SZKOŁA GŁÓWNA GOSPODARSTWA WIEJSKIEGO

Pragnę złożyć serdeczne podziękowania Pani Profesor dr hab. Dorocie Witrowej-Rajchert za

trud włożony w pomoc przy realizacji niniejszej pracy. Dziękuję również za wiarę w moje

możliwości i zachęcenie do rozpoczęcia studiów doktoranckich. Za wsparcie, troskę

i poświęcony mi czas. Za cierpliwość i wyrozumiałość, zwłaszcza podczas mojego pobytu na

stypendium zagranicznym. Za cenne uwagi i porady w trakcie przygotowywania publikacji oraz

niniejszej rozprawy. W sposób szczególny dziękuję za stosowanie pozytywnych metod

motywowania mnie do pracy.

Dziękuję kierownikowi Katedry Inżynierii Żywności i Organizacji Produkcji, Panu Profesorowi

dr hab. Piotrowi P. Lewickiemu, za cenne i krytyczne uwagi na temat mojej pracy, stworzenie

naukowej atmosfery oraz warunków do prowadzenia badań, a przede wszystkim – za

motywowanie do dążenia, aby odpowiadać nie tylko na pytanie „jak”, ale i na pytanie

„dlaczego”.

Kierownikowi studiów doktoranckich, Panu Profesorowi dr hab. Andrzejowi Lenartowi, dziękuję

za pomoc w spełnieniu wszystkich formalnych wymagań niezbędnych do zakończenia studiów,

konsekwentne przypominanie o priorytetach oraz życzliwość i wsparcie.

Wszystkim pracownikom Katedry Inżynierii Żywności i Organizacji Produkcji serdecznie dziękuję

za pomoc w realizacji badań i obowiązków dydaktycznych związanych ze studiami

doktoranckimi.

Wszystkim współuczestnikom studium doktoranckiego, a w szczególności Ani Kamińskiej

i Anecie Ogonek, dziękuję za wsparcie i przyjaźń.

In this place I want also to express my thanks to the whole staff of Laboratory of Food

Technology, Katholieke Universiteit Leuven, where I spent one year working on my PhD thesis.

My special profound thanks goes to Prof. Marc Hendrickx, Prof. Ann Van Loey and

Yann Guiavarc’h (even if they never can see this page), for their kindness, scientific support

and fruitful discussions. Dank U Wel!

Dziękuję firmie Novozymes A/S za przekazanie próbki enzymu do badań.

1. WSTĘP .................................................................................................................1
2. PRZEGLĄD LITERATURY .....................................................................................2

2.1. ENZYMY .........................................................................................................2

2.1.1. Definicja i podstawowe właściwości enzymów ...............................2
2.1.2. Budowa enzymów ..............................................................................2

2.1.2.1. Budowa chemiczna .........................................................................2
2.1.2.2. Struktura przestrzenna ....................................................................3

2.1.3. Kinetyka reakcji enzymatycznych .................................................... 5
2.1.4. Czynniki wpływające na aktywność enzymów ................................7

2.1.4.1. Temperatura ..................................................................................7
2.1.4.2. Stężenie jonów wodorowych ............................................................8

2.2. ENZYMY W TECHNOLOGII ŻYWNOŚCI ........................................................9

2.2.1. Zastosowanie enzymów ....................................................................9

2.2.1.1. Skrobia i enzymy amylolityczne ........................................................11

2.2.2. Metody produkcji preparatów enzymatycznych ..............................14
2.2.3. Jakość i formy preparatów enzymatycznych ...................................15

2.3. SUSZENIE ENZYMÓW ................................................................................... 16

2.3.1. Metody suszenia ................................................................................16

2.3.1.1. Suszenie rozpyłowe .........................................................................17

2.4. ROLA WODY W PROCESACH FIZYCZNYCH I BIOCHEMICZNYCH .............. 19

2.4.1. Aktywność wody ................................................................................20
2.4.2. Hydratacja i interakcje wody z innymi składnikami ........................22

2.4.2.1. Interakcje w układach trójskładnikowych ......................................... 23

2.4.3. Izotermy sorpcji ................................................................................ 25
2.4.4. Stan szklisty .......................................................................................26

2.5. INAKTYWACJA CIEPLNA ENZYMÓW ............................................................28

2.5.1. Wpływ aktywności wody na inaktywację cieplną enzymów .......... 32
2.5.2. Wpływ dodatków stabilizujących na inaktywację

cieplną enzymów................................................................................34

2.6. PODSUMOWANIE...........................................................................................36

3. CEL I ZAKRES PRACY ..........................................................................................37
4. METODYKA BADAŃ .............................................................................................38

4.1 MATERIAŁY .....................................................................................................38

4.1.1. Preparat

-amylazy Fungamyl 800L .................................................38

4.1.1.1. Oznaczenie masy molowej białka enzymatycznego ............................38
4.1.1.2. Oznaczenie zawartości białka ...........................................................39
4.1.1.3. Oznaczenie zawartości suchej substancji .......................................... 40

4.1.2. Maltodekstryna ..................................................................................41

4.2. SUSZENIE ROZPYŁOWE PREPARATU

-AMYLAZY ......................................41

4.2.1. Charakterystyka otrzymanych suszy ................................................42

4.2.1.1. Oznaczenie aktywności

-amylazy ................................................... 42

4.2.1.2. Oznaczenie zawartości suchej substancji........................................... 46
4.2.1.3. Oznaczenie morfologii cząstek.......................................................... 46
4.2.1.4. Właściwości fizyczne proszków......................................................... 47
4.2.1.5. Oznaczenie zawartości sacharydów redukujących.............................. 47

4.2.2. Parametry opisujące przebieg suszenia rozpyłowego..................... 47

4.3. KINETYKA INAKTYWACJI CIEPLNEJ

-AMYLAZY .......................................49

4.3.1. Oznaczenie aktywności

-amylazy ...................................................49

4.3.1.1. Optymalizacja oznaczenia ................................................................50

4.3.2. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w systemach

o wysokiej zawartości wody .............................................................51

4.3.2.1. Przygotowanie próbek .....................................................................51
4.3.2.2. Obróbka cieplna ..............................................................................52

4.3.3. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w systemach

o niskiej zawartości wody ................................................................ 54

4.3.3.1. Liofilizacja i dosuszanie ................................................................... 54
4.3.3.2. Adsorpcja pary wodnej i izoterma sorpcji ..........................................55
4.3.3.3. Obróbka cieplna ..............................................................................56

4.3.4. Wpływ dodatków stabilizujących na kinetykę inaktywacji

cieplnej

-amylazy.............................................................................57

4.3.4.1. Przygotowanie próbek .....................................................................57
4.3.4.2. Obróbka cieplna ..............................................................................58

4.3.5. Wyznaczenie parametrów kinetycznych inaktywacji cieplnej

-amylazy ..........................................................................................59

4.4. METODY STATYSTYCZNE ..............................................................................61

4.4.1. Analiza wariancji................................................................................61
4.4.2. Test t-Studenta...................................................................................62

5. OMÓWIENIE I DYSKUSJA WYNIKÓW................................................................63

5.1. CHARAKTERYSTYKA MATERIAŁÓW DO BADAŃ...........................................63

5.1.1. Preparat

-amylazy Fungamyl 800L .................................................63

5.1.1.1. Masa molowa .................................................................................63
5.1.1.2. Zawartość białka .............................................................................64
5.1.1.3. Zawartość suchej substancji ............................................................65

5.1.2. Maltodekstryna ..................................................................................65

5.2. SUSZENIE ROZPYŁOWE PREPARATU

-AMYLAZY ......................................65

5.2.1. Parametry opisujące przebieg suszenia rozpyłowego..................... 65

5.2.1.1. Temperatura powietrza wylotowego..................................................65

5.2.1.2. Strumień odparowanej wody............................................................ 67
5.2.1.3. Wilgotność powietrza wylotowego.....................................................68
5.2.1.4. Właściwe zużycie powietrza .............................................................68
5.2.1.5. Właściwe zużycie ciepła ..................................................................69

5.2.2. Charakterystyka otrzymanych proszków .........................................70

5.2.2.1. Zawartość wody ..............................................................................70
5.2.2.2. Morfologia cząstek ..........................................................................72
5.2.2.3. Właściwości fizyczne........................................................................73
5.2.2.4. Zawartość sacharydów redukujących.................................................74

5.2.3. Podsumowanie – przebieg suszenia..................................................75
5.2.4. Aktywność

-amylazy w otrzymanych suszach ...............................75

5.2.5. Podsumowanie ...................................................................................80

5.3. KINETYKA INAKTYWACJI CIEPLNEJ

-AMYLAZY .......................................80

5.3.1. Optymalizacja oznaczenia aktywności

-amylazy .......................... 80

5.3.2. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w systemach

o różnej zawartości wody..................................................................81

5.3.2.1. Adsorpcja pary wodnej i izoterma sorpcji...........................................81
5.3.2.2. Parametry kinetyczne inaktywacji cieplnej

-amylazy......................... 83

5.3.3. Wpływ dodatków stabilizujących na kinetykę inaktywacji

cieplnej

-amylazy ............................................................................102

5.3.4. Podsumowanie....................................................................................107

6. WNIOSKI..............................................................................................................109
7. STRESZCZENIE ....................................................................................................111
8. ABSTRACT.............................................................................................................114
9. SPIS LITERATURY................................................................................................116
10. ANEKS.................................................................................................................126

Wstęp

1. WSTĘP

Przetwórstwo żywności jest jednym z największych odbiorców preparatów

enzymatycznych wśród wszystkich gałęzi przemysłu. Ich stosowanie ułatwia i przyspiesza

zachodzenie korzystnych zmian w surowcach, zwiększając wydajność gotowych produktów,

a przez to zmniejszając koszty produkcji. Do najdawniej i najczęściej stosowanych enzymów

należą te z grupy amylaz, wykorzystywane na szeroką skalę w przemyśle piekarskim,

skrobiowym i gorzelniczym.

Produkcja i modyfikowanie właściwości enzymów są ważnymi obszarami działalności

współczesnej biotechnologii. Jednym z kierunków tych działań są prace nad doskonaleniem

procesu suszenia enzymów jako metody ich utrwalania. Ponieważ o jakości i przydatności

preparatów enzymatycznych decyduje ich aktywność i zdolność do spełniania określonej funkcji

biologicznej oraz trwałość, to celem suszenia jest otrzymanie aktywnych preparatów zdatnych

do długiego przechowywania. W praktyce jest to bardzo trudne do osiągnięcia, ponieważ

w czasie suszenia w enzymach może zachodzić wiele niekorzystnych zmian chemicznych,

fizycznych i biochemicznych, jak np. denaturacja białek, które są przyczyną utraty aktywności

enzymatycznej.

Ze względu na znaczne zróżnicowanie budowy i właściwości fizycznych poszczególnych

enzymów, a także na zmiany tych właściwości pod wpływem towarzyszących suszeniu

przemian fizykochemicznych i biologicznych, metoda suszenia i optymalne parametry tego

procesu powinny być dobierane do każdego enzymu indywidualnie. W celu doboru

odpowiedniej metody i warunków suszenia konieczna jest na przykład znajomość kinetyki

inaktywacji cieplnej danego enzymu przy różnej zawartości wody.

Do suszenia enzymów najczęściej stosowana jest metoda rozpyłowa. Wielu autorów

stwierdza, że jest to odpowiednia metoda suszenia materiałów termolabilnych, ze względu na

stosunkowo niską temperaturę materiału w czasie procesu oraz krótki czas działania

podwyższonej temperatury na suszony materiał. Brak jednak prac, które wyjaśniałyby wpływ

zmian parametrów suszenia na aktywność enzymu w otrzymanym suszu, czego można

dokonać na podstawie znajomości kinetyki inaktywacji cieplnej enzymu w warunkach różnej

zawartości wody.

Przegląd literatury – Enzymy

2. PRZEGLĄD LITERATURY

2.1. ENZYMY

2.1.1. Definicja i podstawowe właściwości enzymów

Enzymy, dawniej zwane fermentami, są wytwarzanymi przez żywe organizmy

katalizatorami (biokatalizatorami) przemian chemicznych. Jedynie w ich obecności może

zachodzić wiele reakcji metabolicznych we względnie łagodnych warunkach,

tzn.: w temperaturze poniżej 100°C, przy ciśnieniu atmosferycznym i obojętnym pH (Whitaker

2003). Jak wynika z definicji katalizatora, enzymy są substancjami, które zwiększając szybkość

przemiany substratów w produkty po zakończeniu reakcji zachowują niezmienioną budowę

i właściwości. Enzymy znacznie ułatwiają i przyspieszają zajście reakcji chemicznej poprzez:

zwiększenie prawdopodobieństwa zderzeń reagujących cząsteczek, zmniejszenie bariery

energetycznej oraz ukierunkowanie cząsteczek substratów względem siebie (Kączkowski 1999).

W reakcjach enzymatycznych uzyskuje się zwiększenie szybkości reakcji od 100 do 1000 razy

(Zgirski 1999).

Najważniejszą cechą enzymów, odróżniającą je od innych katalizatorów, jest ich duża

specyficzność działania, wyrażająca się katalizowaniem reakcji chemicznej określonego typu

i ograniczonej do substratu o określonej budowie. Enzymy mają zdolność wybierania

i katalizowania tylko jednej z termodynamicznie możliwych reakcji, jakim może podlegać dany

substrat. Jeżeli może się on przekształcać w kilku różnych kierunkach, to każda z tych reakcji

jest katalizowana przez odrębny enzym, zdolny do przekształcania wiązania określonego typu

(Zgirski 1999, Kączkowski 1999). Szacuje się, że liczba enzymów w komórce organizmu żywego

może wynosić od 2 do 10 tys. (Reps 2003).

2.1.2. Budowa enzymów

2.1.2.1. Budowa chemiczna

Polemika co do chemicznej natury enzymów toczyła się w świecie naukowym od końca

XIX w. do lat 30-tych XX w., prowadząc do ostatecznego stwierdzenia, że są one białkami. Do

tej pory uzyskano ponad 600 enzymów w postaci krystalicznej, spośród których wszystkie są

białkami (Whitaker 2003).

Pod względem budowy chemicznej wyróżnia się trzy kategorie enzymów. Do kategorii

pierwszej należą białka proste zbudowane tylko z aminokwasów. Rolę grupy czynnej w tym

przypadku spełniają specyficzne zespoły aminokwasów, których nie można odszczepić bez

zmiany struktury białka, a więc bez zniszczenia enzymu jako substancji katalitycznej. Do grupy

tej należą min. enzymy proteolityczne i

-amylaza. Enzymy z drugiej i trzeciej kategorii są

Przegląd literatury – Enzymy

białkami złożonymi zawierającymi grupy nieaminokwasowe zwane koenzymami, związane

z cząsteczką białkową zwaną apoenzymem. Podział tego rodzaju enzymów na dwie grupy

wynika z różnic w sposobie związania dwóch wyżej wymienionych części. W drugiej grupie

enzymów wiązanie to ma charakter trwały (kowalencyjny), a związany w ten sposób koenzym

nosi nazwę grupy prostetycznej. Oddzielenie i ponowne złączenie apoenzymu i tej grupy nie

zawsze prowadzi do odtworzenia katalitycznie czynnego enzymu. Enzymy należące do trzeciej

grupy zawierają luźno związany koenzym, którego nie można traktować jako integralnej części

enzymu na podobieństwo grupy prostetycznej. W tym przypadku obie części enzymu dają się

łatwo oddzielić i każda z nich jest nieczynna, a złączone ze sobą dają ponownie aktywny enzym

(Zgirski 1999, Rodwell 1995).

Każda z części składowych enzymu ma inny wpływ na jego właściwości. Część białkowa

(apoenzym) odpowiada za specyficzność substratową, czyli za to, jaki rodzaj substratu ulega

przemianie. Grupa prostetyczna i koenzym są narzędziami pozwalającymi na przetworzenie

wcześniej wybranego substratu. Koenzymy określają z reguły typ katalizowanej reakcji,

decydując np., jakie grupy chemiczne czy atomy mogą być przenoszone z donora na akceptor.

Rolą grupy prostetycznej jest utrzymywanie struktury enzymu optymalnej dla katalizy (Zgirski

1999, Kączkowski 1999).

2.1.2.2. Struktura przestrzenna

Ponieważ enzymy są białkami, ich budowa strukturalna jest charakterystyczna dla

substancji białkowych, tzn. wykazuje kilka poziomów organizacji, od struktur

pierwszorzędowych do czwartorzędowych.

