Badania mikrobiologiczne gleby dla celów sanitarnych

Temat 9-10: Analiza mikrobiologiczna gleby

Aby zaliczyć to ćwiczenie student powinien:

Wiedzieć, co to jest gleba i co rozumiemy pod pojęciem edafonu glebowego,

Znać, jakie mikroorganizmy występują w glebie i czym się charakteryzują,

Umieć scharakteryzować mikroorganizmy glebowe i omówić ich rolę w glebie,

Znać rolę flory i fauny glebowej,

Umieć scharakteryzować mikroflorę autochtoniczną i zymogeniczną gleby.

Znać pojęcia: edafon, rizosfera, patogen, fitoedafon, zooedafon, helminty oraz
pozostałe wymienione w punkcie 5.3.

Znać zakres sanitarnej analizy mikrobiologicznej gleby

Umieć oznaczyć liczebność w glebie bakterii, grzybów oraz jaj robaków
pasożytniczych.

1.Gleba - to powierzchniowa warstwa litosfery ziemskiej, utworzona z wietrzejącej skały,
przekształconej w specyficzny sposób przez organizmy żywe. Gleba jest złożonym utworem
umożliwiającym funkcjonowanie ekosystemów glebowych. W skład gleby wchodzą cząstki
stałe mineralne i organiczne, powietrze i roztwór glebowy oraz bytujące w niej organizmy
żywe - edafon. Proporcje poszczególnych składników w glebie utrzymują się mniej więcej na
tym samym poziomie właściwym dla danej gleby.

2. Edafon glebowy

 Organizmy zasiedlające glebę tworzą złożony zespół o bardzo dużej liczebności

zwany edafonem. Są to mikroorganizmy, grzyby, jednokomórkowce roślinne i
zwierzęce, rośliny naczyniowe oraz bezkręgowce bytujące w przypowierzchniowej
warstwie gleby.

 Edafon może stanowić od 1 do 10% suchej masy substancji organicznej gleby.

Ze względu na rozmiar organizmy żyjące w glebie można zaliczyć do trzech grup:
- Mikrobiota (niedostrzegalne gołym okiem)- wirusy, bakterie, grzyby, pierwotniaki, glony
- Mezobiota (0,2-2 mm) - wazonkowce, nicienie, ślimaki, owady bezskrzydłe, wije, roztocza i
inne, małe rośliny,
- Makrobiota (>2 mm) - dżdżownice, krety, gryzonie np. myszy polne, większe owady,
korzenie dużych roślin i drzew.

3. Charakterystyka mikroorganizmów glebowych.

Wirusy

 Wirusy prowadzą wyłącznie pasożytniczy tryb życia – reprodukują się w komórkach

bakterii, roślin, zwierząt i człowieka.

 W środowisku glebowym najważniejszą rolę odgrywają wirusy bakterii – bakteriofagi,
 Fagi są jednym z elementów nisz ekologicznych ograniczającym nadmierny rozwój

bakterii,

 Rola fagów w środowisku glebowym polega na ich zdolności niszczenia niektórych

populacji bakterii i w związku z tym - prowadzenia ich selekcji, zarówno negatywnej,
jak i pozytywnej. Przykładem negatywnego ich działania są fagi atakujące bakterie

brodawkowe z rodzaju Rhizobium będące przyczyna spadku plonów roślin
motylkowych

Bakterie

 Bakterie stanowią podstawową masę mikroorganizmów glebowych. Charakteryzują

się one wysoką aktywnością metaboliczną.

 Większość bakterii glebowych odznacza się właściwością przylegania (adhezji) do

powierzchni cząstek mineralnych i koloidów glebowych.

 Szczególnie duże ilości bakterii gromadzą się w pobliżu resztek tkanek roślinnych i

zwierzęcych oraz w odchodach zwierząt dostających się do gleby. Środowiskiem
specjalnie sprzyjającym rozwojowi bakterii są korzenie roślin i ich inne podziemne
części.

 Bakterie glebowe można podzielić na dwie grupy: takie, które występują w glebie

zawsze, niezależnie od jej rodzaju i żyzności (autochtoniczne) oraz takie, które
rozwijają się w niej masowo po wprowadzeniu do gleby dużej ilości materii
organicznej (zymogeniczne).

