwinki, uwalniając

czynniki wzrostowe dla bakterii.



Podłoże Loefflera

dla Corynebacterium zawiera

ściętą surowice końską, wylewane w skosach do

diagnostyki błonicy.



Podłoże Löwensteina i Jensena

dla wzrostu

prątków gruźlicy ( zieleń malachitowa – hamuje

wzrost innych bakterii ).



Podłoże z tioglikolanem sodowym

( dla

beztlenowców –

Clostridium

)

TRANSPORTOWE

( zawierają składniki odżywcze pozwalające na przeżycie

bakterii)

TRANSPORTOWO – NAMNAŻJĄCE

( zawierają taki skład chemiczny, który dodatkowo

umożliwia namnażanie się bakterii ).

Document Outline