Budowę pierwszorzędową stanowi sekwencja aminokwasów, czyli

kolejność ich

występowania w łańcuchu polipeptydowym, która przesądza o tym, w jaki sposób zwinie
się ta cząsteczka, przybierając swój charakterystyczny kształt. Łańcuchy polipeptydowe ulegają

przestrzennemu skręceniu i pofałdowaniu, w wyniku czego cząsteczki uzyskują trójwymiarowy

kształt, czyli konformację.

Sposób ułożenia łańcuchów polipeptydowych w przestrzeni stanowi strukturę

drugorzędową białka (Rys. 2.1.A), która jest stabilizowana przez wiązania wodorowe

pomiędzy aminokwasami znajdującymi się obok siebie w przestrzeni (niesąsiadującymi

w łańcuchu polipeptydowym). Strukturę drugorzędową cząsteczek białkowych charakteryzuje

skręcenie łańcuchów polipeptydowych w rodzaj spirali, zwanej alfa-helisą lub inny regularny

układ przestrzenny, np. „kartki beta” (Rys 2.2).

Trzeciorzędowa struktura białka (Rys. 2.1.B i 2.2) powstaje na skutek oddziaływań

pomiędzy aminokwasami znajdującymi się w różnych miejscach skręconej, drugorzędowej

Przegląd literatury – Enzymy

Enzymy mogą spełniać swoją funkcję biologiczną tylko wtedy, gdy występują w ściśle

określonej konformacji przestrzennej. Najistotniejszym elementem budowy enzymów,

decydującym o ich właściwościach katalitycznych, jest centrum aktywne, w którym w czasie

katalizowanej reakcji następuje związanie substratu. Zazwyczaj jest to względnie niewielka

część całej cząsteczki enzymu, stanowiąca określoną trójwymiarową przestrzeń, utworzoną

przez grupy funkcyjne aminokwasów. Aminokwasy te są zwykle oddalone od siebie w łańcuchu

polipeptydowym, a sąsiadują w przestrzeni wskutek powyginania tego łańcucha. Mogą to

również być reszty aminokwasów znajdujących się w odrębnych łańcuchach (Zgirski 1999,

Kączkowski 1999, Whitaker 2003).

2.1.3. Kinetyka reakcji enzymatycznych

Koncepcję reakcji katalizowanej enzymatycznie zaproponowaną przez Michaelisa i Menten

przedstawiono równaniem 2.1. i na rysunku 2.3. Cząsteczki substratu (S) są wiązane

w określonym obszarze cząsteczki enzymu (E), w tzw. centrum aktywnym, tworząc kompleks

enzym-substrat (ES) (Marangoni 2003, Lee 1996b):

(2.1)

Mechanizm łączenia się enzymu z substratem ma charakter indukowanego dopasowania,

opierającego się na dopasowaniu kształtu enzymu do substratu lub odpowiedniej grupy

substratów i przekształceniu ich w produkty. W kompleksie ES cząsteczka enzymu wymusza

optymalne dla reakcji ułożenie cząsteczek substratów w przestrzeni. W trakcie tworzenia

kompleksu również w cząsteczce enzymu następują zmiany budowy przestrzennej (Rys. 2.3).

Rys. 2.3. Mechanizm reakcji katalizowanej enzymatycznie

Przegląd literatury – Enzymy

Po utworzeniu produktu (P) cząsteczka enzymu zostaje uwolniona, przybiera pierwotny

kształt i wchodzi w reakcję tworzenia kompleksu z kolejnymi cząsteczkami substratów. Taki

cykl przemian nosi nazwę „obrotu enzymu”.

Szybkość procesu enzymatycznego zależy od łatwości tworzenia kompleksu enzymu

z substratem (powinowactwo enzymu do substratu). Przy małych stężeniach substratu

początkowa szybkość reakcji jest wprost proporcjonalna do stężenia substratu, natomiast przy

dużych stężeniach szybkość zmierza do wartości maksymalnej, to znaczy, że szybkość staje się

niezależna od stężenia substratu. W celu opisania tych obserwacji Michaelis i Menten

wyprowadzili równanie nazwane równaniem Michaelisa – Menten, określające zależność

szybkości reakcji enzymatycznych od stężenia substratu (Marangoni 2003):

]

[

]

[

max

⋅

(2.2)

gdzie:

- szybkość reakcji (mol produktu/s)

max

- maksymalna szybkość reakcji (mol produktu/s)

[

]

- stężenie substratu (mol/dm

)

- stała Michaelisa-Menten (mol/dm

)

Równanie to jest opisane krzywą hiperboliczną jak na rysunku 2.4. (Marangoni 2003, Lee

1996b).

Rys. 2.4. Zależność
między stężeniem

substratu a szybkością
reakcji enzymatycznej

Wprowadzając to równanie, Michaelis i Menten zdefiniowali nową stałą, zwaną stałą

Michaelisa-Menten K

. Stała ta jest wielkością charakterystyczną dla danego enzymu, zależy

Przegląd literatury – Enzymy

od substratu, na który działa enzym, temperatury i pH, nie zależy natomiast od stężenia

enzymu. Stała Michaelisa jest miarą powinowactwa enzymu do substratu: im wyższa tym

mniejsze powinowactwo. K

to wielkość liczbowa, określająca stężenie substratu (w molach na

litr roztworu), przy którym szybkość reakcji enzymatycznej jest równa połowie szybkości

maksymalnej, osiąganej przy wysyceniu enzymu substratem i niezależnej już od dalszego

wzrostu jego stężenia. Wartość K

jest różna dla poszczególnych substratów danego enzymu,

a dla większości enzymów znajduje się w granicach 10

-5

-10

-2

mol/dm

(Kączkowski 1999, Lee

1996b).

Kolejne czynniki wpływające na aktywność enzymów i szybkość reakcji enzymatycznych

opisano poniżej.

2.1.4. Czynniki wpływające na aktywność enzymów

Jedną z cech enzymów, stwarzającą duże trudności w badaniu ich struktury

i wykorzystaniu w praktyce, jest labilność powodująca inaktywację. Enzymy jako substancje

białkowe łatwo ulegają zmianom struktury pod wpływem takich warunków środowiska jak: pH,

temperatura, stężenie soli, co może wiązać się z utratą ich zdolności do pełnienia funkcji

katalitycznych. Ponieważ w procesie katalizy szczególną rolę odgrywa centrum aktywne

enzymu, ważne dla aktywności enzymu jest, aby konformacja właśnie tego fragmentu

pozostała w naturalnym stanie. Wiadomo jednak, że w skład centrum aktywnego wchodzą

grupy aminokwasów z oddalonych miejsc łańcucha polipeptydowego lub nawet z odrębnych

łańcuchów, dlatego czynniki oddziałujące na budowę całego enzymu mają wpływ na jego

funkcje. Zmiany w konformacji cząsteczki enzymu, uszkodzenie struktury przestrzennej białka

(denaturacja), prowadzą do utraty zdolności katalitycznych. Może to również być spowodowane

zablokowaniem centrum aktywnego, bez rozległych zmian w strukturze całej cząsteczki

(Kączkowski 1999, Zgirski 1999).

Głównymi czynnikami denaturującymi, powodującymi utratę aktywności enzymów są

podwyższona temperatura i pH.

2.1.4.1. Temperatura

Temperatura jest jednym z czynników wpływających istotnie na szybkość reakcji

enzymatycznych. Zgodnie z regułą van’t Hoffa szybkość reakcji wzrasta wraz ze wzrostem

temperatury, jednakże tylko w granicach temperatury, powyżej której rozpoczyna się

denaturacja białka. Szybkość denaturacji cieplnej białek enzymatycznych jest również wprost

proporcjonalna do temperatury, dlatego krzywa zależności szybkości reakcji enzymatycznej od

temperatury posiada najczęściej „optimum” (Rys. 2.5). Za temperaturę optymalną uważa

Przegląd literatury – Enzymy

się taką, przy której reakcja enzymatyczna przebiega najszybciej, ale równocześnie nie

obserwuje się denaturacji białka enzymu (Kączkowski 1999, Whitaker 2003).

Rys. 2.5. Wpływ temperatury na

szybkość reakcji enzymatycznej

Optymalna temperatura działania enzymów zależy od ich pochodzenia. Wartość ta dla

enzymów zwierzęcych znajduje się w pobliżu ciepłoty ciała, enzymy pochodzenia roślinnego

i mikrobiologicznego wykazują duże zróżnicowanie temperatury optymalnej, nawet do 90°C.

Denaturacja termiczna białek enzymatycznych wynika ze zwiększonej ruchliwości

atomów, prowadzącej do rozrywania wiązań stabilizujących strukturę przestrzenną białka oraz

wytwarzania połączeń powodujących przejście konformacji aktywnej cząsteczki w konformację

nieaktywną (Kączkowski 1999).

2.1.4.2. Stężenie jonów wodorowych

Każdy enzym ma optymalne pH działania, w którym szybkość katalizowanej reakcji jest

maksymalna. Niewielkie odchylenia od tej wartości powodują zmniejszenie szybkości reakcji.

Zmiany stopnia dysocjacji grup dysocjujących, występujących w resztach aminokwasowych

łańcucha peptydowego (zwłaszcza w sąsiedztwie centrum aktywnego enzymu) pod wpływem

wahań pH, powodują zmianę układu ładunków, a tym samym struktury trzeciorzędowej białka,

co zmniejsza aktywność enzymu. Większe odchylenia pH od wartości optymalnej prowadzą do

denaturacji białka, w wyniku zakłócania licznych słabych oddziaływań niekowalencyjnych

utrzymujących trójwymiarową strukturę cząsteczki.

Optimum pH dla większości enzymów występuje przy wartościach bliskich odczynu

obojętnego, ale ogólnie istnieje duże zróżnicowanie tej wartości wywołane różnicami

środowiska, w których enzymy działają. Przykładowo, enzym trawienny pepsyna jest

Przegląd literatury – Enzymy w technologii żywności

przystosowany do działania w kwaśnym środowisku żołądka (pH około 2) (Kączkowski 1999,

Whitaker 2003).

2.2. ENZYMY W TECHNOLOGII ŻYWNOŚCI

Człowiek praktycznie wykorzystywał działanie enzymów na długo przed tym, zanim

potrafił uzasadnić je naukowo. Na przykład dojrzewanie mięsa, produkcja napojów

alkoholowych praktykowane były już przez człowieka jaskiniowego. Opis słodowania jęczmienia

i fermentacji piwa znaleziono w dokumentach egipskich sprzed 2500 lat.

Termin „enzym” (z greckiego: w drożdżach) wprowadził do literatury William Kuhne

w 1897 r., po stwierdzeniu, że ekstrakt z komórek drożdży powoduje przemianę glukozy

w alkohol i dwutlenek węgla

(Warchalewski 2001).

Na początku XX wieku rozpoczęto wykorzystywanie enzymów w przetwórstwie żywności

na skalę przemysłową. Druga połowa XX wieku charakteryzowała się wysoką dynamiką

modernizacji procesów technologicznych w produkcji żywności, w której preparowane enzymy

zaczęły odgrywać znaczącą rolę. Wzrost przemysłowego zapotrzebowania na preparaty

enzymatyczne stymulował jednocześnie dynamiczny rozwój ich produkcji. W roku 1990 wartość

wyprodukowanych preparatów wynosiła ponad 600 milionów dolarów, z czego ponad 60 %

zastosowano w technologii żywności. W roku 1995 rynek enzymów sięgnął miliarda dolarów

(Warchalewski 2001).

Na początku XXI wieku trudno znaleźć przykład produkcji żywności przetworzonej bez

udziału preparatów enzymatycznych, a liczba stosowanych enzymów w przetwórstwie

spożywczym jest miarą jego nowoczesności. Jednocześnie produkcja i doskonalenie właściwości

enzymów jest ważnym obszarem działalności współczesnej biotechnologii (Bednarski 1997,

Warchalewski 2001).

2.2.1. Zastosowanie enzymów

Jak wcześniej wspomniano, enzymy są naturalnymi katalizatorami o wysokiej

specyficzności działania, znacznie przyspieszającymi lub wręcz umożliwiającymi zachodzenie

określonych przemian chemicznych w surowcach we względnie łagodnych warunkach. To

głównie te cechy enzymów wpłynęły na ich tak błyskawiczną i wcale nie mającą się ku końcowi

„karierę” w technologii żywności.

Wysoka specyficzność działania enzymów pozwala na sterowanie procesami

produkcyjnymi poprzez przeprowadzanie w danym surowcu przemiany, która na danym etapie

produkcji jest pożądana. Jednocześnie proces enzymatyczny może być łatwo kontrolowany

i przerwany. Łagodne warunki działania większości enzymów pozwalają na zachowanie

w surowcach składników mało odpornych na działanie podwyższonej temperatury (np.

Przegląd literatury – Enzymy w technologii żywności

witamin), co umożliwia otrzymanie produktów o wysokiej wartości żywieniowej. Kolejnymi

cechami enzymów wpływającymi na atrakcyjność ich zastosowania w przemyśle spożywczym

są: nietoksyczność (wynikająca z naturalnego pochodzenia), działanie w małych stężeniach

oraz brak ujemnego wpływu na cechy organoleptyczne produktu (Kączkowski 1999, Reps 2003,

Warchalewski 2001).

W nowoczesnej technologii żywności trudno wyobrazić sobie wytwarzanie wielu

podstawowych produktów żywnościowych, o cechach znanych i akceptowanych przez

konsumentów, bez udziału w procesach technologicznych odpowiednich preparatów

enzymatycznych. Najważniejsze korzyści płynące z ich zastosowania to:

możliwość uruchomienia produkcji nowych asortymentów żywności, w tym żywności

funkcjonalnej o właściwościach probiotycznych,

podniesienie jakości i atrakcyjności oraz wydłużenie trwałości produktów

żywnościowych,

przyspieszenie procesów technologicznych,

możliwość zwiększenia wydajności tradycyjnie stosowanych surowców,

możliwość włączenia do produkcji nowych surowców,

racjonalniejsze wykorzystanie produktów ubocznych,

zmniejszenie kosztów produkcji.

Większość enzymów stosuje się w przetwarzaniu surowców spożywczych jako substancje

pomocnicze. Po zakończeniu procesu są one inaktywowane i nie pełnią żadnej funkcji

w produkcie końcowym (Grajek 1999).

Zastosowanie preparatów enzymatycznych w praktyce jest szerokie, gdyż obejmuje

prawie wszystkie gałęzie przemysłu spożywczego.

Największe zastosowanie znalazły enzymy rozkładające skrobię (enzymy amylolityczne):

amylazy, amyloglukozydazy, glukoamylazy, pullanaza i izomeraza glukozowa. Enzymatyczną

hydrolizę skrobi przeprowadza się podczas wytwarzania maltodekstryn i syropów skrobiowych,

maltozowych i glukozowych, stosowanych m.in. w produkcji odżywek dla niemowląt, wyrobów

cukierniczych i piekarskich, mleka w proszku, sosów, keczupów, zabielaczy do kawy, słodzików,

dżemów. Wysokoscukrzone syropy służą także do otrzymywania karmelu używanego do

barwienia i nadawania specyficznego aromatu i smaku żywności oraz do wytwarzania glukozy

i syropów fruktozowych (Lee 1996a, Grajek 1999, Kączkowski 1999).

W przemyśle owocowym od dziesięcioleci stosowane są enzymy pektynolityczne

(katalizujące rozpad wiązań glikozydowych w pektynach). Główne kierunki ich zastosowania to:

obniżanie lepkości i ułatwianie klarowania soków, zapobieganie żelowaniu koncentratów,

Przegląd literatury – Enzymy w technologii żywności

zwiększanie wydajności tłoczenia soków owocowych i warzywnych, usuwanie pektyn lub

modyfikowanie ich struktury chemicznej (Grajek 1999).

Ważną rolę w przetwórstwie żywności odgrywają także enzymy proteolityczne

(rozkładające wiązania peptydowe). Stosuje się je w przemyśle mięsnym do zmiękczania mięsa

i produkcji hydrolizatów, piwowarskim do zapobiegania zmętnieniu piwa, serowarskim do

koagulacji białek mleka i dojrzewania serów (Kączkowski 1999).

Lista zastosowań preparatów enzymatycznych jest bardzo długa i ma tendencję wyraźnie

rosnącą, a przedstawione w tym punkcie mają charakter przykładowy.

