OZNACZANIE MASY CZĄSTECZKOWEJ POLIMERÓW METODĄ CHROMATOGRAFII ŻELOWEJ

Instrukcja ćwiczenia laboratoryjnego HPLC-2 – Nowoczesne techniki
analityczne

1) OZNACZANIE ROZKŁADU MASY CZĄSTECZKOWEJ
POLIMERÓW Z ASTOSOWANIEM CHROMATOGRAFII ŻELOWEJ;
2) PRZYGOTOWANIE PRÓBKI Z ZASTOSOWANIEM SPE I
KONTROLA OBECNOŚCI ORAZ OZNACZANIE ZAWARTOŚCI
SACHAROZY W MIODZIE

WSTĘP

Chromatografia żelowa (GPC – Gel Permeation Chromatography, albo SEC – Size

Exclusin Chromatography) jest techniką rozdzielania substancji, w której wykorzystuje się
niejonowy mechanizm sita molekularnego, nazwany też mechanizmem wykluczania
molekularnego. W odróżnieniu od innych rodzajów chromatografii, w chromatografii żelowej
rozdziela się substancje prawie wyłącznie wg rozmiarów ich cząsteczek w roztworze.
Wykorzystuje się zróżnicowanie dostępności molekuł do porów o zróżnicowanych
średnicach, a w konsekwencji – zróżnicowanie w przestrzeni porów wewnątrz ziaren
wypełnienia kolumny - drogi i czasu dyfuzji cząsteczek różniących się wielkością i w
konsekwencji masą molekularną. Chromatografia żelowa może być też stosowana do
oznaczania zawartość tych składników próbki, które posiadają wydatnie wyższą, albo niższą
masę cząsteczkową od pozostałej części próbki. Bywa też wykorzystywana w procesie
przygotowania próbki, szczególnie, w celu oddzielenia substancji o wyższych masach
molekularnych od substancji oznaczanych, np. wyodrębnienie frakcji zawierającej WWA,
pestycydy, czy sole metali ciężkich z frakcji lipidów i fosfolipidów, albo kwasów
humusowych itp.

Ważne i wciąż rosnące zastosowanie ma też chromatografia jonowymienna i jonowa,

szczególnie w kontroli czystości różnego typu wód, a także ścieków. Dotyczy to przede
wszystkim oznaczania zawartości anionów nieorganicznych i organicznych, a także metali
alkalicznych, ziem alkalicznych, metali ciężkich, inhibitorów korozji itp. Stosuje się silne,
średnio mocne i słabe anionity oraz kationity. Szczególnie w przypadku rozdzielania
substancji organicznych wykorzystuje się często słabe, albo bardzo jonity i oddziaływania jon
– dipol, jon – dipol indukowany oraz dipol – dipol. Z wykorzystaniem bardzo słabych
anionitów można w ten sposób rozdzielać i oznaczać m.in. kwasy karboksylowe, cukry,
amino-cukry, aldehydy i alkohole.

CEL ĆWICZENIA

Celem pierwszej części ćwiczenia jest wyznaczanie rozkładu masy cząsteczkowej

polimerów na podstawie zależności funkcyjnej pomiędzy wartością log M (masy
cząsteczkowej) i czasem retencji wzorcowych polimerów (na podstawie specyficznego typu
krzywej kalibracyjnej).

W drugiej części ćwiczenia studenci mają za zadanie skontrolować czy próbka miodu

jest „sfałszowana” (czy zawiera sacharozę) oraz oznaczyć zawartość sacharozy i dwóch
podstawowych cukrów (glukozy i fruktozy) obecnych w miodzie. Dodatkowym celem jest
przygotowanie próbki - oddzielenie wosków i innych składników hydrofobowych - z
zastosowaniem ekstrakcji do fazy stałej (SPE - solid phase ekstraction), a także wykonanie
kalibracji dla trzech rodzajów cukrów z wykorzystaniem metody krzywej kalibracyjnej

MATERIAŁY I SPRZĘT

- Roztwory standardów polimerów o znanej wartości średniej masy cząsteczkowej i
minimalnej dyspersji rozkładu masy cząsteczkowej, w tetrahydrofuranie; Roztwory próbek
polimerów w tetrahydrofuranie; tetrahydrofuran, jako eluent; glukoza, fruktoza, sacharoza o
czystości ponad 99 % oraz roztwory kalibracyjne; Próbki miodu i ich roztwory w wodzie;
acetonitryl do HPLC, woda destylowana, albo o podobnej czystości;

- Aparat chromatograficzny do chromatografii żelowej: pompa – Merck – Hitachi L-6200,
dozowanie próbki – dozownik zaworowy z pętlą 20 μl, kolumna do chromatografii żelowej w
warunkach liofilowych – wypełnienie LiChrogel PS MIX, dp = 5 μm, wymiary kolumny 250
mm (długość) x 7 mm (średnicy wewnętrzna) detektor refraktometryczny, integrator;
zestaw sprzętowy do SPE, pompka próżniowa, kolumienki SPE typu RP 18 (0.5 g); Waga
analityczna
- Kolby miarowe 25, albo 10 ml; Pipeta automatyczna;
- Strzykawka 100, albo 50 μl (produkcji Hamilton, albo SGE).