 Wśród licznych bakterii glebowych ilościowo dominują promieniowce oraz

maczugowce z rodzaju Arthrobacter

Grzyby

 Grzyby należą do organizmów eukariotycznych. Są bezwzględnymi

chemoorganotrofami, większość z nich to tlenowce lub grzyby fermentacyjne. Energię
i węgiel do budowy własnych komórek czerpią z rozkładu substancji organicznej. Nie
posiadają chlorofilu. W przeciwieństwie do bakterii, ściana komórkowa grzybów
zawiera chitynę, glukan i inne polisacharydy.

 Bytują one zwykle w powierzchniowych warstwach gleby; można je także spotkać na

głębokości do ok. 1 m.

 Wchodzą w symbiotyczne zależności z glonami, owadami, i roślinami wyższymi.

Wiele gatunków grzybów jest patogennych dla człowieka, roślin i zwierząt.

 Ich formy wegetatywne tworzą nitkowate strzępki, mniej lub bardziej rozgałęzione,

zwykle wielokomórkowe, których gęste sploty formują grzybnię lub plechę.
Poszczególne komórki mają wielkość ok. 10 m.

 Do najpospolitszych grzybów glebowych należą rodzaje:Penicillium, Aspergillus,

Trichoderma, Verticillium, Fusarium, Rhizopus, Mucor, Zygorhynchus, Chaetomium.

 Grzyby rozwijają się silnie w glebach kwaśnych i wpływają istotnie na zmiany

odczynu gleby.

Rola bakterii i grzybów

 Są współtwórcami struktury gleby – tworzą próchnicę - najważniejszy koloid

glebowy, wpływający w zasadniczy sposób na jej strukturę, właściwości sorpcyjne,
zasobność w składniki organiczne.

 Wpływają w decydujący sposób na powstawanie gruzełkowatej, gąbczastej struktury

gleby przez wytwarzanie śluzów otoczkowych oraz, w przypadku bakterii
nitkowatych i grzybów, przez formę swego wzrostu.

Flora glebowa (fitoedafon)
Fitoedafon stanowią głównie glony, oraz w mniejszym stopniu rośliny wyższe.
Glony stanowią główny składnik fitoedafonu. Najliczniej występują na powierzchni gleby; do
głębszych warstw dostają się na skutek jej uprawy, przesiąkania wody, działalności zwierząt i

zdolności migracji. Wyróżniamy zbiorowiska glonów żyjących na powierzchni gleby –
epifitoedafon oraz w głębszych jej warstwach - endofitoedafon

Fauna glebowa

Mikrofauna  glebowa  reprezentowana  jest  przez  pierwotniaki  (Protozoa).  Odżywiają  się  one
głównie bakteriami, ich rola polega na selekcji i odmładzaniu populacji bakterii glebowych.
Dominują  wśród  nich  korzenionóżki  (ameby)  i  wiciowce.  Mezofaunę  reprezentują  nicienie,
wazonkowce,  ślimaki,  owady,  wije,  roztocza  i  inne.  Odżywiają  się  one  martwą  materią
organiczną przyczyniając się do tworzenia próchnicy. Spośród makrofauny pewne znaczenie
mają  dżdżownice,  krety,  gryzonie,  które  rozdrabniają  materiał  glebowy  i  przenoszą  go  na
znaczną  głębokość.  Najważniejszą  rolę  wśród  bezkręgowców  odgrywają  w  glebie
dżdżownice, które odżywiają się martwą materią organiczną, pobierając ją wraz z mineralną
częścią gleby. Niestrawione resztki zmieszane z glebą mineralną i metabolitami wydalają w
postaci  grudek  (koprolitów),  przyczyniając  się  w  ten  sposób  do  tworzenia  korzystnej
gruzełkowatej  struktury  gleby  i  do  jej  spulchniania.  W  ciągu  roku  dżdżownice  mogą  na
hektarze  przepuszczać  przez  swój  przewód  pokarmowy  około  7  tys.  kg  gleby.  Dzięki
ruchliwości zwierząt gleba ulega ciągłemu mechanicznemu mieszaniu, co powoduje lepsze jej
napowietrzenie, natlenienie i przepływ wody.