2.2.1.1. Skrobia i enzymy amylolityczne

Skrobia jest głównym roślinnym materiałem zapasowym. Ze względu na

rozpowszechnienie w surowcach roślinnych jest głównym źródłem węglowodanów w diecie

człowieka. Produkty degradacji i modyfikacji enzymatycznej skrobi są szeroko stosowane jako

surowce w przetwórstwie żywności, z czego wynika duże zapotrzebowanie na enzymy

degradujące skrobię – enzymy amylolityczne.

Pod względem budowy chemicznej skrobia jest polisacharydem zbudowanym

z cząsteczek glukozy. Rozróżnia się dwie frakcje skrobi: amylozę i amylopektynę. Amyloza

tworzy proste długie łańcuchy, w których reszty glukozowe są połączone wyłącznie wiązaniami

-1,4-glikozydowymi. Amylopektyna jest tworem rozgałęzionym zbudowanym z krótkich,

prostych łańcuchów połączonych wiązaniami

-1,4-glikozydowymi, powiązanych między sobą

wiązaniami

-1,6-glikozydowymi.

Podstawą klasyfikacji enzymów i nadawania im numerów EC przez Międzynarodową Unię

Biochemii i Biologii Molekularnej (International Union of Biochemistry and Molecular Biology)

jest rodzaj katalizowanego wiązania (Kuriki i Imanaka, 1999). W przypadku grupy enzymów

nazywanych

-amylazami (4-glukanohydrolaza-

-1,4-glukanu, EC 3.2.1.1.) reakcją tą jest

hydroliza wiązania

-1,4-glikozydowego znajdującego się w środku łańcucha w oligo-

i polisacharydach zawierających grupy

-glukozy połączone wiązaniami

-1,4-glikozydowymi.

Występujące w amylopektynach wiązania

-1,6-glikozydowe nie stanowią przeszkody dla

działania tego enzymu (Nielsen i Borchert 2000, Achremowicz i Wójcik 2000). Produktami

działania

-amylaz są dekstryny niskocząsteczkowe. Schematycznie działanie

-amylazy na

amylopektynę przedstawiono na rysunku 2.6.

Przegląd literatury – Enzymy w technologii żywności

cząsteczki maltozy. Wiązania

-1,6-glikozydowe występujące w amylopektynach stanowią

przeszkodę dla działania tych enzymów, więc końcowym produktem reakcji jest maltoza i tzw.

dekstryna graniczna (Rys. 2.7).

Pod względem budowy chemicznej i strukturalnej

-amylazy stanowią charakterystyczną,

jednorodną grupę białek o masie molowej pomiędzy 45 a 60 kDa. Kompletna sekwencja

aminokwasowa łańcucha polipeptydowego jest znana dla ponad pięćdziesięciu rodzajów

-amylaz. Wszystkie składają się z jednego łańcucha polipeptydowego, a w ich strukturze

trzeciorzędowej wyróżnia się dwie główne domeny A i B oraz trzecią, nieregularnie poskręcaną

domenę C (Janeček i Baláž 1992, Kuriki i Imanaka 1999, Lévêque i wsp. 2000). Są to białka

lekko kwaśne (co wynika ze znacznej zawartości kwasu asparaginowego i glutaminowego),

rozpuszczalne w wodzie. Zawierają prawie wszystkie aminokwasy, bogate są w tyrozynę

i tryptofan. Jedynie w amylazie z

Bacillus subtilis

nie wykryto cysteiny i cystyny. Biologiczna

aktywność oraz trwałość

-amylaz jest uwarunkowana zawartością jonów wapniowych

(Achremowicz i Wójcik 2000). Wszystkie

-amylazy są metalo-enzymami zawierającymi

przynajmniej jeden jon Ca

w cząsteczce, który jest istotny dla ich aktywności i stabilności

(Janeček i Baláž 1992).

Dekstrynizująca

-amylaza z

Aspergillus oryzae

(np. Fungamyl 800L firmy

Novozymes A/S), w literaturze nazywana Taka-amylazą A, jest najdawniej i najczęściej

wykorzystywanym enzymem w przemyśle spożywczym, a także jednym z lepiej poznanych

enzymów z grupy

-amylaz. To właśnie produkcji tego enzymu dotyczył pierwszy patent

otrzymywania preparatu enzymatycznego syntetyzowanego przez drobnoustroje uzyskany

w 1894 r. w USA. W piekarstwie enzym ten jest szeroko stosowany, ze względu na

przyspieszanie procesu fermentacji ciasta przez drożdże (Reps 2003, Rutkowski i Sawicka-

Żukowska 2002). Poza tym znalazł szereg zastosowań, np. w browarnictwie, przemyśle

cukierniczym oraz przy produkcji napojów, maltodekstryny, koncentratów spożywczych (Grajek

1999).

Strukturę przestrzenną

-amylazy z

Aspergillus oryzae

przedstawiono na rysunku 2.8. Po

raz pierwszy została ona przedstawiona przez Matsuura i wsp. w 1984 r (Kuriki i Imanaka,

1999). Enzym ten jest zbudowany z 478 grup aminokwasowych w strukturze

pierwszorzędowej, zawiera jeden jon wapnia (Ninomiya i wsp. 2001, Janeček i Baláž 1992).

W strukturze trzeciorzędowej wyróżnia się trzy domeny stabilizowane czterema mostkami

siarczkowymi. W skład centrum aktywnego wchodzą trzy grypy aminokwasowe oddalone od

siebie w łańcuchu polipeptydowym: Asp-206, Glu-230, Asp-297 (Kuriki i Imanaka 1999,

Janeček i Baláž 1992). Optymalna temperatura działania tego enzymu wynosi 50 - 55°C,

a optymalne pH to 4,8 – 5,8 (Achremowicz i Wójcik 2000).

Przegląd literatury – Enzymy w technologii żywności

Rys. 2.8. Struktura przestrzenna

-amylazy z Aspergillus oryzae

2.2.2. Metody produkcji preparatów enzymatycznych

Enzymy mogą być otrzymywane z tkanek roślinnych i zwierzęcych, jednak ze względu na

ograniczenie tych źródeł ich produkcji coraz większego znaczenia nabiera wykorzystywanie

metod biotechnologicznych (Reps 2003). Obecnie zdecydowana większość preparatów enzyma-

tycznych stosowanych w przemyśle spożywczym jest otrzymywana metodą mikrobiologiczną.

Wynika to z możliwości biosyntezy przez mikroorganizmy enzymów o różnej specyficzności przy

niskich kosztach ich wytwarzania (Czapski 2001). Dzięki rozwojowi biotechnologii istnieje także

możliwość otrzymywania nowych preparatów, których nie można było uzyskać ze źródeł

tradycyjnych (Reps 2003). Najczęściej stosowanymi mikroorganizmami są te z gatunków

Bacillus

Aspergillus

W połowie lat 70–tych po raz pierwszy do produkcji enzymów w skali przemysłowej

została wykorzystana inżynieria genetyczna (Czapski 2001). Podstawową przyczyną

prowadzenia ukierunkowanych modyfikacji genów mikroorganizmów odpowiedzialnych za

wytwarzanie enzymów do celów przemysłowych stanowił fakt, że biokatalizatory wytwarzane

przez swych naturalnych producentów zazwyczaj nie wykazywały odpowiednio wysokiej

aktywności i stabilności w warunkach optymalnych z technologicznego punktu widzenia (pH,

temperatura, ciśnienie itp.). Natomiast odpowiednio skonstruowane mikroorganizmy

modyfikowane genetycznie (GMO) mogą wytwarzać enzymy charakteryzujące się wysoką

stabilnością i aktywnością biologiczną. Metodami inżynierii genetycznej doprowadza się do

zmian w budowie strukturalnej białek enzymów, zmieniając także ich cechy, jak

np.: właściwości kinetyczne, termostabilność, temperaturę i pH optymalnego działania,

Przegląd literatury – Enzymy w technologii żywności

stabilność i aktywność w niewodnych roztworach, specyficzność substratową i reakcyjną

(Bednarski 1997, Warchalewski 2001).

Zoptymalizowane biokatalizatory, wytwarzane przez GMO, pozwoliły na podniesienie

wydajności produkcji, obniżenie jej kosztów oraz lepsze wykorzystanie surowców i zmniejszenie

ilości odpadów w wielu gałęziach przemysłu spożywczego. Ułatwiły ponadto produkcję licznych

prozdrowotnych składników żywności (prebiotyki, błonnik pokarmowy itp.). GMO mogą też

wytwarzać z odpowiednią wydajnością wiele enzymów roślinnych i zwierzęcych, których

pozyskiwanie ze źródeł naturalnych jest niewystarczające w stosunku do potrzeb (Kalinowska

i wsp. 2000). Przykładem potwierdzającym osiągnięcia w tej dziedzinie jest wdrożenie

technologii produkcji reniny (której deficyt wynika z ograniczenia uboju cieląt) przez

genetycznie modyfikowane szczepy

Kluyveromyces marxianus

Aspergillus niger, Escherichia

coli

, do genomu których wprowadzono geny trawieńców cielęcych odpowiedzialnych za

biosyntezę wymienionego enzymu (Bednarski 1997, Dajnowiec i wsp. 1997, Warchalewski

2001).

Żywność genetycznie modyfikowana budzi w społeczeństwie wiele obaw. W przypadku

enzymów produkowanych przez mikroorganizmy modyfikowane genetycznie obawy te powinny

być znacznie mniejsze, ponieważ preparaty nie zawierają zmodyfikowanego materiału

genetycznego, a produkt końcowy jest taki sam, jak otrzymany z zastosowaniem tradycyjnych

preparatów enzymatycznych.

2.2.3. Jakość i formy preparatów enzymatycznych

Aby preparaty enzymatyczne mogły właściwie spełniać swoje funkcje w procesie

produkcyjnym, muszą się charakteryzować wysoką jakością. O jakości decyduje ich aktywność,

czyli zdolność do spełniania określonej funkcji biologicznej (Strumiłło i wsp. 1991). Równie

istotną cechą wpływającą na przydatność preparatów jest ich trwałość, która jest ściśle

związana z formą preparatu.

Preparaty materiałów pochodzenia mikrobiologicznego są produkowane w dwóch

podstawowych formach: jako preparaty płynne lub w formie suchej sproszkowanej. Preparaty

w formie płynnej charakteryzują się niską aktywnością jednostkową (zwłaszcza te o niskim

stężeniu) oraz małą trwałością, wynikającą ze znacznej zawartości wody w układzie. Ponadto

ich wadami są: trudności w transporcie i przechowywaniu oraz wysokie koszty tych operacji

(wynikające z dużej objętości), konieczność instalowania kosztownej armatury oraz trudności

w utrzymaniu higieny linii produkcyjnej w miejscu dozowania preparatu.

W porównaniu z tymi preparatami materiały w postaci suchej sproszkowanej lub

unieruchomione na nośnikach odznaczają się wieloma zaletami. Przede wszystkim, dzięki

Przegląd literatury – Suszenie enzymów

usunięciu znacznej ilości wody, uzyskuje się zwiększoną aktywność jednostkową i wysoką

trwałość. Nie występuje też problem transportowania i przechowywania dużych ilości płynu,

przez co koszty tych operacji ulegają zmniejszeniu. Stosowanie tej formy preparatów sprzyja

także utrzymaniu higieny produkcji oraz ułatwia jej automatyzację i mechanizację.

2.3. SUSZENIE ENZYMÓW

Suszeniem nazywa się zespół operacji technologicznych mających na celu obniżenie

zawartości wody w produkcie poprzez jej odparowanie (lub niekiedy sublimację) (Pijanowski

i wsp. 1996). Jest to najstarsza metoda utrwalania żywności, w prymitywnych formach

stosowana już w epoce neolitu.

Suszenie jest procesem równoczesnej wymiany ciepła i masy. Ciepło przemiany fazowej

dostarczane jest z zewnątrz, najczęściej poprzez ogrzewanie konwekcyjne. Siłą napędową

procesu jest różnica między prężnością pary wodnej na powierzchni materiału a prężnością

pary wodnej w otaczającym gazie. Odparowywana woda jest w sposób ciągły usuwana

z otoczenia produktu, najczęściej w wyniku konwekcji, za pomocą tego samego czynnika, za

pomocą którego dostarczane jest ciepło. Proces odparowania rozpoczyna się od

odparowywania wody znajdującej się na powierzchni materiału, do chwili, gdy opory

wewnętrznego ruchu masy zaczynają być większe od oporów konwekcyjnego przenoszenia

masy. Następnie o przebiegu procesu decyduje wewnętrzne przenoszenie masy – woda

zawarta w materiale jest transportowana do powierzchni, a następnie wnika do

przepływającego strumienia gazu (Lewicki 1999b).

Szybkość suszenia można zwiększać poprzez zwiększenie szybkości przepływu gazu,

zwiększanie jego temperatury i obniżanie jego wilgotności (Lewicki 1999b, Pijanowski i wsp.

1996)

Suszenie enzymów jest trudnym zadaniem ze względu na ich termolabilność, wynikającą

z charakteru białkowego, oraz ze względu na zmiany właściwości w czasie suszenia. Metoda

suszenia powinna być dobierana indywidualnie dla każdego enzymu. Pod uwagę muszą być

brane początkowe właściwości enzymu, konieczna jest także znajomość zmian (np. odporności

na podwyższoną temperaturę), jakie powoduje proces suszenia (Witrowa-Rajchert i Samborska

2002, Adamiec i wsp. 1995).

2.3.1. Metody suszenia

Do suszenia materiałów biologicznie czynnych, jakimi są enzymy, mogą być stosowane

różne metody. Możliwość zastosowania tradycyjnego suszenia konwekcyjnego (w tym np.

fluidyzacyjnego) jest w znacznym stopniu ograniczona, ze względu na długi czas procesu

(przebywania materiału w środowisku o podwyższonej temperaturze). Utrudnieniem

Przegląd literatury – Suszenie enzymów

w przeprowadzeniu tego rodzaju suszenia jest również fakt, że enzymy po procesie fermentacji

występują w formie płynnej. Metodą, która w znacznym stopniu umożliwia wyeliminowanie

wpływu podwyższonej temperatury jest suszenie sublimacyjne. Proces ten polega na

usunięciu wody z materiału poprzez jej zamrożenie, a następnie sublimację lodu do pary

wodnej. Proces odwadniania odbywa się przy obniżonym ciśnieniu i może trwać nawet

kilkanaście godzin. Zaletą tej metody suszenia jest dobre zachowanie w produkcie pierwotnych

biologicznych cech surowca, ze względu na to, że materiał nie jest poddawany działaniu

podwyższonej temperatury. Wadami są długi czas oraz wysokie koszty procesu (Pijanowski

i wsp. 1996, Witrowa-Rajchert i Samborska 2002, Mellor i Bell 2003).

W porównaniu z wymienionymi metodami, bardzo atrakcyjną metodą suszenia enzymów

jest suszenie rozpyłowe. W praktyce jest to najczęściej stosowana metoda dehydracji tego

rodzaju materiałów.

2.3.1.1. Suszenie rozpyłowe

Suszenie rozpyłowe jest najbardziej rozpowszechnionym sposobem suszenia żywności

płynnej oraz produkcji stałych preparatów enzymatycznych (Fu i wsp. 1995, Okello i wsp.

1998). Jest to proces prowadzący do otrzymania z wyjściowego płynnego surowca suchego

produktu końcowego w postaci proszku, w wyniku jednej ciągłej i krótkiej operacji. Operacja ta

polega w zasadzie na rozdrobnieniu cieczy do postaci mgły (kropelki o średnicy 10 – 200

m),

która wewnątrz zamkniętej przestrzeni (komory suszarki) styka się z gorącym nienasyconym

powietrzem. Dzięki uzyskanej olbrzymiej powierzchni cieczy woda jest odparowywana w bardzo

krótkim czasie (1 – 20 s).

Bardzo istotnym zjawiskiem obserwowanym w czasie suszenia jest tzw. „efekt

chłodzący odparowania”. Prawie całe ciepło dostarczone do komory suszenia ze

strumieniem gazu suszącego jest zużywane na proces odparowania. Z suszonych cząstek

pobierane jest ciepło przemiany fazowej parującej wody. W rezultacie, pomimo wysokiej

temperatury powietrza wprowadzanego do komory suszarki, temperatura materiału suszonego

jest względnie niska. Przyjmuje się, że temperatura powierzchni suszonych cząstek osiąga

temperaturę termometru mokrego powietrza wylotowego (Van Arsdel 1963, Pijanowski

i wsp. 1996, Adamiec i wsp. 1995, Ståhl i wsp. 2002, Brennan 2003). Ta właściwość suszenia

rozpyłowego sprawia, że metoda ta może być stosowana do suszenia materiałów o małej

odporności na podwyższoną temperaturę, jak np. kultury starterowe bakterii czy enzymy.