OZNACZANIE ROZKŁADU MASY MOLEKULARNEJ

Próbkę polimeru przeznaczonego do badania rozkładu masy cząsteczkowej rozpuszcza
się w fazie ruchomej (w tetrahydrofuranie). Określoną objętość tego roztworu wstrzykuje się
do kolumny chromatograficznej typu HPLC, wypełnionej kulistymi cząstkami kopolimeru
styren – diwinylobenzen o wysokim stopniu usieciowania. Kolumna umożliwia selektywne
rozdzielenie substancji różniących się masą cząsteczkową. Wylot kolumny jest połączony z
detektorem refraktometrycznym, którego sygnał jest proporcjonalny do stężenia oraz do masy
cząsteczkowej substancji eluowanych z kolumny. Otrzymany pik chromatograficzny zostaje
podzielony kilka do kilkunastu fragmentów o zbliżonych powierzchniach. Każdemu z
fragmentów zostaje przypisany czas retencji, odpowiadający położeniu „środka ciężkości”
odpowiedniego fragmentu. Uzyskane wartości czasu retencji poszczególnych fragmentów
piku są porównywane są z odpowiadającymi im wartościami czasu retencji i logarytmu masy
cząsteczkowej na przygotowanej wcześniej krzywej kalibracyjnej, uzyskanej dla „nisko-
dyspersyjnych” standardów polimerów. Wagowy udział poszczególnych frakcji o
określonych masach molekularnych w próbce badanego polimeru wyznacza się w
przybliżeniu na podstawie udziałów powierzchni poszczególnych fragmentów piku do
całkowitej jego powierzchni. W celu dokładnego określenia wagowego rozkładu stężenia
należy, dodatkowo, zastosować metodę normalizacji ze współczynnikami korekcyjnymi,
określonymi na podstawie wykresu c

= f(A

), gdzie: c

– to stężenie roztworu nisko-

dyspersyjnego polimeru o średniej masie molekularnej M, A

– to powierzchnie

odpowiedniego piku próbki kalibracyjnej.

WARUNKI ROZDZIELANIA

Przepływ fazy ruchomej – 0,8 ml / min
Temperatura pokojowa
Ciśnienie – ok. 30 atm.

WYKONANIE ĆWICZENIA

1. Wzorcowanie

a). Sporządzić roztwory nisko – dyspersyjnych standardów polimerów o średnich masach

molekularnych: 2750000 Da, 580 Da w THF (stężenie końcowe roztworu ok. 2 mg /
ml) oraz 1260000 Da, 120000 Da, 30300 Da, 2450 Da (stężenie końcowe ok. 3 mg /
ml);

b).Ustawić stałą prędkość przepływu eluentu (THF) – 0,8 ml / min.
c).Ustabilizować warunki rozdzielania po zapewnieniu wypełnienia kanału odniesienia

detektora RI aktualnie stosowanym eluentem (konieczne uzyskanie stabilnej linii
podstawowej detektora – wahania wskazań na wyświetlaczu mniejsze od 0,2 jednostek
względnych);

d). Po ustaleniu warunków oznaczania, nastrzyknąć kolejno roztwory wzorcowych

polimerów w THF;
e).Zarejestrować chromatogramy i odczytać czas retencji oraz powierzchnię piku
każdego wzorca.

2. Wykonanie oznaczenia rozkładu masy molekularnej próbki polimeru

a). Zważyć ok. 0,2 g polimeru o nieznanej masie cząsteczkowej (np. styropian, fragment
sztućca, albo obudowy polistyrenowej) do kolby miarowej o poj. 10 ml i dopełnić do
kreski THF.
b). Po ustabilizowaniu warunków oznaczania, identycznych jak te, które stosowano
podczas wzorcowania, dozować do kolumny roztwór próbki i rozpocząć zbieranie
danych.
c). Z uzyskanego chromatogramu odczytać czas retencji (czas położenia maksimum
piku) oraz czas elucji początku i końca oraz czas położenia ok. ¼, 1/3, ½, 2/3, ¾
powierzchni piku analizowanego polimeru.