4. Podział mikroflory glebowej ze względu na pochodzenie

Mikroflora autochtoniczna
Mikroflorę gleby dzieli się na autochtoniczną i zymogeniczną. Drobnoustroje autochtoniczne
czerpią  energię  z  rozkładu  materii  organicznej  powodując  jej  mineralizację.
Przedstawicielami tej grupy w glebie są najczęściej drobnoustroje, dla których źródło węgla i
energii  stanowią  substancje  humusowe,  tj.  związki  powstałe  z  rozkładu  i  przetworzenia
materii  organicznej  pochodzenia  roślinnego  i  zwierzęcego.  Przedstawicielami  tej  grupy  są
najczęściej  tlenowe  nieprzetrwalnikujące  bakterie  z  rodzaju  Arthrobacter  oraz  prątki  z
rodzaju  Mycobacterium.  Stałymi  mieszkańcami  gleby  są  także  promieniowce  z  rodzaju
Streptomyces i Nocardia oraz bakterie śluzowe (Myxobacteriales). Dla gleby, choć nie tylko
dla  niej,  charakterystyczne  są  bakterie  wiążące  azot  atmosferyczny,  bakterie  nitryfikacyjne.
Pospolite  są  także  tlenowe  laseczki  przetrwalnikujące  z  rodzaju  Bacillus  i  beztlenowe  z
rodzaju Clostridium.

Mikroflora zymogeniczna
Drobnoustroje  zymogeniczne  wprowadzane  są  do  gleb  okresowo.  Pochodzą  one  z
wprowadzanych do gleb ścieków, odpadów komunalnych i przemysłowych oraz z odpadów
powstających  w  hodowli  zwierząt  (np.obornik  i  gnojówka),  Są  to  organizmy  o  dużych
wymaganiach  odżywczych,  których  rozwój  uzależniony  jest  od  dopływu  świeżej,  łatwo
przyswajalnej  materii  organicznej.  Bakterie  zymogeniczne  bytujące  w  glebie  to  głównie
gramujemne  pałeczki  z  rodziny  Enterobacteriaceae  oraz  z  rodzaju  Pseudomonas,
Achromobacter, Flavobacterium.
W  glebie  zanieczyszczonej  odchodami  czy  szczątkami  zwierząt  i  roślin  mogą  występować
drobnoustroje chorobotwórcze (patogenne). Spośród bakterii szczególnie niebezpieczne dla
człowieka są pałeczki duru brzusznego z rodzaju Salmonella i pałeczki czerwonki – Shigella.,
beztlenowe  laseczki  wywołujące  tężec  –  Clostridium  tetani,  zgorzel  gazową  –  Clostridium
perfringens,  zatrucia  pokarmowe  –  Clostridium  botulinum  oraz  tlenowe  laseczki  wąglika  –
Bacillus anthracis, a także prątki – Mycobacterium tuberculosis.

Ponadto  do  bakterii  chorobotwórczych  występujących  w  glebie  zalicza  się  niektóre
promieniowce  wywołujące  tzw.  promienicę.  Grzyby  są  przyczyną  zakażeń  skóry  i  tkanek
wewnętrznych, a organizmy zwierzęce jak pierwotniaki i robaki – chorób głównie przewodu
pokarmowego.  Szczególną  uwagę  należy  zwrócić  na  możliwość  występowania  w  glebie  jaj
robaków pasożytniczych np. glisty ludzkiej. Jej jaja przechodzą w glebie okres dojrzewania i
wykazują  dużą  odporność  na  działanie  czynników  zewnętrznych.  Podobnie  jak  endospory
bakterii, zarodniki grzybów i cysty pierwotniaków, mogą przez długi okres czasu bytować w
glebie i stanowić zagrożenie dla człowieka.

5. Ocena jakości gleby za pomocą analizy mikrobiologiczno-helmintologicznej.

5.1. Analizę stosuje się do oceny:
-  metod unieszkodliwiania odpadków miejskich,
-  jakości osadów ściekowych, odpadów i nawozów wykorzystywanych do celów

rolniczych,

- stanu sanitarnego gleby przy planowaniu i budowie osiedli mieszkaniowych , żłobków

przedszkoli, obiektów dla służby zdrowia i przemysłu spożywczego oraz rekreacyjnych,
jak również do oceny stanu sanitarnego gleby na cele rolnicze.