Końcowy materiał o wysokiej aktywności można otrzymać tylko po starannym doborze

odpowiednich warunków suszenia do każdego materiału. Najistotniejszymi parametrami są

Przegląd literatury – Suszenie enzymów

temperatura powietrza wylotowego oraz różnica temperatury pomiędzy powietrzem wlotowym

a wylotowym (Belghith i wsp. 2001, Ståhl i wsp. 2002).

Okello i wsp. (1998), susząc rozpyłowo oksydazę polifenolową, stwierdzili, że jej

aktywność zależy od temperatury powietrza wylotowego, a w mniejszym stopniu od
zawartości suchej substancji w wyjściowym surowcu. Przykładowo, aktywność enzymu
wyniosła 86,5 % początkowej aktywności przed suszeniem, gdy temperatura powietrza
wylotowego była równa 80

C, a wzrost temperatury wylotowej do 100

C spowodował

obniżenie aktywności do 18,8 %. Natomiast produkt uzyskiwany w warunkach, gdy
temperatura powietrza opuszczającego suszarkę osiągnęła 120

C charakteryzował się

zerową aktywnością. Wyniki badań przedstawione przez Etzel’a i wsp. (1996) wskazują na
prostoliniową zależność między temperaturą wylotową w czasie suszenia rozpyłowego a
aktywnością suszonej fosfatazy. Enzym ten, suszony w temperaturze powietrza wylotowego
80

C, wykazywał aktywność względną 81 %, w temperaturze 100

C – 45 % a w

temperaturze 120

C – 8,1 %.

Istotnym parametrem jest również wielkość kropel rozpylonego materiału w czasie

suszenia. Wielkość ta jest wynikiem zastosowanego natężenia przepływu surowca przy
wlocie do dysku rozpylającego (lub dyszy) lub prędkości obrotowej dysku, oraz warunkuje
całkowitą wielkość powierzchni odparowania, czas suszenia cząstek, ilość ciepła zużytego na
odparowanie, a przez to temperaturę powietrza wylotowego.

Według Fu i wsp. (1995) inaktywacja enzymów w czasie suszenia rozpyłowego może

być zredukowana poprzez zmniejszanie rozmiaru rozpylanych kropel oraz obniżanie
temperatury powietrza wylotowego. Meerdink i van’t Riet (1991, 1995), porównując dane
dotyczące kinetyki inaktywacji

-amylazy przy różnej zawartości wody z inaktywacją w

czasie suszenia rozpyłowego, stwierdzili, że ta metoda dehydracji jest korzystna do suszenia
tego enzymu. Wynika to z właściwości

-amylazy, która charakteryzuje się zwiększającą

odpornością na podwyższoną temperaturę wraz z obniżaniem zawartości wody. Suszenie
metodą rozpyłową pozwala na otrzymanie aktywnego preparatu enzymatycznego, ponieważ
w czasie szybkiego odparowania osiąga się szybkie przejście przez zakres zawartości wody,
w którym

-amylaza ma niższą termostabilność. Również Sadykow i wsp. (1997) podają, że

podczas suszenia rozpyłowego temperatura, do której może być ogrzewana

-amylaza, bez

powodowania zwiększenia inaktywacji, wzrasta wraz z usuwaniem wody.

Według Ståhl i wsp. (2002) inaktywacja enzymów w czasie suszenia rozpyłowego

zależy głównie od czynników wpływających na temperaturę powietrza wylotowego, która
powinna być utrzymywana na odpowiednio niskim poziomie. Zwiększanie temperatury
powietrza wlotowego oraz zmniejszanie szybkości podawania surowca do dysku
rozpylającego powodują wzrost

Przegląd literatury – Rola wody w procesach fizycznych i biochemicznych

Cząsteczka wody ma charakter dipolowy (polarny, biegunowy). W rogach struktury

tetragonalnej w miejscu atomów wodoru występują resztkowe ładunki dodatnie, a w dwóch

pozostałych rogach ładunki ujemne pochodzące od wolnych par elektronowych atomu tlenu.

Odległość między środkiem a rogiem tetraedru wynosi 0,099 nm (Lewicki 2004).

Występowanie cząstkowych ładunków w rogach przestrzennej tetragonalnej struktury

cząsteczki wody jest przyczyną powstawania interakcji między sąsiadującymi cząsteczkami

wody oraz z różnymi grupami i wiązaniami chemicznymi. Tworzą się słabe ukierunkowane

wiązania o długości 0,26 – 0,30 nm, nazywane wiązaniami wodorowymi (Rys. 2.10). Są

one słabsze niż wiązanie jonowe lub kowalencyjne, lecz silniejsze niż siły przyciągania

międzycząsteczkowego Van der Waalsa, a ich energia wynosi 21 kJ/mol. Tworzenie wiązania

wodorowego jest cechą charakterystyczną atomu wodoru wykazującego powinowactwo do

elektroujemnych atomów jak tlen czy azot, dzielących swe elektrony z wodorem. Ponieważ

w cząsteczce wody występują dwa atomy wodoru i dwie wolne pary elektronowe, jest ona

szczególnie podatna na tworzenie tego typu wiązań – jedna cząsteczka wody może tworzyć

cztery wiązania wodorowe (Pijanowski i wsp. 1996, Pierce 2003).

2.4.1. Aktywność wody

Zawartość wody w produktach spożywczych jest bardzo różna i może wynosić od

zaledwie kilku do blisko 100 %. Już człowiek pierwotny zauważył, że żywność o wysokiej

zawartości wody jest bardziej podatna na zachodzenie niekorzystnych zmian prowadzących do

obniżenia jej jakości i trwałości. Stąd wzięło się suszenie na słońcu. Nieco później zauważono,

że dodatek pewnych substancji, jak sól czy cukier, pomaga zwiększyć trwałość produktów

żywnościowych. Sól była jednym z najcenniejszych minerałów już w epoce neolitu. Praktyczne

zastosowanie takich metod utrwalania żywności jak suszenie i solenie wpłynęło na rozwój

żeglugi morskiej i pozwoliło dowieść ponad wszelką wątpliwość, że Ziemia jest okrągła, że

Pacyfik i Atlantyk to dwa odrębne oceany i że obie Ameryki leżą między nimi (Davies 2001).

Dzisiaj stwierdzenie, że zawartość wody jest głównym czynnikiem wpływającym na

trwałość żywności ma znaczenie jedynie historyczne. Wiadomo, że czynnikiem decydującym

o możliwości zachodzenia niekorzystnych reakcji prowadzących do „psucia” żywności jest

dostępność wody i sposób jej związania, a nie jej bezwzględna ilość (Acker 1969, Ross 2003).

Do określenia stopnia dostępności wody (lub jej powiązania ze składnikami żywności)

najczęściej stosuje się pojęcie aktywności wody, po raz pierwszy zaproponowane przez

Scotta w 1953 r. Aktywność wody

w żywności jest definiowana jako stosunek ciśnienia pary

wodnej nad żywnością

do ciśnienia pary wodnej nad czystą wodą

w tej samej

Przegląd literatury – Rola wody w procesach fizycznych i biochemicznych

2.4.2. Hydratacja i interakcje wody z innymi składnikami

Woda pod względem fizycznym nie stanowi jednorodnej substancji – jej właściwości

zmieniają się na skutek rozmaitych interakcji, zarówno między jej cząsteczkami jak i pomiędzy

cząsteczkami kontaktujących się z nią substancji (Pijanowski i wsp. 1996).

Zjawisko oddziaływania rozpuszczalnika z cząsteczkami substancji rozpuszczonej

nazywane jest solwatacją. Hydratacja jest szczególnym przypadkiem solwatacji,

gdy rozpuszczalnikiem jest woda. Gdy w substancji rozpuszczonej występują grupy polarne,

mechanizm hydratacji jest zdominowany przez tworzenie wiązań wodorowych. Wiązania

wodorowe występujące między cząsteczkami wody są słabsze niż między cząsteczkami wody

i innych substancji o charakterze polarnym lub jonowym (Pijanowski i wsp. 1996).

W roztworach substancji podlegających dysocjacji występują interakcje między jonami

a cząsteczkami wody. Cząsteczki wody, ze względu na swój charakter dipolowy, otaczają

dodatnie i ujemnie jony substancji rozpuszczonej, tworząc dookoła jonów warstwę

hydratacyjną. Silne oddziaływania pomiędzy jonami a cząsteczkami wody powodują, że

cząsteczki wody w tej warstwie są przestrzennie zorientowane. To prowadzi również do

przestrzennego uporządkowania sąsiadujących cząsteczek wody, w rezultacie czego jony są

otoczone przez kilka uporządkowanych warstw wody, nazywanych warstwami hydratacyjnymi.

Pierwsza warstwa hydratacyjna najsilniej związana przez grupy polarne i jonowe nazywana jest

warstwą monomolekularną. Dalsze warstwy są związane coraz słabszymi siłami (Barrow

1973, Pijanowski i wsp. 1996, Lewicki 2004).

Substancje odznaczające się znacznym powinowactwem do wody określane są jako

hydrofilowe. Związki niezawierające grup polarnych i zjonizowanych (jak np. tłuszcze),

a więc obojętne w stosunku do dipolowych cząsteczek wody, nie przyciągają cząsteczek wody –

są one nierozpuszczalne w wodzie i noszą nazwę hydrofobowych (Pijanowski i wsp. 1996).

Oddziaływanie między cząsteczkami wody a substancjami niepolarnymi (lub substancjami

polarnymi zawierającymi grupy niepolarne) ma szczególny charakter i prowadzi do nabycia

przez ciecz struktury podobnej do ciała stałego. Zjawisko to nosi nazwę hydratacji

hydrofobowej (Rys. 2.12) i może być określone jako próba odrzucenia substancji

rozpuszczanej przez rozpuszczalnik (wodę) (Lewicki 2004).

Szczególnie złożone interakcje z wodą wykazują biopolimery (białka, pektyny, skrobia),

które charakteryzują się skomplikowaną strukturą, olbrzymią powierzchnią i zawierają różne

grupy funkcyjne, zarówno hydrofilowe jak i hydrofobowe. Ze względu na małe rozmiary

cząsteczek wody wnikają one do wewnątrz cząsteczek biopolimerów (Pijanowski i wsp. 1996).

Są wbudowywane w ich strukturę za pomocą wiązań wodorowych oraz interakcji jonowych

w przypadku występowania grup dysocjujących. Ponadto, grupy polarne obecne

Przegląd literatury – Rola wody w procesach fizycznych i biochemicznych

w makrocząsteczce tworzą wiązania wodorowe z cząsteczkami wody, tworząc dookoła

warstwę hydratacyjną (Rys. 2.13). W wyniku tych interakcji woda występuje w dwóch stanach.

Woda unieruchomiona wewnątrz cząsteczek biopolimerów nazywana jest wodą strukturalną.

Woda zorganizowana w warstwie hydratacyjnej nazywana jest wodą hydratacyjną.

Ruchliwość cząsteczek w tej warstwie nie jest całkowicie ograniczona. Oddziaływania woda –

biopolimer określają konformację przestrzenną makrocząsteczki i jej ruchliwość w środowisku.

Pełna hydratacja makromolekuł białkowych jest osiągana przy zawartości wody

0,6-0,75 g/g białka (Lewicki 2004). Według Whitaker (2003) enzymy przy pełnej hydratacji

zawierają 170-220 moli wody na 10000 g białka. Lewicki (1999a) podaje, że pełna hydratacja

lizozymu wymaga 360-400 cząsteczek wody na jedną cząsteczkę enzymu.

Rys. 2.12. Interakcje hydrofobowe:

obszar zakreskowany – hydrofobowy
region substancji rozpuszczonej

w wodzie, elipsy – cząsteczki wody

Rys. 2.13. Hydratacja cząsteczki

biopolimeru: elipsy zakreskowane –
woda strukturalna, elipsy niezakres-

kowane – woda hydratacyjna

2.4.2.1. Interakcje w układach trójskładnikowych

Złożone interakcje biopolimerów z wodą stają się jeszcze bardziej skomplikowane, gdy do

układu zostaje wprowadzony jeszcze jeden dodatkowy składnik (ang. „co-solvent”). Dodatki

różnych substancji, jak np. alkoholi wielowodorotlenowych (najczęściej glicerolu i sorbitolu) czy

cukrów (najczęściej sacharozy) są często stosowane w celu zwiększenia stabilności cieplnej

enzymów.

Przegląd literatury – Rola wody w procesach fizycznych i biochemicznych

Timasheff i Arakawa (1989) oraz Timasheff (1993) podają, że substancje trzecie

wprowadzone do wodnego roztworu białka są wykluczane (eliminowane) z obszaru białka.

Dookoła makrocząsteczek białka tworzy się warstwa hydratacyjna uboga w trzecią substancję

rozpuszczoną, która jest wypychana do głównej objętości rozpuszczalnika (wody). Proces taki

nazywany jest

preferencyjną (uprzywilejowaną) hydratacją. Schematyczne

przedstawiono to na rysunku 2.14.

Chociaż występowanie preferencyjnej hydratacji cząsteczek białka i wykluczanie

„co-solwentu” z obszaru warstwy hydratacyjnej jest ogólną regułą występującą w czasie

rozpuszczania substancji trzeciej w wodnym roztworze białka, mechanizm tych procesów różni

się w zależności od charakteru substancji trzeciej.

W przypadku rozpuszczania cukrów i aminokwasów mechanizm ten związany jest

z zaburzeniami napięcia powierzchniowego wody. W miejscu kontaktu między białkiem a wodą

tworzy się powierzchnia międzyfazowa z określonym napięciem powierzchniowym. Substancje

zwiększające to napięcie powierzchniowe (np. cukry) będą wykluczane z obszaru białka zgodnie

z zasadą dążenia każdego układu do minimalnej energii.

Rys. 2.14. Preferencyjna
hydratacja białka w wodnym

roztworze zawierającym
substancje trzecią (alkohol

wielowodorotlenowy lub cukier)

Mechanizm preferencyjnej hydratacji białka w układach zawierających alkohole

wielowodorotlenowe związany jest z interakcjami o naturze chemicznej pomiędzy tymi

substancjami a cząsteczką białka. Interakcje pomiędzy niepolarnymi grupami w cząsteczce

białka a wodą, prowadzące do hydratacji hydrofobowej, są niekorzystne z termodynamicznego

punktu widzenia, gdyż prowadzą do zwiększenia potencjału chemicznego układu. Kontakt grup

niepolarnych białka z wprowadzonym do układu alkoholem wielowodorotlenowym jest jeszcze

bardziej niekorzystny niż kontakt z wodą, w rezultacie czego substancja ta migruje z dala od

Przegląd literatury – Rola wody w procesach fizycznych i biochemicznych

tych regionów, do głównej objętości rozpuszczalnika (wody), wokół cząsteczki białka

pozostawiając warstwę hydratacyjną (Timasheff i Arakawa 1989, Timasheff 1993).

Wpływ preferencyjnej hydratacji białka w roztworach wodnych zawierających substancje

trzecie (tzw. dodatki ochronne) na stabilność termiczną białka (enzymów) przedstawiono

w rozdziale 2.5.2.

2.4.3. Izotermy sorpcji

Ze względu na różne mechanizmy powiązania wody w produktach żywnościowych,

materiały o takiej samej zawartości wody mogą wykazywać różną aktywność wody. Zależność

między zawartością wody a jej aktywnością w produkcie jest przedstawiana w postaci

izotermy sorpcji. Kształt krzywej zależy od właściwości sorpcyjnych produktu. Większość

produktów spożywczych wykazuje typ II izotermy według klasyfikacji Brunauera, o kształcie

sigmoidalnym (Rys. 2.15). Typ III jest charakterystyczny dla cukrów.

Rys. 2.15. Izotermy sorpcji

Przy analizie sorpcji wody za punkt wyjścia przyjmuje się stan zupełnego odwodnienia.

Początkowo woda jest adsorbowana w miejscach hydrofilowych powierzchni produktu. W miarę

wzrastania wilgotności względnej w otoczeniu zaadsorbowana woda może tworzyć teoretyczną

warstwę monomolekularną, gdy wszystkie dostępne miejsca hydrofilowe przyłączą

cząsteczki wody. Jest to model teoretyczny, ponieważ substancja adsorbująca wodę może

tworzyć wewnętrzne wiązania wodorowe i ilość przyłączonych cząsteczek wody w warstwie

monomolekularnej będzie mniejsza niż ilość miejsc hydrofilowych (Pijanowski i wsp. 1996).