OPRACOWANIE WYNIKÓW

1. Sporządzić wykres zależności czasu retencji od log M wzorcowych polimerów

(krzywa kalibracyjna);

2. Na podstawie wartości czasu retencji poszczególnych fragmentów piku badanego

polimeru, wyznaczyć z równania krzywej kalibracyjnej odpowiadające im wartości
masy cząsteczkowej oraz orientacyjny przebieg krzywej rozkładu masy cząsteczkowej
badanego polimeru przy założeniu, że czułość detektora RI nie zależy od masy
cząsteczkowej (metoda normalizacji „prostej”);

3. Na podstawie zależności powierzchni pików standardów polimerowych o różnych

masach cząsteczkowych od ich stężenia w próbce dozowanej do kolumny wyznaczyć
skorygowany przebieg krzywej rozkładu masy cząsteczkowej badanego polimeru z
zastosowaniem metody normalizacji ze współczynnikami korekcyjnymi (znana
zależność funkcyjna c

= f(A

Uwaga !

Kalibracja z zastosowaniem nisko-dyspersyjnych standardów polistyrenu jest często
wykorzystywana także do wyznaczania rozkładu masy cząsteczkowej innych polimerów,
niż polistyren. Wówczas wyniki mogą mieć, jednak, tylko orientacyjny charakter. W celu
otrzymania wyników dokładnych należy zastosować do kalibracji nisko – dyspersyjne

standardy tego samego typu polimeru, którego rozkład masy cząsteczkowej jest badany,
albo wykorzystać takie metody detekcji, które pozwalają na wyznaczenie bezwzględnej
wartości masy molekularnej.

PRZYGOTOWANIE PRÓBKI (USUNIĘCIE FRAKCJI WOSKÓW Z ZASTOSOWANIEM
SPE), KONTROLA OBECNOŚCI SACHAROZY I OZNACZENIE ZAWARTOŚCI
PODSTAWOWYCH CUKRÓW W MIODZIE METODĄ HPLC – RID / NH2

Próbkę miodu o masie 0,5 g rozpuścić w 5 cm3 wody. Roztwór miodu przesączyć przez
kolumienkę SPE typu C18 w celu usunięcia wosków i steroli. Kolumienkę przed użyciem
należy kondycjonować ok. 10 ml fazy ruchomej (acetonitryl : woda 80:20 v/v). Po
naniesieniu badanego roztworu na kolumienkę, należy dodatkowo przepłukać ją 10 ml wody
do HPLC. Tak przygotowany roztwór rozcieńczyć 8 – krotnie i poddać analizie
chromatograficznej.

WARUNKI ROZDZIELANIA

Przepływ fazy ruchomej – 1.2 ml / min
Temperatura pokojowa
Ciśnienie – ok. 90 atm.

WYKONANIE ĆWICZENIA

1. Wzorcowanie

a). Sporządzić roztwory cukrów (glukoza, fruktoza, sacharoza) o stężeniu ok. 4mg/ml oraz
2 mg/ml każdego z wzorców
b). Ustawić stałą prędkość przepływu eluentu (acetonitryl :woda 80:20v/v) – 1,2 ml / min.
c). Ustabilizować warunki rozdzielania po zapewnieniu wypełnienia kanału odniesienia
detektora RI aktualnie stosowanym eluentem (konieczne uzyskanie stabilnej linii
podstawowej detektora – wahania wskazań na wyświetlaczu mniejsze od 0,2 jednostek
względnych);
d). Po ustaleniu warunków oznaczania, nastrzyknąć kolejno roztwory wzorcowych cukrów
e). Zarejestrować chromatogramy oraz odczytać powierzchnię piku każdego wzorca.

3. Wykonanie oznaczenia

a). Wprowadzić do aparatu odpowiednią objętość roztworu miodu przygotowanego zgodnie z
procedurą opisaną powyżej
b) Zarejestrować chromatogramy oraz odczytać powierzchnie wszystkich pików

OPRACOWANIE WYNIKÓW

a). Sporządzić wykres zależności stężenia wyrażonego w mg / ml od powierzchni
wyznaczonej dla każdego wzorca cukru tj. glukozy, fruktozy i sacharozy
b). Na postawie uzyskanych krzywych kalibracyjnych wyznaczyć zawartość poszczególnych
cukrów w próbkach miodu wyrażoną w % masowych
c). Wyznaczyć całkowitą zawartość cukrów w próbce, wyrażoną w % masowych, przez
zsumowanie zawartości poszczególnych cukrów w próbce.

Document Outline