Ponadto uzyskane wyniki mogą być przydatne do wyjaśnienia dróg zakażenia i określenia
czasu przeżywalności mikroorganizmów chorobotwórczych w glebie. Są one również istotne
z punktu widzenia możliwości zakażenia poprzez glebę wód gruntowych i
powierzchniowych.

5.2. Zakres analizy mikrobiologicznej gleby pod względem sanitarnym powinien
obejmować:

Oznaczenie obecności w glebie bakterii chorobotwórczych z rodzaju Salmonella. W
glebie przeznaczonej do celów rolniczych nie mogą się znajdować bakterie należących
do tego rodzaju.

Badania helmintologiczne polegające na określeniu liczby żywych jaj robaków

jelitowych: glisty ludzkiej (Ascaris lumbricoides), glisty psiej (Toxocara sp.),
włosogłówki (Trichuris trichiura), określeniu stadium ich rozwoju oraz stopnia
odporności na różne warunki mikroklimatyczne.

Stopień zanieczyszczenia gleby jajami robaków (helmintów) określa się w odniesieniu do
100 g gleby, uznając glebę za:

nie zanieczyszczoną

- nie wykrycie jaj,

słabo zanieczyszczoną

- wykrycie pojedynczych jaj (1-3),

średnio zanieczyszczoną

- wykrycie do 10 jaj,

silnie zanieczyszczoną

- wykrycie 10 jaj i więcej

Ponadto badania uzupełnić można o oznaczenia:

- ogólnej liczby bakterii – wykonywane na podłożu agarowym, temperatura - 28

czas inkubacji –48 h,

- bakterii przetrwalnikujących (sporowych) – podłoże agarowe, temperatura 28

czas inkubacji–48 h,

- bakterii termofilnych – podłoże agarowe, temperatura 55

C, czas inkubacji–24 h.

- liczebności bakterii wskaźnikowych:

 pałeczek grupy coli,
 pałeczek grupy coli typu fekalnego (termotolerancyjnych), głównie

pałeczki okrężnicy (Escherichia coli),

 laseczek Clostridium perfringens,

5.3. Określenia stosowane w analizie mikrobiologiczno-helmintologicznej gleby:

- Miano – najmniejsza ilość badanej gleby wyrażona w gramach, w której stwierdza się

jeszcze obecność badanych bakterii.

- Bakterie grupy coli – Gram-ujemne pałeczki niewytwarzające przetrwalników,

rozwijające się w warunkach względnie beztlenowych, mające zdolność fermentowania
laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu w ciągu 48 h hodowania w temperaturze 35-37

Należą one do rodzaju Escherichia, Citrobacter i Enterobacter w obrębie rodziny
Enterobacteriaceae.

- Bakterie coli typu fekalnego (termotolerancyjne) pałeczki okrężnicy (Escherichia

coli) – są to pałeczki z grupy coli, które poza wszystkimi właściwościami tej grupy
(pałeczki Gram-ujemne, oksydazoujemne, niewytwarzające przetrwalników, względnie
beztlenowe, fermentujące laktozę z wytworzeniem kwasu i gazu w temperaturze 37

C w

ciągu 48 h oraz dające charakterystyczne kolonie na pożywce Endo) mają ponadto
zdolność wzrostu oraz przeprowadzania niektórych procesów biochemicznych, a w
szczególności fermentowania laktozy z wytworzeniem kwasu i gazu również w
temperaturze 44

- Bakterie Clostridium perfringens – są to nieruchliwe, beztlenowe laseczki Gram-

dodatnie wytwarzające otoczki i wykazujące zdolność do fermentacji glukozy, laktozy,
rozkładu żelatyny, a także redukcji siarczynów do H

- Bakterie z rodzaju Salmonella – chorobotwórcze pałeczki przewodu pokarmowego.

Wiele gatunków bakterii tego samego rodzaju wywołuje salmonellozy, czyli zatrucia
pokarmowe. Salmonella typhi wywołuje chorobę zwaną durem brzusznym.