Woda zaadsorbowana przy niskiej aktywności wody ma inne właściwości niż czysta woda.

W wyniku silnego związania z grupami hydrofilowymi charakteryzuje się wyższą wartością

ciepła parowania niż czysta woda, jest niedostępna jako rozpuszczalnik i, w większości

przypadków, nie zamarza (Lewicki 1997).

Przegląd literatury – Rola wody w procesach fizycznych i biochemicznych

2.4.4. Stan szklisty

Aktywność i zawartość wody wpływa na trwałość produktów spożywczych również ze

względu na jej uplastyczniający wpływ na składniki żywności znajdujące się w stanie szklistym.

Określenie „stanu szklistego” wywodzi się z nauki o polimerach, ale zastosowanie tej teorii

w naukach o żywności umożliwia wytłumaczenie pewnych zachodzących w niej zmian

fizykochemicznych (Slade i Levine 2002).

Występowanie w stanie szklistym jest cechą charakterystyczną dla pewnych składników

żywności – głównie dla występujących w niej amorficznych polisacharydów, lecz także dla

cukrów niskocząsteczkowych (Schebor i wsp. 1996). Stan szklisty jest osobliwym stanem

materii. Stanowi on substancję sztywną, kruchą i twardą, o lepkości tego samego rzędu co

lepkość ciał stałych (10

Pas). Z punktu widzenia podstawowych właściwości mechanicznych

należy zatem niewątpliwie do ciał stałych. Jednak przejście od stanu ciekłego do stanu stałego

w toku ochładzania lub suszenia nie odbywa się w tym przypadku poprzez proces krystalizacji,

lecz w sposób ciągły przy ciągłym wzroście lepkości (Goerlich 1975).

W temperaturze T

, nazywanej temperaturą przejścia szklistego, stan w jakim

występują składniki ulega zmianie – z twardego, kruchego materiału „szklistego” o bardzo

wysokiej lepkości, do miękkiego lepko-sprężystego „gumowatego” o lepkości około 10

Pas

(Williams i wsp. 1955). Temperatura, przy jakiej zachodzi ta przemiana, jest cechą

charakterystyczną każdej substancji i zależy w dużym stopniu od składu systemu, w jakim ta

substancja się znajduje. Bardzo istotny jest wpływ obecności wody, która uplastycznia stan

szklisty i powoduje znaczne zmniejszanie T

(Ross i Karel 1991, Ross 1995). Wpływ zawartości

wody na temperaturę przemiany szklistej maltodekstryny przedstawia rysunek 2.16. Wartość T

maltodekstryny bezwodnej, wynosząca 188°C, zmniejsza się do 100°C, gdy zawartość wody

jest równa 4 g/100 g s.s. (3,8 % wody), a przy zawartości wody 10 g/100 g s.s. (9,1 % wody)

wynosi 50°C. Na rysunku 2.17. przedstawiono sposób wyznaczania krytycznej, maksymalnej

zawartości wody, powyżej której w określonej temperaturze przechowywania następuje

przemiana szklista prowadząca do niekorzystnych zmian w produkcie.

Właściwości materiału powyżej i poniżej temperatury przejścia szklistego różnią się

zasadniczo. Stan szklisty charakteryzuje się znacznie ograniczoną ruchliwością cząsteczek.

Substraty możliwych reakcji są unieruchomione w szklistej matrycy, więc możliwość

zachodzenia reakcji jest ograniczona. W stanie szklistym nie może zajść krystalizacja

składników amorficznych. Po wzroście temperatury powyżej T

, w wyniku zmniejszenia lepkości

materiału, zwiększa się ruchliwość cząstek i szybkość reakcji. Możliwa jest krystalizacja

składników amorficznych (Ross 1995).

Przegląd literatury – Rola wody w procesach fizycznych i biochemicznych

120

160

200

Zaw artoś ć w ody (g/100 g s .s .)

(

)

Rys. 2.16. Temperatura przemiany

szklistej maltodekstryny (DE = 5)
o różnej zawartości wody (Ross i Karel

1991)

Rys. 2.17. Sposób wyznaczania krytycznej

zawartości wody: temperatura przechowy-
wania (1), odpowiadająca tej temperaturze

aktywność wody, przy której zachodzi
przemiana szklista (2), odpowiadająca jej

zawartość wody (3)

Występowanie składników produktów żywnościowych w stanie szklistym oraz zmiany

właściwości związane z zachodzeniem przemiany szklistej są istotne z punktu widzenia jakości

i trwałości. W przypadku produktów, których ważną cechą jest chrupkość, dla utrzymania tej

cechy konieczne jest zapobieganie możliwości zajścia przemiany szklistej w kierunku materiału

lepko-sprężystego. Ponieważ woda obniża temperaturę przemiany szklistej i przy osiągnięciu

pewnej zawartości wody przemiana ta może nastąpić w temperaturze pokojowej, produkty te

powinny być chronione przed adsorbowaniem wilgoci. Podobnie jest w przypadku proszków,

występujących początkowo w stanie szklistym, w których następuje przemiana szklista

w wyniku chłonięcia wody i obniżania T

. Zajście przemiany szklistej jest niekorzystne,

ponieważ cukry w stanie amorficznym mają wtedy tendencję do krystalizacji prowadzącej do

wydzielania pewnej ilości wody i w efekcie do zbrylania. Możliwość zachodzenia reakcji

prowadzących do obniżenia jakości żywności (jak np. nieenzymatycane brązowienie, reakcje

enzymatyczne) jest znacznie ograniczona w stanie szklistym, ze względu na ograniczenie

ruchliwości cząsteczek (Buitink i wsp. 2000, Ross 1995).

Na rysunku 2.18. przedstawiono wpływ aktywności wody na względną szybkość reakcji

oraz rozwój drobnoustrojów w powiązaniu z występowaniem stanu szklistego.

Przegląd literatury – Inaktywacja cieplna enzymów

Rys. 2.18. Diagram stabilnej

żywności

2.5. INAKTYWACJA CIEPLNA ENZYMÓW

W 1954 r. Lumry i Eyring po raz pierwszy przedstawili model inaktywacji cieplnej

enzymów jako procesu dwuetapowego. W pierwszym etapie następują odwracalne zmiany

w konformacji przestrzennej, prowadzące do nieodwracalnej inaktywacji w etapie drugim:

 →



 →

←

(2.4)

gdzie:

- enzym w stanie natywnym

- enzym w stanie odwracalnie rozwiniętym (ang. „unfolded”)

- enzym nieodwracalnie zinaktywowany (zdenaturowany)

- stała równowagi reakcji

= [U]/[N]

stała szybkości reakcji prowadzącej do nieodwracalnej inaktywacji

Termin „denaturacja” odnosi się zmian konformacyjnych natywnego białka (struktury

II-IV rzędowej) w wyniku zerwania wiązań wodorowych i mostków siarczkowych. Może być

wywołana przez różne oddziaływania (podwyższona temperatura, zmiana pH, detergenty),

które powodują rozpad wiązań wodorowych oraz zanik oddziaływań jonowych i hydrofobowych

stabilizujących strukturę białka (Weder i Belitz 2003). Denaturacja może być procesem

odwracalnym, gdy natywna konformacja łańcucha polipeptydowego jest przywracana po

ustaniu działania czynnika denaturującego. W przypadku, gdy rozwinięta forma łańcucha

polipeptydowego jest stabilizowana poprzez wchodzenie w interakcje z innymi łańcuchami,

Przegląd literatury – Inaktywacja cieplna enzymów

denaturacja jest nieodwracalna (Klibanov 1983). Denaturacja biologicznie aktywnych białek,

a więc i enzymów, jest związana z utratą ich aktywności. Ponieważ centrum aktywne enzymów

składa się z reszt aminokwasowych znajdujących się obok siebie tylko w natywnej

trójwymiarowej strukturze białka, każda ekspozycja na działanie czynników denaturujących,

powodująca rozwinięcie łańcucha polipeptydowego, wywołuje utratę aktywności centrum

aktywnego (Fágáin 1995, Fitter i wsp. 2001).

Najczęstszą przyczyną inaktywacji cieplnej enzymów jest utrata ich natywnej konformacji,

nazywana termodenaturacją. Zachodzi ona na skutek rozwijania aktywnej trzeciorzędowej

struktury białka enzymatycznego do postaci niezorganizowanych łańcuchów polipeptydowych,

w wyniku zwiększonej mobilności cząsteczek w podwyższonej temperaturze.

Przy stałej temperaturze kinetyka inaktywacji niektórych enzymów, w tym

-amylazy,

może być opisana równaniem reakcji pierwszego rzędu (Guiavarc’h i wsp. 2002, Terebiznik

i wsp. 1997):

−

(2.5)

gdzie:

A, A

- aktywność enzymu po i przed ekspozycją na podwyższoną

temperaturę

- stała szybkości reakcji inaktywacji zależna od temperatury (s

-1

)

- czas ekspozycji (s).

Stosując równanie (2.5) można oszacować stałą szybkości reakcji inaktywacji

w temperaturach zastosowanych doświadczalnie. Wartość bezwzględna współczynnika

nachylenia prostych, otrzymanych po opisaniu zależności ln(

A/A

) od czasu za pomocą regresji

prostej, jest równa stałej szybkości reakcji inaktywacji

. Typowy przykład inaktywacji cieplnej

enzymu wykazującej kinetykę reakcji pierwszego rzędu przedstawiono na rysunku 2.19.

Przegląd literatury – Inaktywacja cieplna enzymów

-3

-2

-1

Czas (min)

72.5

73.5

Temperatura [

Rys. 2.19. Przykładowy wykres

ilustrujący inaktywację enzymu
pod wpływem temperatury

Wzrost temperatury powoduje również wzrost stałej szybkości reakcji inaktywacji

Zależność między tymi dwiema wartościami opisuje równanie Arrheniusa:





























−











 −

ref

(2.6)

gdzie:

– stała szybkości reakcji inaktywacji (s

-1

)

– energia aktywacji reakcji inaktywacji (kJ/mol)

– stała gazowa (8,314 J/mol·K )

– temperatura (K)

ref

– temperatura porównawcza (K)

ref

– stała szybkości reakcji inaktywacji w

ref

-1

)

Korzystając z zależności między ln(

) i temperaturą można wyznaczyć energię aktywacji

reakcji inaktywacji. Wykreślając zależność ln(

)

od 1/

i opisując ją równaniem za pomocą

regresji prostej, energia aktywacji jest równa wartości bezwzględnej iloczynu otrzymanego

współczynnika nachylenia prostej i stałej gazowej R. Typowy wykres Arrheniusa

przedstawiający zależność między temperaturą a stałą szybkości reakcji inaktywacji

przedstawiono na rysunku 2.20.

Przegląd literatury – Inaktywacja cieplna enzymów

-3,2

-2,7

-2,2

-1,7

-1,2

0,00292

0,00294

0,00296

0,00298

1/T

Rys. 2.20. Przykładowy wykres

Arrheniusa przedstawiający
zależność między temperaturą

a stałą szybkości reakcji inaktywacji
cieplnej enzymu k

Kinetykę inaktywacji enzymów w czasie obróbki termicznej analizuje się także za pomocą

modelu „biphasic”, zakładającego istnienie dwóch frakcji enzymu – termolabilnej (a

)

i termostabilnej (a

). Obie frakcje podlegają inaktywacji zgodnie z modelem reakcji pierwszego

rzędu niezależnie od siebie (Saraiva i wsp. 1996, Ling i Lund 1978), co jest wyrażone

równaniem:

(

)

(

)

⋅

−

⋅

−

⋅

exp

(2.7)

gdzie:

A, A

- aktywność enzymu po i przed ekspozycją na podwyższoną

temperaturę

- stała szybkości reakcji inaktywacji zależna od temperatury (s

-1

)

- zawartość frakcji enzymu wyrażona w ułamku

czas ekspozycji (s)

indeksy dolne:

l, s

labilna i stabilna frakcja enzymu.

Kinetyka inaktywacji cieplnej enzymów może być również opisana za pomocą klasycznego

modelu czasu śmierci cieplnej (Thermal Death Time), który pierwszy raz zaproponował

Bigelow (1921). Opiera się on na dwóch podstawowych wartościach

, używanych do opisu

wpływu temperatury i czasu działania podwyższonej temperatury na przeżywalność

mikroorganizmów lub inaktywację enzymów.

jest to czas dziesięciokrotnej redukcji, czyli

czas potrzebny, w danej temperaturze, do zmniejszenia ilości żywych mikroorganizmów (lub do

zmniejszenia aktywności enzymu) o 90 %.

Przegląd literatury – Inaktywacja cieplna enzymów

Zależność między wartością

i stałą szybkości inaktywacji

przedstawiana jest

równaniem:

303

(2.8)

Wartość

określa wrażliwość danego układu na zmiany temperatury i jest

definiowana jako wzrost (lub zmniejszenie) temperatury potrzebny do dziesięciokrotnego

zmniejszenia (lub zwiększenia) wartości

. Korzystając z równania (2.9) można obliczyć

wartość

dla dowolnej temperatury, jeżeli znana jest wartość

ref

w temperaturze

porównawczej

ref

oraz wartość









−

⋅

ref

(2.9)

W celu wyznaczenia obu parametrów (

) stosuje się klasyczną metodę dwustopniową

(Van Loey i wsp., 1997a). Najpierw, dla danych eksperymentalnych uzyskanych w różnych

temperaturach, wykreśla się zależność log(

) w funkcji czasu. Wartość parametru

dla

każdej z zastosowanych temperatur jest równa wartości bezwzględnej współczynnika

nachylenia prostej na otrzymanym wykresie. Równania prostych są wyznaczane za pomocą

regresji prostej. W drugim kroku wartość

jest szacowana na podstawie zmian parametru

w zależności od temperatury. Wartość

jest równa wartości bezwzględnej odwrotności

współczynnika nachylenia prostej na wykresie log(

) w funkcji temperatury. Wykres ten

nazywany jest krzywą oporności cieplnej, a równanie prostej jest wyznaczane za pomocą

regresji prostej.

2.5.1. Wpływ aktywności wody na inaktywację cieplną enzymów

Obniżanie aktywności wody w systemie enzymatycznym jest jedną z metod stosowanych

do zwiększenia odporności enzymów na inaktywację cieplną.

Rola wody w strukturze biopolimerów, jakimi są też białka enzymatyczne, ma złożony

charakter. Z jednej strony występowanie tzw. wody strukturalnej jest konieczne i pomocne

w utrzymaniu natywnej aktywnej struktury makrocząsteczki. Z drugiej strony, oddziaływania

woda-biopolimer określają ruchliwość makrocząsteczki w środowisku. Przy wysokiej aktywności

wody zwiększona jest mobilność cząsteczek, prowadząca do zachodzenia zmian

konformacyjnych powodujących denaturację (inaktywację). Zawartość wody niższa niż przy

pełnej hydratacji powoduje, że cząsteczka jest bardziej odporna na zmiany wywołane

czynnikami fizycznymi. A zatem suszenie lub inne metody prowadzące do obniżania aktywności

Przegląd literatury – Inaktywacja cieplna enzymów

wody i zmniejszające mobilność cząsteczek sprawiają, że białko jest mniej podatne na

występowanie niekorzystnych zmian strukturalnych prowadzących do denaturacji. Jednakże,

cząsteczki wody strukturalnej, niezbędne do utrzymania natywnej struktury makrocząsteczki,

muszą być zastąpione cząsteczkami innych substancji (Terebiznik i wsp. 1997, Sun i wsp. 1998,

Lewicki 2004).

Obecność węglowodanów w czasie suszenia enzymów pomaga w utrzymaniu ich

natywnej uwodnionej struktury. Wielu badaczy sugeruje, że cukry i poliole, poprzez tworzenie

wiązań wodorowych, są w stanie zastąpić cząsteczki wody niezbędne do utrzymania struktury

białka. Dodatek cukrów wzmacnia też interakcje hydrofobowe między grupami niepolarnymi,

które są uważane za jedne z najistotniejszych czynników stabilizujących strukturę białka

(Klibanov 1983, Colaco i wsp. 1992).

Jedna z hipotez na temat mechanizmu działania ochronnego obniżonej aktywności wody

na stabilność białka jest związana z właściwościami szklisto-twórczymi węglowodanów

i polimerów w stanie amorficznym. Wiele cukrów (zarówno polisacharydów o długich

łańcuchach jak np. maltodekstryna, jak i niskocząsteczkowych, jak np. trehaloza) po suszeniu

występuje w stanie szklistym. Jak wcześniej wspomniano, stan ten charakteryzuje się bardzo

wysoką lepkością rzędu 10

Pa·s oraz, co za tym idzie, znacznie ograniczoną ruchliwością

cząsteczek (Noel i wsp. 1990). W wyniku zmniejszenia ruchliwości cząstek znacznemu

zmniejszeniu ulegają szybkości reakcji, w tym reakcji inaktywacji (Cardona i wsp. 1997).

Ponieważ denaturacja (inaktywacja) białka jest wynikiem zmian w konformacji przestrzennej,

stan szklisty, w którym możliwość zajścia tych zmian jest znacznie ograniczona, wpływa

korzystnie na stabilność enzymów (Mazzobre i wsp. 1997, Schebor i wsp. 1996).

Guiavarc’h i wsp. (2002), badając odporność cieplną

-amylazy z

Bacillus licheniformis

stwierdzili, że jest ona ściśle związana z aktywnością wody i jej zawartością w systemie

enzymatycznym. Czas potrzebny do obniżenia początkowej aktywności

-amylazy o 90 %

w systemie o równowagowej wilgotności względnej 78,57

0,52 % w temperaturze 116°C

wynosił 72,05

9,59 min. Po zwiększeniu równowagowej wilgotności względnej do

85,09

0,26 % czas ten zmniejszył się do 42,28

2,21 min. Podobną zależność przedstawili

Meeridnk i Van’t Riet (1991). Stała szybkości reakcji inaktywacji

-amylazy z

Bacillus

licheniformis

w temperaturze 105,5°C zmniejszyła się z 0,046 do 0,006 min

-1

po zmniejszeniu

zawartości wody z 1,86 do 0,09 g H

O/g s.s.

2.5.2. Wpływ dodatków stabilizujących na inaktywację cieplną enzymów

Substancje dodatkowe, takie jak cukry i alkohole wielowodorotlenowe, stosuje się w celu

zwiększenia stabilności cieplnej enzymów występujących w formie ciekłej. Według Klibanova

Przegląd literatury – Inaktywacja cieplna enzymów

(1983) dodatek tych substancji do wodnych roztworów enzymów wzmacnia hydrofobowe

interakcje pomiędzy niepolarnymi grupami aminokwasowymi, które, razem z wiązaniami

wodorowymi, interakcjami jonowymi i siłami van der Waalsa, odgrywają istotną rolę

w utrzymaniu natywnej, katalitycznie aktywnej struktury enzymów. Wzmacnianie tych

oddziaływań usztywnia makrocząsteczki białka i czyni je bardziej odpornymi na termiczną

denaturację.

Lee i Timasheff (1981) podają, że mechanizm stabilizacji enzymów w roztworach

wodnych w obecności cukrów i alkoholi wielowodorotlenowych jest działaniem

„niekierunkowym”, tzn. dodatki te nie zmieniają konformacji i struktury białka, lecz

fizykochemiczne właściwości całego systemu (np. strukturę rozpuszczalnika, czyli wody), które

to zmiany prowadzą do stabilizacji białka.

Jak przedstawiono w rozdziale 2.4.2.1., cząsteczki białka w roztworze wodnym po

wprowadzeniu do niego substancji trzeciej podlegają preferencyjnej hydratacji. Oznacza to, że

substancje trzecie wprowadzone do wodnego roztworu białka są wykluczone (eliminowane)

z obszaru białka, a dookoła makrocząsteczek białka tworzy się warstwa hydratacyjna uboga

w trzecią substancję rozpuszczoną, która jest wypychana do głównej objętości rozpuszczalnika

(wody).

Jak wcześniej wspomniano, tworzenie warstwy hydratacyjnej zwiększa potencjał

chemiczny i wolną energię układu, co jest niekorzystne z termodynamicznego punktu widzenia.

Zapobieganie układu dalszemu zwiększaniu, i tak już powiększonego, potencjału chemicznego

jest przyczyną działania ochronnego wyżej wymienionych dodatków na białka enzymatyczne.

Inaktywacja (denaturacja) enzymów wiąże się ze zmianą konformacji przestrzennej białka,

rozwinięciem natywnej struktury i zwiększeniem powierzchni makrocząsteczki. W przypadku

zaistnienia takich zmian konformacyjnych w układzie trójskładnikowym (woda, białko i cukier

lub alkohol wielowodorotlenowy) zwiększeniu ulega również warstwa hydratacyjna otaczająca

makrocząsteczkę białka (Rys. 2.21), co wiąże się również z dalszym zwiększeniem potencjału

chemicznego. Aby temu zapobiec równowaga reakcji

↔

(równanie 2.4) przesuwa się

w lewo, w stronę natywnej konformacji enzymu (Timashef 1993).

Przegląd literatury – Inaktywacja cieplna enzymów

Rys. 2.21. Hydratacja
preferencyjna białka w stanie

natywnym i zdenaturowanym,
w roztworze wodnym

zawierającym trzecią
substancję rozpuszczoną

Combes i wsp. (1992) oraz Graber i Combes (1989) przedstawiają odmienną teorię na

temat mechanizmu stabilizacji enzymów (

-amylazy) przez alkohole wielowodorotlenowe,

według której substancje te wchodzą w bezpośrednie interakcje z cząsteczką białka,

a w niewielkim stopniu wpływają na stopień organizacji wody. Graber i Combes (1989)

stwierdzili, że alkohole wielowodorotlenowe są inhibitorami współzawodniczącymi

-amylazy

i ich interakcje z centrum aktywnym enzymu odgrywają decydującą rolę w stabilizacji tego

enzymu. Ponadto, efekt stabilizacyjny jest związany z ilością grup wodorotlenowych

w cząsteczce substancji stabilizującej, jako że podobieństwo

-amylazy do alkoholi

wielowodorotlenowych wzrasta wraz ze wzrostem ilości tych grup w cząsteczce.

Timasheff i Arakawa (1989) sugerują, że całkowity efekt stabilizujący alkoholi

wielowodorotlenowych na aktywność enzymów ma mechanizm pośredni między dwoma wyżej

przedstawionymi, z przewagą mechanizmu preferencyjnej hydratacji.

Ludikhuyze i wsp. (1997), badając odporność cieplną

-amylazy z

Bacillus subtilis,

stwierdzili, że była ona znacznie zwiększona w wyniku dodatku glicerolu. Stała szybkości reakcji

inaktywacji

w temperaturze 80°C zmniejszyła się z 0,114 do 0,031 min

-1

po zastosowaniu

15 %-owego dodatku glicerolu. Ochronny wpływ glicerolu, innych alkoholi wielowodoro-

tlenowych oraz cukrów na stabilność cieplną pektynoesterazy (PME) wyekstrahowanej

z pomidorów odmiany

Lycopersicon esculentum

przedstawili Guiavarc’h i wsp. (2003). Dodatek

sacharozy (500 mg/ml) do buforowego roztworu enzymu spowodował zwiększenie czasu

dziesięciokrotnej redukcji PME w temperaturze 65°C z 39,5 minut (gdy enzym rozpuszczono

tylko w roztworze buforowym) do 232,5 minut. Taki sam dodatek trehalozy spowodował

zwiększenie czasu dziesięciokrotnej redukcji do 312,1 minut w tej samej temperaturze.

W dostępnej literaturze sugeruje się, że efekt stabilizujący alkoholi wielowodorotlenowych

i cukrów związany jest z liczbą grup OH w cząsteczce danej substancji (Busto i wsp. 1999,

Przegląd literatury – Inaktywacja cieplna enzymów

Graber i Combes 1989) lub z ogólną liczbą grup OH w danym roztworze (Noel i Combes 2003,

Guiavarc’h i wsp. 2003). W cytowanej powyżej pracy Guiavarc’h i wsp. (2003) stwierdzili, że

ogólna liczba grup OH w roztworach była związana z ich efektem ochronnym, bez względu na

rodzaj substancji zapewniającej źródło grup OH. Autorzy stwierdzili, że stabilność cieplna

pektynoesterazy może być przewidywana na podstawie znajomości liczby grup OH w danym

systemie.

2.6. PODSUMOWANIE

W powyższym rozdziale przedstawiono ogólną charakterystykę enzymów oraz ich

zastosowania w przetwórstwie żywności, ze szczególnym uwzględnieniem

-amylazy.

Przedstawiono proces suszenia, jako metodę utrwalania enzymów. Szczególnie zwrócono

uwagę na proces suszenia rozpyłowego, jako metodę charakteryzującą się cechami

wpływającymi na jej przydatność do suszenia enzymów.

Opisano wpływ interakcji wody i innych składników z cząsteczkami białka

enzymatycznego, jako wpływające na strukturę i aktywność enzymów. W sposób szczególny

zwrócono uwagę na wpływ aktywności i zawartości wody oraz dodatków stabilizujących na

stabilność enzymów. Przedstawiono mechanizmy stabilizacji enzymów w różnych środowiskach,

wskazując na wpływ obniżonej mobilności cząsteczek w warunkach niskiej zawartości wody,

możliwość wpływu stanu szklistego oraz wpływ liczby grup OH pochodzących z substancji

stabilizujących. Omówiono modele kinetyczne inaktywacji enzymów.

Cel i zakres pracy

3. CEL I ZAKRES PRACY

Celem pracy było zbadanie możliwości zastosowania suszenia rozpyłowego do suszenia

płynnego preparatu

-amylazy pochodzenia pleśniowego (

Aspergillus oryzae

). Cel ten

realizowano określając w części pierwszej:

wpływ strumienia surowca oraz temperatury powietrza suszącego na przebieg

suszenia rozpyłowego,

wpływ strumienia surowca oraz temperatury powietrza suszącego na końcową

aktywność otrzymanego preparatu enzymatycznego.

W celu wyjaśnienia otrzymanych w części pierwszej zależności, w drugiej części pracy

prowadzono eksperymenty mające na celu określenie:

wpływu zawartości wody w roztworach zawierających badany enzym (systemy

o wysokiej zawartości wody) na kinetykę inaktywacji cieplnej preparatu

-amylazy,

wpływu zawartości wody w proszkach zawierających badany enzym (systemy o

niskiej zawartości wody) na kinetykę inaktywacji cieplnej preparatu

-amylazy.

W części trzeciej pracy badano wpływ dodatków stabilizujących (alkoholi

wielowodorotlenowych i cukrów) na kinetykę inaktywacji cieplnej preparatu

-amylazy, testując

hipotezę zakładającą, że efekt stabilizujący zależy od liczby grup hydroksylowych w cząsteczce

zastosowanego dodatku lub od ogólnej liczby tych grup w roztworze.

Metodyka badań – Materiały

4. METODYKA BADAŃ

4.1 MATERIAŁY

4.1.1. Preparat

-amylazy Fungamyl 800L

Podstawowym materiałem do badań był płynny preparat enzymatyczny

-amylazy

(4-glukanohydrolazy-

-1,4-glukanu, EC 3.2.1.1.) o nazwie handlowej Fungamyl 800L,

produkowany przez firmę Novozymes A/S ze specjalnie wyselekcjonowanych szczepów

Aspergillus oryzae

(Sigma Aldrich, Niemcy).

Aktywność enzymu gwarantowana przez producenta wynosiła 800 FAU/g. 1 FAU (Fungal

-Amylase Unit) jest to ilość enzymu, która rozkłada 5,26 g suchej substancji skrobi w czasie

godziny w warunkach standardowych (pH 4,7; temperatura 37°C). Gęstość roztworu wynosiła

1,2 g/cm

. Po uwzględnieniu aktywności enzymu i gęstości preparatu obliczono, że

w 1

l preparatu zawarta jest jedna jednostka aktywnego enzymu – 1 FAU.

Preparat enzymatyczny przechowywano w temperaturze 4°C.

4.1.1.1. Oznaczenie masy molowej białka enzymatycznego

Do oznaczenia masy molowej białka enzymatycznego stosowano elektroforezę płytową

w żelu poliakryloamidowym (polyacrylamide gel electrophoresis – PAGE) w obecności

dodecylo-siarczanu sodu (SDS). Zasada metody SDS PAGE po raz pierwszy została

przedstawiona przez Laemmliego w 1970 i od tamtego czasu jest to najpowszechniejsza

metoda do oznaczania masy molowej białek (Holme i Peck 1990).

Zasada metody

Elektroforeza jest zjawiskiem przesuwania się naładowanych cząstek w stosunku do

nieruchomego ośrodka pod działaniem pola elektrycznego. Białko poddawane jest działaniu

czynnika redukującego w celu usunięcia wiązań dwusiarczkowych. Następnie stosowany jest

silny detergent anionowy (SDS), który zrywa wiązania niekowalencyjne w białku, co prowadzi

do rozfałdowania łańcucha polipeptydowego. Cząsteczki SDS (1 cząsteczka SDS na

2 aminokwasy) wiążą się ze szkieletem polipeptydowym dzięki hydrofobowemu łańcuchowi

alkilowemu. Zdenaturowane białko wykazuje wypadkowy ładunek ujemny proporcjonalny do

jego masy cząsteczkowej. W czasie rozdziału elektroforetycznego jego ruchliwość zależy od

masy cząsteczkowej.

Materiały i aparatura

żel poliakryloamidowy PhastGel Homonegous 20,

roztwór buforowy SDS i

-merkaptoetanolu,

Metodyka badań – Materiały

wzorce masy cząsteczkowej – mieszanina białek standardowych 14-97 kDa

(Amersham Pharmacia Biosciences, Szwecja),

aparat do elektroforezy Phast System (Amersham Pharmacia Biosciences, Szwecja).

Wykonanie oznaczenia

Do odpowiednio rozcieńczonego (1:10) roztworu preparatu enzymatycznego (5

l) oraz

białek standardowych (5

l) dodawano roztwór buforowy (1,5

l), zawierający SDS

-merkaptoetanol. Mieszano poprzez wirowanie w mikrowirówce (1000 rpm/min, 1 min.,

4°C). Ogrzewano w temperaturze 100°C przez 5 minut, mieszano i chłodzono w mikrowirówce

(1000 rpm/min, 1 min., 4°C). Próbki przenoszono na żel poliakryloamidowy i prowadzono

rozdział elektroforetyczny w aparacie do elektroforezy Phast System. Po zakończeniu rozdziału

żel wybarwiano barwnikiem srebrowym w celu uwidocznienia białek.

Interpretacja wyników oznaczenia

Bezpośrednio po zakończeniu oznaczenia obraz otrzymany na żelu skanowano. Masę

molową białka enzymatycznego zawartego w preparacie Fungamyl 800L określano na

podstawie porównania jego ruchliwości elektroforetycznej z ruchliwością wzorców masy

cząsteczkowej, przy użyciu programu komputerowego Amersham Pharmacia Biosciences.

4.1.1.2. Oznaczenie zawartości białka

Zawartość białka w preparacie enzymatycznym oznaczano zmodyfikowaną metodą

Lowry’ego i współpracowników (Smith i wsp. 1987).

Zasada metody

Pod wpływem działania białka jony miedzi Cu

ulegają redukcji do jonów Cu

, które

reagując z kwasem 2,2’-bichinidino-4,4’-dikarboksylowym tworzą barwne purpurowe

kompleksy. Intensywność koloru, mierzona przy długości fali 562 nm, zależy wprost

proporcjonalnie od ilości białka.

Odczynniki i aparatura

rozwór kwasu 2,2’-bichinidino-4,4’-dikarboksylowego (Sigma-Aldrich, Niemcy),

4 %-owy roztwór CuSO

·5H

O (Sigma-Aldrich, Niemcy),

standardowy roztwór albuminy bydlęcej (bovine serum albumin BSA, 1 mg/cm

Sigma-Aldrich, Niemcy),

rozcieńczony roztwór preparatu enzymatycznego Fungamyl 800 L (20

l/10 cm

O),

cieplarka 60°C,

spektrofotometr Ultrospec 2100pro (Amerscham Biosciences).

Metodyka badań – Materiały

Wykonanie oznaczenia

W celu wyznaczenia krzywej wzorcowej – zależności między ilością białka a absorbancją

przygotowano po 50

l pięciu roztworów białka wzorcowego o zawartości BSA: 0; 0,25; 0,5;

0,75 i 1 mg/cm

. Równocześnie przygotowano 50

l roztworu enzymu Fungamyl w czterech

powtórzeniach (próby pełne). Do roztworów białka standardowego i białka oznaczanego

dodano równocześnie po 1 cm

reagentu (będącego mieszaniną 1 cm

4 %-owego roztworu

CuSO

·5H

O i 50 cm

kwasu 2,2’-bichindino-4,4’-dikarboksylowego). Mieszaniny białka

standardowego i preparatu Fungamyl 800 L z reagentem inkubowano 15 minut

w temperaturze 60°C, a następnie chłodzono 5 minut w temperaturze 4°C. Dokonywano

pomiaru absorbancji w temperaturze 25°C przy długości fali 562 nm w spektrofotometrze.