- Bakterie wytwarzające przetrwalniki (bakterie sporowe) – Gram-dodatnie laseczki

(tlenowe i beztlenowe) wytwarzające przetrwalniki (zwane również endosporami).
Należą głównie do rodzaju Bacillus i Clostridium.

- Bakterie termofilne – to bakterie rozwijające się w wyższych temperaturach, 45-60

(optimum – 55

C), głównie w oborniku i kompoście, stosowanych do nawożenia i mogą

być wskaźnikiem ich obecności w glebach uprawnych.

- „Ogólna” liczba bakterii – to wskaźnik zawartości związków organicznych w glebie.

 W końcowym etapie procesu mineralizacji, w miarę wyczerpywania się łatwo

rozkładalnych źródeł pokarmowych wzrasta ilość spor bakteryjnych Stosunek ogólnej
liczby bakterii do liczby bakterii sporowych – świadczy o stopniu rozkładu w glebie
związków organicznych.

- Badania helmintologiczne – służą wykrywaniu robaków jelitowych w glebie, a głównie

ich jaj (tzw. jaj „geohelmintów”):

  glisty ludzkiej (Ascaris lumbricoides),
  glisty psiej (Toxocara sp.),
  włosogłówki (Trichuris trichiura).

- Stadium tworzenia się larwy w jaju i okresy zdolności życiowych robaków

(helmintów) w glebie, mogą być użyte do oceny, od jak dawna gleba jest
zanieczyszczona.

CZĘŚĆ PRAKTYCZNA

Analiza mikrobiologiczno-helmintologiczna gleby

Pobieranie próbek do badań:

1) Przy wyborze miejsca pobrania próbek gleby konieczne jest posiadanie danych

charakteryzujących:

-  strukturę gleby,
-  sposoby nawożenia,
-  pokrycie roślinne,
-  warunki klimatyczne,
-  należy uwzględnić również:

  wielkość badanej powierzchni gleby,
  umiejscowienie na niej źródeł zanieczyszczenia,
  obecność lub brak kanalizacji.

2) Słoje zawierające próbki gleby należy zamknąć korkami z waty i zaopatrzyć w

etykiety uwzględniające:

 datę i miejsce pobrania próbki,
 nazwisko pobierającego.

Przechowywanie i przesyłanie próbek:

Badanie bakteriologiczne gleby należy wykonać w dniu pobierania próbek. W razie

konieczności ich przechowywania oraz podczas transportu do laboratorium należy umieścić je
w temperaturze ok. 4

C na okres nie dłuższy niż 24 h.

Przygotowanie próbki do badań:

- Objętość posiewanej próbki uzależniona jest od jej rodzaju i stopnia zanieczyszczenia

oraz celu badania i wymagań sanitarnych.

- Przygotowane rozcieńczenia próbek mogą być przetrzymywane nie dłużej niż 30 min.

Przed posiewem należy:
- Sprawdzić probówki z pożywką Kesslera i odrzucić te, w których stwierdza się obecność

pęcherzyka powietrza w probówce Durhama.

- Wszystkie naczynia z pożywkami należy odpowiednio oznakować podając:

  numer próbki,
  datę
  i ewentualnie posiewaną objętość próbki.

- Przy posiewie próbki, jak i przy jej rozcieńczeniu, należy zachować warunki jałowości.

Zadanie 1. Badanie „ogólnej” liczby bakterii saprofitycznych, przetrwalnikujących
   oraz termofilnych
   Badanie przeprowadza się metodą płytkową Kocha stosując posiew wgłębny próbek
  na podłoże agarowe odżywcze. Badania obejmują określenie:

a) „ogólnej” liczby bakterii na podłożu agarowym odżywczym – zwykłym, w

temperaturze - 28

C w czasie inkubacji – 48±2 h,

b) liczby bakterii termofilnych – na podłożu agarowym odżywczym – 3 %, w

temperaturze 55

C, czas inkubacji–24±2 h.

c) liczby bakterii wytwarzających przetrwalniki (sporowych) – na podłożu agarowym

odżywczym – zwykłym, w temperaturze 28

C, czas inkubacji–48±2 h,

- w celu usunięcia niesporowej flory bakteryjnej, rozcieńczenia gleby przed

posiewem należy ogrzewać na łaźni wodnej w ciągu 15 minut w temperaturze
80

 Do posiewu należy użyć po 1 cm

zawiesiny z następujących rozcieńczeń:

- gleba piaszczysta – 10

-1

–10

-3

- gleba ogrodowa oraz kompost z odpadków miejskich: 10

-4

– 10

-6

 Po okresie inkubacji należy policzyć ilość wyrosłych kolonii. Do obliczenia liczby

kolonii wybrać płytki, na których wyrosło 30-300 kolonii.