Wykonano również próbę ślepą, uwzględniającą absorbancję roztworu Fungamyl bez działania

reagentu. Do 50

l roztworu preparatu enzymatycznego Fungamyl 800 L dodano 1 cm

wody

zamiast reagentu i inkubowano równocześnie z wykonaniem właściwego oznaczenia.

Interpretacja wyników oznaczenia

Na podstawie otrzymanych wyników wykreślano krzywą wzorcową i wyznaczano jej

równanie za pomocą regresji prostej. Obliczono średnią absorbancję z czterech powtórzeń prób

pełnych, odjęto absorbancję próby ślepej i obliczono zawartość białka w badanej próbce

z równania krzywej wzorcowej.

4.1.1.3. Oznaczenie zawartości suchej substancji

W naczynkach wagowych o znanej masie umieszczano próbki badanego materiału

i ważono. Pozostawiano w temperaturze 105°C na 4 godziny i ponownie ważono. Wszystkie

ważenia wykonywano z dokładnością do 0,00001 g. Zawartość suchej substancji

w badanej próbce obliczano ze wzoru:

100

⋅

−

(4.1)

gdzie:

- zawartość suchej substancji (%)

- masa pustego naczynka wagowego (g)

- masa naczynka wagowego z próbką przed suszeniem (g)

- masa naczynka wagowego z próbką po suszeniu (g)

Metodyka badań – Suszenie rozpyłowe

-amylazy

4.1.2. Maltodekstryna

W pierwszej części badań (eksperymenty suszarnicze) stosowano maltodekstrynę

o niskim stopniu scukrzenia, o zawartości grup redukujących odpowiadającej 9 % glukozy

(DE 9), produkowaną przez Szczecińskie Przedsiębiorstwo Przemysłu Ziemniaczanego

„Nowamyl” S.A. W drugiej części badań (badanie kinetyki inaktywacji cieplnej) stosowano

maltodekstrynę o zawartości grup redukujących odpowiadającej 4-7 % glukozy (DE 4-7),

produkowaną przez Sigma-Aldrich (Niemcy).

Zawartość suchej substancji w maltodekstrynie oznaczono zgodnie z PN-71/74700.

4.2. SUSZENIE ROZPYŁOWE PREPARATU

-AMYLAZY

Na podstawie dostępnej literatury (Meerdink i van’t Riet 1991 i 1995) określono, że jako

nośnik, który wykorzystywano do suszenia preparatu

-amylazy, zastosowano maltodekstrynę

(DE 9). Zawartość wody w roztworze poddawanym suszeniu wynosiła 3,5 g H

O/g s.s.

Stosowano dodatek 110 ppm CaCl

(110 mg CaCl

/kg s.s. maltodekstryny), jako substancji

stabilizującej. Ilość preparatu enzymatycznego w roztworze poddawanym suszeniu wynosiła

920 mg Fungamyl/kg s.s. maltodekstryny. Skład roztworu poddawanego suszeniu był

następujący: 200 cm

wody destylowanej; 66,5 g maltodekstryny; 0,055 g preparatu Fungamyl

oraz 0,14 cm

0,43 M roztworu CaCl

Do suszenia rozpyłowego stosowano laboratoryjną suszarkę Anhydro (Dania 1973).

Schemat urządzenia przedstawiono na rysunku 4.1.

Suszenie rozpyłowe przeprowadzano przy stałej prędkości dysku rozpylającego równej

39000 obr/min. Suszenie przeprowadzono w trzech powtórzeniach w każdej z czterech

temperatur powietrza wlotowego: 160, 180, 200 i 220°C i przy czterech strumieniach surowca:

0,4; 0,8; 1,3 i 1,7 cm

/s.

Po wyborze warunków suszenia sprawdzano właściwe połączenie wszystkich przewodów

i montowano pojemnik na proszek pod cyklonem. Włączano urządzenie głównym

przełącznikiem, co powodowało uruchomienie wentylatora. Włączano odpowiednią ilość grzałek

elektrycznych nagrzewających powietrze wlotowe. Po ustaleniu się temperatury powietrza

wlotowego na stałym, założonym poziomie, regulatorem obrotów włączano dysk rozpyłowy

i doprowadzano z zadaną prędkością wodę destylowaną w celu ustalenia równowagi

temperaturowej w komorze suszenia. W wyniku odparowania wody zmniejszała się

temperatura powietrza wylotowego. Po ustaleniu tej temperatury na stałym poziomie do dysku

rozpylającego doprowadzano właściwy roztwór przeznaczony do suszenia. Dozę preparatu

enzymatycznego dodawano do tego roztworu tuż przed rozpoczęciem suszenia. Mierzono czas

suszenia określonej objętości roztworu. W czasie trwania procesu nie dopuszczano do

Metodyka badań – Suszenie rozpyłowe

-amylazy

zapowietrzenia przewodu dostarczającego surowiec do komory suszenia, co mogłoby zmienić

warunki temperaturowe procesu. Temperatura powietrza wlotowego i wylotowego utrzymywała

się na stałym poziomie. Po zakończeniu suszenia właściwego roztworu wyłączano grzałki

elektryczne, a do dysku rozpylającego ponownie doprowadzano wodę destylowaną w celu

oczyszczenia dysku i uniknięcia przegrzania urządzenia przy zatrzymywaniu. Po obniżeniu się

temperatury powietrza wlotowego do 130°C zatrzymywano dopływ wody a po obniżeniu do

80°C zmniejszono do zera obroty dysku i wyłączano suszarkę. Proszek odbierano z pojemnika

pod cyklonem. Podczas właściwego suszenia mierzono wilgotność powietrza otaczającego

i wylotowego za pomocą psychrometru Assmana.

Rys. 4.1. Schemat
suszarki rozpyłowej:

1 - Pompa perystaltyczna
2 - Dysk rozpylający

3 - Komora suszenia
4 - Cyklon

4.2.1. Charakterystyka otrzymanych suszy

4.2.1.1. Oznaczenie aktywności

-amylazy

Stosowano metodę będącą połączeniem znanej metody Sandstesta, Kneena, Blisha (SKB)

(Praca zbiorowa 2001) i metody przekazanej przez firmę Novozymes. Jako metodę nadrzędną

przyjęto metodę Novozymes, zgodnie z którą wykonywano odczynniki, ustalano standardowe

warunki reakcji oraz ilości substratów biorących w niej udział. Zmieniono sposób

przeprowadzania pomiarów. Zamiast zalecanego przez Novozymes wykonywania kolejnych

Metodyka badań – Suszenie rozpyłowe

-amylazy

pomiarów w czasie aż do osiągnięcia danego poziomu wyniku, przyjęto (zgodnie z metodą SKB)

czas reakcji, po którym dokonywano pomiaru.

Zasada metody

Aktywność

-amylazy określano na podstawie ilości skrobi rozłożonej w czasie reakcji

enzymatycznej w warunkach standardowych. Ilość rozłożonej skrobi mierzono na podstawie

zmiany intensywności zabarwienia mieszaniny reakcyjnej z jodem, po 15 minutach działania

enzymu w pH 4,7 i temperaturze 37°C, w obecności jonów wapnia. Jako substrat reakcji

stosowano maltodekstrynę niskoscukrzoną – tę samą, której używano do suszenia

rozpyłowego.

Odczynniki:

roztwór 0,43 M CaCl

pH 7,0 (1). Odważano 47,7 g CaCl

, dodawano około 900 cm

wody destylowanej, ustalano pH na 7,0 przy użyciu HCl, dopełniano do 1000 cm

wodą destylowaną

podstawowy roztwór jodu (2). 11 g jodu krystalicznego rozpuszczano w 60 cm

wody

destylowanej, dodawano 22 g KJ, dopełniano wodą do 500 cm

roboczy roztwór jodu (3). Do 1 cm

podstawowego roztworu jodu (2) dodawano 10 g

KJ, dopełniano wodą destylowaną do 250 cm

0,1 M HCl (4)

buforowy roztwór soli (5). Odważano 9,36 g NaCl; 69 g KH

; 9,6 g

HPO

·12H

O, dopełniano wodą do 1000 cm

, ustalano pH na 5,2 przy użyciu HCl

lub NaOH

roztwór substratu (6) – maltodekstryny. Odważano ilość maltodekstryny

odpowiadającą 6,95 g s.s., przenoszono ilościowo do kolby miarowej na 1000 cm

dodawano 100 cm

buforowego roztworu soli, dopełniano do 1000 cm

wodą,

ustalano pH na 4,7.

roztwór preparatu enzymatycznego (7). Aby otrzymać odpowiedni stosunek enzymu

do substratu enzym musiał być rozcieńczony do około 0,1 FAU/cm

. Jako

rozpuszczalnika stosowano roztwór CaCl

i wody w stosunku 1:100. Odmierzano

0,1 cm

enzymu, przenoszono do kolby miarowej na 100 cm

zawierającej 1 cm

roztworu CaCl

, dopełniano do kreski wodą i mieszano.

Dodatek enzymu do oznaczenia aktywności enzymu płynnego dobrano tak, aby

oznaczenie odbywało się w warunkach wysycenia enzymu substratem, co oznacza, że nawet

Metodyka badań – Suszenie rozpyłowe

-amylazy

= 0,9939

0,0

0,2

0,4

0,6

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Zawartość skrobi (g s.s./dm

)

cja

Rys. 4.3. Krzywa wzorcowa

ilustrująca zależność między
zawartością skrobi

a absorbancją

Wykonanie oznaczenia – płynny preparat enzymatyczny

Do trzech zlewek odmierzano po 20 cm

roztworu substratu (6) i po 8 cm

wody

destylowanej. Dwie z nich (próby pełne) wstawiano do łaźni wodnej o temperaturze 37°C na

15 minut w celu ustalenia się temperatury, po czym dodawano po 0,1 cm

roztworu preparatu

enzymatycznego (7), a do trzeciej (próba ślepa) taką samą ilość wody. Mieszano i inkubowano

15 minut. W czasie inkubacji odmierzano do dwóch kolb po 25 cm

0,1 M roztworu HCl (4),

a do trzech następnych po 5 cm

roboczego roztworu jodu (3). Po inkubacji całość mieszaniny

reakcyjnej prób pełnych przenoszono ilościowo do kolb zawierających HCl, a do próby ślepej

dodawano taką samą ilość wody. Mieszano, przenoszono po 1 cm

mieszaniny wszystkich

próbek do kolb zawierających roztwór jodu (3). Dokonywano odczytu w spektrofotometrze przy

długości fali 570 nm, nastawionym na zero wobec wody.

Wykonanie oznaczenia – suszony preparat enzymatyczny

Stosunek ilości suchej substancji maltodekstryny do ilości enzymu w suszach był taki sam

jak stosowany przy oznaczeniu płynnego preparatu enzymatycznego – tzn. uwzględniał

maksymalną ilość substratu, jaka może być rozłożona przez daną ilość enzymu w określonym

czasie. Dlatego do oznaczenia aktywności suszonego preparatu enzymatycznego wystarczyło

odważyć odpowiednią ilość proszku, aby otrzymać materiał do oznaczenia zawierający enzym

i substrat w odpowiednim stosunku wagowym.

Odważano ilości suszu odpowiadające 0,139 g s.s. w trzech powtórzeniach (dwa

powtórzenia próby pełnej i próba ślepa). Przygotowywano środowisko reakcji enzymatycznej,

czyli roztwór soli (5) z dodatkiem roztworu CaCl

(1) i ustalano pH na 4,7. Ponieważ

równocześnie oznaczano aktywność enzymu w kilku suszach, ilość przygotowywanej

Metodyka badań – Suszenie rozpyłowe

-amylazy

mieszaniny była iloczynem wartości potrzebnych do oznaczenia jednego suszu w jednym

powtórzeniu, czyli: 26 cm

wody destylowanej, 2 cm

roztworu soli (5), 0,001 cm

roztworu

CaCl

(1). Do oznaczenia aktywności

-amylazy w jednym suszu do dwóch zlewek odmierzano

po 28 cm

przygotowanej mieszaniny. Wstawiano do łaźni wodnej o temperaturze 37°C na

15 minut. Dodawano wcześniej odważone ilości suszu, dokładnie mieszano bagietką

i inkubowano przez 15 minut. W czasie inkubacji do dwóch kolb odmierzano po 25 cm

0,1 M

roztworu HCl (4), a do trzech następnych po 5 cm

roboczego roztworu jodu (3). Po inkubacji

całość mieszaniny reakcyjnej przenoszono ilościowo do kolb zawierających HCl, mieszano,

przenoszono 1 cm

roztworu do kolb zawierających roztwór jodu. Próbę ślepą wykonywano

poprzez wsypanie odważonej ilości suszu do 53 cm

wody destylowanej, dokładne wymieszanie

i natychmiastowe przeniesienie 1 cm

mieszaniny do trzeciej kolby z jodem.

Dokonywano odczytu w spektrofotometrze przy długości fali 570 nm, nastawionym na

zero wobec wody.

Interpretacja wyników oznaczenia

Korzystając z krzywej wzorcowej, na podstawie różnicy absorbancji między próbą ślepą

a średnią absorbancją prób pełnych, obliczano ilość skrobi rozłożonej w czasie oznaczenia.

Otrzymany wynik przeliczano na jednostki FAU/g, uwzględniając czas reakcji (15 min,

w stosunku do 60 min wg definicji jednostki FAU), ilość enzymu biorącą udział w reakcji

(0,132·10

-3

g) oraz ilość skrobi rozkładaną przez 1 g preparatu enzymatycznego według definicji

jednostki FAU (5,26 g s.s. skrobi):

132

⋅

−

(4.2)

gdzie:

- aktywność enzymu w suszu (FAU/g)

- ilość rozłożonej skrobi w czasie 15 min oznaczenia (g)

Aktywność enzymu w suszach wyrażano także jako aktywność względną w stosunku do

aktywności enzymu płynnego:

100

⋅

(4.3)

gdzie:

- aktywność względna enzymu w suszu (%)

- aktywność enzymu w preparacie płynnym (FAU/g)

Metodyka badań – Suszenie rozpyłowe

-amylazy

4.2.1.2. Oznaczenie zawartości suchej substancji

Zawartość suchej substancji oznaczono zgodnie z PN-71/74700.

4.2.1.3. Oznaczenie morfologii cząstek

W celu określenia wpływu parametrów suszenia na morfologię cząstek wykonywano

komputerową analizę obrazu zdjęć proszków za pomocą sterowanego komputerowo zestawu

zawierającego mikroskop i kamerę. Wykonywano przykładowe zdjęcia cząstek proszków

otrzymanych po suszeniu w różnych parametrach. Przed nałożeniem na szkiełko mikroskopowe

materiał rozprowadzano w izopropanolu.

4.2.1.4. Właściwości fizyczne proszków

W celu określenia właściwości fizycznych wybranych proszków oznaczano gęstość

nasypową luźną i utrzęsioną oraz rozpuszczalność.

Oznaczenie gęstości nasypowej wykonywano zgodnie z metodą podaną przez

Soerensen’a i wsp. (1978). 60 g proszku przenoszono do szklanego cylindra i odczytywano

objętość proszku. Gęstość nasypową luźną wyrażano w kg/m

. Następnie postukiwano

cylindrem 500 razy i odczytywano objętość proszku. Gęstość nasypową utrzęsioną wyrażano

w kg/m

Rozpuszczalność proszków oznaczano według PN-71/A-74700.

4.2.4.5. Oznaczenie zawartości sacharydów redukujących

W wybranych proszkach, otrzymanych po suszeniu przy minimalnym (0,4 cm

/s)

i maksymalnym (1,7 cm

/s) strumieniu surowca, oznaczono zawartość sacharydów

redukujących.

Oznaczenie wykonywano metodą kolorymetryczną, wykorzystującą właściwości

redukujące sacharydów, które w środowisku zasadowym redukują grupy nitrowe kwasu

3,5-dinitrosalicylowegodo grup aminowych, charakteryzujących się pomarańczowym

zabarwieniem. Intensywność zabarwienia, proporcjonalna do zawartości sacharydów

redukujących stanowi podstawę ich oznaczenia ilościowego (Praca zbiorowa 2001).