 Równolegle oznaczyć suchą masę 100 g próbki gleby uprzednio wysuszonej w

temperaturze 105

C do uzyskania stałej wagi.

 Ostateczny wynik badania podaje się jako liczbę bakterii występującą w 1 g sm

gleby w stosunku do „ogólnej” liczby bakterii. Należy też podać procentową
zawartość bakterii sporowych..

Zadanie 2. Wykrywanie bakterii grupy coli i bakterii coli typu kałowego (Escherichia
  coli)
   Bakterie wykrywa się metodą fermentacyjną probówkową, opartą na zdolności tych
bakterii do fermentowania laktozy z wytworzeniem w podłożu kwasu oraz widocznego
gazu.

a) Oznaczenia bakterii grupy coli przeprowadza się w 3 etapach:



Etap I - Badanie wstępne - polega na posiewie (wprowadzeniu)
odpowiednich objętości roztworu glebowego do podłoża płynnego
Kesslera-Swenartona i inkubacji w temperaturze 37

C przez 24-48 h.

Za wynik dodatni badania wstępnego przyjmuje się:
- obecność każdej objętości gazu w probówce Durhama, lub wystąpienie

pęcherzyków gazu w całej objętości pożywki przy lekkim
wstrząśnięciu, przy jednoczesnym zmętnieniu podłoża i jego
zakwaszeniu (zmiana barwy z granatowej na żółtą o różnym stopniu
intensywności).

Powyższe zmiany mogą wystąpić po pierwszej lub drugiej dobie
hodowli.

Wyniki należy odczytywać po raz pierwszy bezwzględnie po 18-24 h.

Przy braku uprzednio podanych zmian po 24 h hodowle inkubuje się
dalej i ponownie odczytuje wynik po 48 h.

Za wynik ujemny badania wstępnego przyjmuje się:
- brak gazu i zakwaszenia po 48 h inkubacji.
Za wynik wątpliwy badania wstępnego przyjmuje się:
- pojawienie się bardzo małej ilości gazu przy jednoczesnym bardzo

słabym zakwaszeniu lub braku zakwaszenia, szczególnie po 48 h.

Hodowle uznane za wątpliwe po 24 h inkubacji poddaje się badaniu
potwierdzającemu już po tym okresie, a następnie inkubuje dalej do
48h.

W przypadku uzyskania wyniku dodatniego badania potwierdzającego
z dwudziestogodzinnej hodowli, nie wykonuje się badania
potwierdzającego po raz drugi po 48 h.



Etap II – Badanie potwierdzające – należy wykonać w celu potwierdzenia
obecności bakterii grupy coli, w zasadzie ze wszystkich dodatnich i
wątpliwych hodowli badania wstępnego uzyskanych po 24 lub 48 h.

Potwierdzenie hodowli dodatnich uzasadnia się koniecznością wykluczenia
tzw. wyników dodatnich fałszywych. Badania potwierdzające obecność
bakterii grupy coli wykonuje się na pożywce Endo metodą posiewu
powierzchniowego.
Badanie potwierdzające wykonuje się zgodnie z metodyka stosowaną w
badaniu mikrobiologicznym wody dla celów sanitarnych.



Etap III – Badanie uzupełniające – jest to dalszy etap badania
potwierdzającego i stosuje się je w przypadku, gdy na pożywce Endo
wyrosną nietypowe bakterie, podejrzewane o przynależność do bakterii
grupy coli.
Badanie uzupełniające wykonuje się zgodnie z metodyka stosowaną w
badaniu mikrobiologicznym wody dla celów sanitarnych.

 W zależności od rodzaju próbki stosuje się następujący system posiewów:

- gleba piaszczysta – 10 cm

z rozcieńczenia 10

-1

czyli 10 x 0,1 g – co jest

równoważne 1 g gleby,

- gleba ogrodowa i kompost z odpadków miejskich:

– 10 cm

z rozcieńczenia 10

-1

, czyli 10 x 0,1 g – co jest

równoważne 1 g gleby,

– 1 cm

z rozcieńczenia 10

-1

-10

-6

, czyli 1 x 0,1 – 0,000001 g.

Posiewy 10 cm

próbki rozcieńczonej 10

-1

należy wykonać na podłoże o stężeniu

podwójnym, a posiewy 1 cm

próbek z rozcieńczeń 10

-1

– 10

-6

na podłoże o

stężeniu normalnym.

 Ostateczny wynik badania podaje się jako miano bakterii grupy coli (miano coli).

b) Oznaczenia bakterii coli typu kałowego (termotolerancyjnych), pałeczki

okrężnicy (Escherichia coli) - przeprowadza się w 2 etapach:



Etap I - Badanie wstępne - polega na posiewie (wprowadzeniu)
odpowiednich objętości roztworu glebowego do podłoża płynnego
Kesslera-Swenartona i inkubacji w temperaturze 37

C przez 24-48 h (tak

jak w etapie I przy oznaczaniu bakterii grupy coli). Badanie wstępne
wykonuje się zgodnie z metodyka stosowaną w badaniu
mikrobiologicznym wody dla celów sanitarnych.



Etap II – Badanie potwierdzające – ma na celu stwierdzenie, czy bakterie
fermentujące laktozę w badaniu wstępnym należą do grupy coli typu
kałowego. Badanie potwierdzające wykonuje się zgodnie z metodyką
stosowaną w badaniu mikrobiologicznym wody dla celów sanitarnych.



W przypadku konieczności lub potrzeby zidentyfikowania bakterii jako
Escherichia coli, należy wykonać dodatkowo badania:
- według szeregu IMViC,
- lub zastosować szybki test w temperaturze 44

Identyfikowanie bakterii jako Escherichia coli, wykonuje się zgodnie z
metodyką stosowaną w badaniu mikrobiologicznym wody dla celów
sanitarnych.

 Ostateczny wynik badania podaje się jako miano bakterii coli typu kałowego

(miano E. coli).

Zadanie 3. Wykrywanie bakterii Clostridium perfringens
Przeprowadza się je stosując posiew wgłębny próbek na podłoże siarczynowo-żelazowe
wg. Wilsona-Blaira w temperaturze 37

C przez 18-24±2 h. (Wykrywanie bakterii

Clostridium perfringens można przeprowadzać również metodą hodowli na pożywce

stałej).

 Do posiewu należy użyć po 1 cm

zawiesiny z następujących rozcieńczeń:

- gleba piaszczysta – 10

-1

–10

-4

- gleba ogrodowa oraz kompost z odpadków miejskich: 10

-1

– 10

-6

 W celu wyeliminowania mikroflory niesporowej wszystkie rozcieńczenia próbek

należy przed posiewem ogrzewać w łaźni wodnej w temperaturze 80

C w ciągu 15

min.

 Pojawienie się w ciągu pierwszych 18 h inkubacji w głębi agaru czarnych kolonii

często rozrywających podłoże na skutek wytwarzania gazu świadczy o obecności
Clostridium perfringens. Czarne zabarwienie kolonii powstaje w wyniku redukcji
siarczynu do siarczku sodu, który z chlorkiem żelaza tworzy czarno zabarwiony
siarczek żelaza.

 Ostateczny wynik badania podaje się jako miano bakterii Clostridium perfringens.

Zadanie 4. Oznaczanie bakterii z rodzaju Salmonella
Badanie przeprowadza się w 2 etapach:



Etap I – Badanie wstępne – metoda hodowli na podłożu płynnym wybiórczo -
namnażającym z kwaśnym seleninem sodu, w którym pewne pałeczki
chorobotwórcze ulegają namnożeniu, a wzrost innych jest w różnym stopniu
zahamowany - polega na posiewie (wprowadzeniu) odpowiedniej ilości gleby do
podłoża namnażającego i inkubacji w temperaturze 37

C przez 18-24 h.

Za wynik dodatni badania wstępnego przyjmuje się:

- zmętnienie podłoża,
- uzyskanie barwy ceglastej.

Za wynik ujemny badania wstępnego przyjmuje się :

- brak zmętnienia i barwy podłoża.

Za wynik wątpliwy badania wstępnego przyjmuje się:

- pojawienie się bardzo słabego zmętnienia przy jednoczesnym słabym

zabarwieniu podłoża na kolor ceglasty,

- brak zmętnienia i zabarwienie na kolor ceglasty.

Hodowle uznane za wątpliwe po 18-24 h inkubacji poddaje się badaniu
potwierdzającemu.



Etap II – Badanie potwierdzające – należy wykonać w celu potwierdzenia
obecności bakterii z rodzaju Salmonella, w zasadzie ze wszystkich
dodatnich i wątpliwych hodowli badania wstępnego uzyskanych w czasie
18- 24 h. Potwierdzenie hodowli dodatnich uzasadnia się koniecznością
wykluczenia tzw. wyników dodatnich fałszywych. Badania potwierdzające
obecność bakterii z rodzaju Salmonella wykonuje się w temperaturze 37

na podłożach wybiórczo-różnicujących, stałych, na których w zależności
od właściwości biochemicznych kolonie drobnoustrojów mogą wykazywać
różnice o znaczeniu rozpoznawczym. Z tego rodzaju podłoży zalecane są
podłoża wykorzystujące zdolność pałeczek jelitowych do fermentacji
laktozy, co uwidacznia się jako zmiana zabarwienia kolonii lub jako
zdolność do zmiany potencjału oksydoredukcyjnego w czasie wzrostu
drobnoustrojów:

- metodą powierzchniową:

na podłożu Mc Conkeya,

na podłożu SS (Salmonella-Shigella).

- metodą kłutą i posiewu powierzchniowego na podłożu Kliglera

Za wynik dodatni badania potwierdzającego przyjmuje się:

na podłożu Mc Conkeya – obecność i wzrost kolonii nie
rozkładających laktozy, czyli kolonii o zabarwieniu różowym,

na podłożu SS (Salmonella-Shigella) - obecność i wzrost kolonii
bezbarwnych, gładkich z czarnymi środkami,

na podłożu Kliglera:

- zmianę barwy dolnej części podłoża na żółtą, podczas gdy
   powierzchnia skośna pozostaje bez zmian (czyli ma kolor czerwony
  tak jak pożywka wyjściowa),
     - ciemnienie (zaczernienie) podłoża wskazujące na wytworzenie się
  siarkowodoru z równoczesnym rozmieszczaniem się tego gazu
  wewnątrz podłoża w postaci baniek.

 W wykrywaniu bakterii z rodzaju Salmonella wykorzystywane są również podłoża

pozwalające na wykrycie właściwości biochemicznych izolowanych
drobnoustrojów np.: fermentacji cukrów, alkoholi, wytwarzanie indolu itp

 Do posiewu należy użyć 4 x 25 g gleby, tak, aby zostało przebadane 100 g gleby.

Zadanie 5. Wykrywanie żywych jaj robaków jelitowych i określenie stadium ich
rozwoju:

  glisty ludzkiej (Ascaris lumbricoides),
  glisty psiej (Toxocara sp.),
  włosogłówki (Trichuris trichiura).

Wykrywanie żywych jaj pasożytów jelitowych wykonuje się w 3 etapach:



Etap I – polega na „odlepieniu” jaj pasożytów od podłoża (grudek ziemi i
osadów). Etap ten trwa 1 h i przeprowadzony jest z użyciem 5 %
wodorotlenku sodu.



Etap II

 flotacja- przeprowadzona przy użyciu 5 % siarczanu cynku i w

wyniku wirowania roztworu glebowego (od 1 do 5 wirowań).

 zagęszczanie do niewielkiej ilości, za pomocą pipety,

wyflotowanych na powierzchnię roztworu glebowego jaj
pasożytów.



Etap III – to obserwacja i rozpoznawanie jaj pasożytów przy użyciu
mikroskopu.