Zawartość sacharydów redukujących oznaczono również w maltodekstrynie przed

suszeniem.

4.2.2. Parametry opisujące przebieg suszenia rozpyłowego

Na podstawie wykonanych pomiarów zmian wilgotności i temperatury powietrza

wlotowego (oznaczenia z indeksem dolnym 1), wylotowego (oznaczenia z indeksem dolnym 2)

Metodyka badań – Suszenie rozpyłowe

-amylazy

i otaczającego (oznaczenia z indeksem dolnym 0) oraz zmian zawartości wody w suszonym

materiale obliczono:

bezwzględną zawartość wody w powietrzu otaczającym i wylotowym

(kg H

O/kg

p.s.):

⋅

−

2500

(4.4)

gdzie:

)

2500

(

⋅

)

(

)

(

622

−

- entalpia powietrza (kJ/kg p.s.)

- temperatura powietrza (°C)

- temperatura termometru mokrego (°C)

n(m)

- ciśnienie nasycenia w temperaturze termometru mokrego (Pa)

- ciśnienie atmosferyczne (Pa)

entalpię powietrza wlotowego, wylotowego i otaczającego

(kJ/kg p.s.)

)

2500

(

⋅

(4.5)

gdzie:

- temperatura (°C)

- bezwzględna zawartość wody (kg H

O/kg p.s.)

strumień wody odparowanej w czasie suszenia

(kg H

O/s):

−

100

(4.6)

gdzie:

- strumień masowy surowca (kg/s)

- początkowa zawartość H

O w materiale (%)

- końcowa zawartość wody w materiale (%)

właściwe zużycie powietrza

(kg p.s./kg H

O):

Metodyka badań – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

właściwe zużycie ciepła

(kJ/kg H

O):

−

(4.9)

gdzie:

- entalpia powietrza otaczającego (kJ/kg p.s.)

- entalpia powietrza wylotowego (kJ/kg p.s.)

4.3. KINETYKA INAKTYWACJI CIEPLNEJ

-AMYLAZY

4.3.1. Oznaczenie aktywności

-amylazy

Do oznaczenia aktywności enzymu w tej części pracy stosowano zestaw testowy

Amylase FL

produkowany przez Chema Diagnostica (Włochy).

Skład reagentu:

0,0023 M 2-chloro-4-nitrofenylo-

-maltotriozyd (CNPG3)

0,35 M NaCl

0,006 M (CH

COO)

0,6 M KSCN

0,1 M bufor Good’a pH 6.0

stabilizatory.

Zasada metody

-amylaza hydrolizuje 2-chloro-4-nitrofenylo-

-maltotriozyd (CNPG3) z uwolnieniem

2-chloro-4-nitrofenolu (CN), utworzeniem 2-chloro-4-nitrofenylo-

-maltozydu (CNPG2),

maltotriozy (G3) i glukozy (G). Miarą aktywności enzymu jest szybkość tworzenia

2-chloro-4-nitrofenolu, charakteryzującego się żółtą barwą, mierzona spektrofotometrycznie

przy

długości fali 405 nm w czasie 4 minut ciągłego pomiaru.

Wykonanie oznaczenia

Przed rozpoczęciem pomiarów reagent inkubowano przynajmniej 10 minut

w temperaturze 30°C. W celu wykonania oznaczenia 1 cm

reagentu przenoszono do

jednorazowej mikrokuwety, dodawano 25 µl próbki zawierającej enzym, mieszano.

Dokonywano ciągłego pomiaru absorbancji przy długości fali 405 nm. Schemat stanowiska do

oznaczenia aktywności enzymu przedstawiono na rysunku 4.4.

Metodyka badań – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

Rys. 4.4. Schemat stanowiska do oznaczania aktywności amylazy: przygoto-

wanie reagentu – inkubacja w temperaturze 30°C oraz dodanie badanej
próbki (A), ciągły pomiar absorbancji przez 4 minuty przy długości fali 405 nm

(B), PC - sterowanie i odczyt wyników (C)

Interpretacja wyników oznaczenia

Za aktywność enzymu przyjmowano wartość współczynnika nachylenia prostej na

wykresie absorbancji w funkcji czasu. Ze względu na konieczność ustabilizowania się

temperatury w kuwecie pomiarowej, pod uwagę brano wartość współczynnika nachylenia

w czasie od 2 do 4 minuty pomiaru. Przykładowe wykresy uzyskane w czasie oznaczenia

aktywności

-amylazy przedstawiono na rysunku 4.5.

4.3.1.1. Optymalizacja oznaczenia

Przed rozpoczęciem właściwych doświadczeń, dotyczących kinetyki inaktywacji cieplnej

-amylazy, konieczna była optymalizacja oznaczenia aktywności enzymu, tzn. dobór takiego

stężenia enzymu w badanych próbkach, aby możliwe było oznaczenie aktywności początkowej

oraz aktywności zmniejszonej po obróbce cieplnej. Początkowe stężenie enzymu nie mogło być

większe od pewnej granicznej wielkości, przy której następuje zużycie całości substratu przed

upływem całkowitego czasu oznaczenia. Przy zbyt dużym stężeniu enzymu substrat był

całkowicie rozkładany przed upływem całkowitego czasu oznaczenia. Objawiało się to

spłaszczeniem wykresu absorbancji w funkcji czasu (Rys. 5.17).

Metodyka badań – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

120

180

240

Czas (s)

cja

Rys. 4.5. Przykładowe wykresy

uzyskane w czasie oznaczenia
aktywności

-amylazy: próbka

enzymu o wysokiej aktywności

(1), próbka enzymu o niskiej
aktywności (2)

W celu wyznaczenia granicznego stężenia enzymu, poniżej którego oznaczenie

aktywności odbywa się w warunkach wysycenia substratem w czasie całego oznaczenia,

oznaczono aktywność enzymu przy jego siedmiu różnych stężeniach: 0,0; 0,3; 0,6; 1,2; 1,8;

2,4 i 3,0 FAU/cm

. Wykres zależności aktywności enzymu od jego stężenia w warunkach

wysycenia enzymu substratem powinien przyjmować formę linii prostej.

4.3.2. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w systemach o wysokiej

zawartości wody.

4.3.2.1. Przygotowanie próbek

Kinetykę inaktywacji cieplnej

-amylazy badano w trzech systemach o wysokiej

zawartości wody:

roztworze wodnym, dodatek enzymu 1,8 FAU/cm

– w dalszej części pracy

nazywanym S1,

roztworze wodnym z dodatkiem maltodekstryny, dodatek enzymu 1,8 FAU/cm

zawartość wody 3,5 g H

O/g s.s. – w dalszej części pracy nazywanym S2,

roztworze wodnym z dodatkiem maltodekstryny, dodatek enzymu 1,8 FAU/cm

zawartość wody 1,8 g H

O /g s.s. – w dalszej części pracy nazywanym S3.

Po przygotowaniu roztworów napełniano nimi kapilary szklane (Hirschmann, Niemcy)

o długości 150 mm i średnicy 1,5 mm. Umieszczanie roztworów przeznaczonych do wykonania

doświadczeń inaktywacji cieplnej w kapilarach miało na celu zapewnienie ogrzewania

izotermicznego roztworów. Ilość roztworu zamkniętego w jednej kapilarze wynosiła około

60 - 80

l i była wystarczająca do wykonania jednego punktu inaktywacji, tzn. jednej

kombinacji czasu i temperatury. Za pomocą aparatury przedstawionej na rysunku 4.6

Metodyka badań – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

napełniano równocześnie zestaw kapilar potrzebnych do wykonania pełnego doświadczenia

(np. 8 różnych czasów w 2-4 temperaturach). Próbkę roztworu umieszczano w naczynku

w eksykatorze (1), nad nią pionowo umieszczono zestaw kapilar związanych u góry gumką

i utwierdzonych na drucianej prowadnicy. Końce kapilar skierowane ku górze były zamknięte,

skierowane ku dołowi, w kierunku roztworów – otwarte. Eksykator szczelnie zamykano

i uruchamiano na 5 minut pompę próżniową (2) w celu usunięcia powietrza z eksykatora,

a zatem i z wnętrza kapilar. Następnie, za pomocą prowadnicy, zanurzano dolne końce kapilar

w roztworze i przy użyciu zaworu (3) powoli wprowadzano powietrze do wnętrza eksykatora.

Pod wpływem ciśnienia powietrza roztwór dostawał się do kapilar. Po napełnieniu do

2/3 wysokości wynurzano kapilary z roztworu i całkowicie otwierano zawór doprowadzający

powietrze. Końce kapilar zamykano nad płomieniem, osłaniając roztwór przed działaniem

ciepła. Przed przystąpieniem do dalszej części doświadczeń kapilary oznaczano numerami.

Przykład gotowych kapilar przedstawiono na rysunku 4.7.

4.3.2.2. Obróbka cieplna

Inaktywację cieplną

-amylazy przeprowadzano w łaźni wodnej o kontrolowanej

temperaturze. Kapilary zanurzano w łaźni wodnej na określony czas, po którym przenoszono je

do łaźni wodno-lodowej w celu przerwania inaktywacji cieplnej. Schemat doświadczenia

przedstawiono na rysunku 4.8. Po 10 minutach chłodzenia w łaźni wodno-lodowej otwierano

kapilary i dokonywano pomiaru aktywności enzymu.

Początkowo przeprowadzono doświadczenia wstępne w celu ustalenia zakresu

temperatury, w której będą wykonane właściwe doświadczenia kinetyki inaktywacji cieplnej

-amylazy w systemach o wysokiej zawartości wody S1 – S3. Zbadano inaktywację enzymu po

5 minutach w następujących temperaturach: 40, 55, 70, 85, 100°C. Z zakresu temperatury,

w którym zachodziła gwałtowna inaktywacja enzymu, wybrano po 4 temperatury dla każdego

systemu S1 – S3, w których przeprowadzono właściwe badania kinetyki inaktywacji cieplnej.

Temperatury te oraz czasy inaktywacji przedstawiono w tabeli 4.1.

Metodyka badań – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

Tabela 4.1. Parametry doświadczeń inaktywacji cieplnej

-amylazy

w systemach o wysokiej zawartości wody

Temp. (

62,5 65,0 67,5 70,0 70,0 72,5 73,5 75,0 73,5 75,0 76,5 78,5

Czas (min)

0,0

1,0

0,2

0,0

0,08

0,5

2,5

1,5

1,0

2,5

0,5

0,25

1,0

5,0

2,5

2,0

5,0

1,0

2,5

2,0

7,5

5,0

4,0

3,0

7,5

2,5

2,0

2,5

5,0

4,0

10,0

7,5

5,0

4,0

10,0

5,0

4,0

3,5

7,5

6,0

15,0 10,0

6,0

5,0

12,5

7,5

6,0

5,0

10,0 10,0 10,0

8,0

20,0 12,5

8,0

6,0

17,5 10,0

8,0

20,0 12,5 12,5

30,0 15,0 10,0

15,0 10,0

15,0

20,0 12,0

20,0

4.3.3. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w systemach o niskiej

zawartości wody.

Kinetykę inaktywacji cieplnej

-amylazy badano w trzech systemach o niskiej

zawartości wody:

proszku suszonym liofilizacyjnie o zawartości wody 0,163 g H

O/g s.s. – w dalszej

części pracy nazywanym S4,

proszku suszonym liofilizacyjnie o zawartości wody 0,060 g H

O/g s.s. – w dalszej

części pracy nazywanym S5,

proszku suszonym liofilizacyjnie o zawartości wody 0,029 g H

O/g s.s. – w dalszej

części pracy nazywanym S6.

Sposób otrzymania tych proszków, obejmujący suszenie liofilizacyjne, dosuszanie nad

oraz adsorpcję pary wodnej nad nasyconymi roztworami soli przedstawiono na rysunku

4.9 i opisano w kolejnych punktach.

4.3.3.1. Liofilizacja i dosuszanie

Liofilizacji poddawano enzym w wodnym roztworze maltodekstryny o zawartości wody

3,5 g H

O/g s.s. (taka sama zawartość wody jak w roztworze do suszenia rozpyłowego

i w systemie S2). Dodatek preparatu enzymatycznego wynosił 91,2 g Fungamyl/kg s.s.

maltodekstryny. Dawka enzymu w roztworze przeznaczonym do liofilizacji została ustalona na

podstawie wielkości pojedynczej próbki przeznaczonej do badania inaktywacji cieplnej.

Ponieważ wielkość tej próbki wynosiła około 15 mg, mogło się w niej znajdować maksymalnie

1,8 FAU enzymu, aby pomiar aktywności odbywał się w zakresie wysycenia enzymu

substratem.

Metodyka badań – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

Roztwór przeznaczony do suszenia sublimacyjnego zamrażano w ciekłym azocie.

Liofilizację prowadzono w liofilizatorze Christ Alpha 4 przy ciśnieniu 10 Pa, w czasie

20 godzin w temperaturze półki 15°C.

Rys. 4.9. Schemat otrzymywania systemów

-amylazy o niskiej zawartości

wody

Po liofilizacji otrzymany proszek homogenizowano, umieszczano w cienkich warstwach

w pojemnikach plastikowych, ważono z dokładnością do 0,00001 g i przenoszono do

eksykatora zawierającego na dnie P

, w celu całkowitego dosuszenia. Szczelnie zamknięty

eksykator umieszczano w chłodni o kontrowanej temperaturze 4°C. Po 10 dniach próbki

ważono codziennie do uzyskania stałej masy.

4.3.3.2. Adsorpcja pary wodnej i izoterma sorpcji

Po dosuszeniu proszku nad P

do stałej masy próbki o średniej masie około 15 mg

przenoszono do kapsułek ze stali nierdzewnej (DSC pans, Perkin Elmer) o średnicy

wewnętrznej 7 mm. Kapsułki przed i po napełnieniu proszkiem ważono z dokładnością do

0,00001 g. Kapsułkę przedstawiono na rysunku 4.11. Próbki umieszczano w szczelnie

zamykanych słoikach zawierających nasycone roztwory soli, słoiki zamykano i umieszczano

w chłodni o kontrowanej temperaturze 4°C (Rys. 4.10).

W celu wyznaczenia izotermy sorpcji stosowano 7 nasyconych roztworów soli

wykazujących różne równowagowe wilgotności względne – wartości według Greenspan (1977)

nich przedstawiono w tabeli 4.2. W celu otrzymania próbek o trzech różnych zawartościach

wody, przeznaczonych do badań kinetyki inaktywacji

-amylazy (systemy S4 – S6), stosowano

nasycone roztwory następująych soli: NaBr, MgCl

, LiCl. Po osiągnięciu przez próbki

Metodyka badań – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

równowagowej wilgotności względnej oznaczano w nich początkową aktywność

-amylazy,

uprzednio ważąc je i rozpuszczając w 1 cm

roztworu buforowego.

Tabela 4.2. Równowagowe wilgotności względne nasyconych roztworów soli

RWW nasyconego

roztworu soli w 4°C (%)

LiCl

11,26 ± 0,47

COOK

23,38 ± 0,53

MgCl

33,60 ± 0,28

43,13 ± 0,30

NaBr

63,51 ± 0,72

80,55 ± 0,96

98,48 ± 0,91

4.3.3.3. Obróbka cieplna

Po osiągnięciu przez próbki równowagowej wilgotności względnej kapsułki zamykano,

umieszczano w siatkach z tworzywa sztucznego i oznaczano numerami (Rys. 4.12).

Inaktywację cieplną przeprowadzano w łaźni olejowej zgodnie z rysunkiem 4.8. Próbki

umieszczano na określony czas w łaźni olejowej o określonej temperaturze, a następnie

przenoszono do łaźni wodno-lodowej w celu przerwania inaktywacji. Po 10 minutach kapsułki

otwierano, ważono ilość proszku, rozpuszczano w 1 cm

roztworu buforowego i oznaczano

aktywność

-amylazy. W tabeli 4.3. przedstawiono temperatury i czasy, w jakich prowadzono

inaktywację

-amylazy w trzech systemach o niskiej zawartości wody.

Tabela 4.3. Parametry doświadczeń inaktywacji cieplnej

-amylazy

w systemach o niskiej zawartości wody

Temp.(

95,0 97,0 98,5 100,0 100,0 102,5 105,0 107,5 100,0 105,0 110,0 115,0

Czas (min)

0,0

5,0

1,0

3,5

1,0

2,5

1,0

7,5

2,5

2,0

2,5

6,0

5,0

2,5

1,5

5,0

2,0

10,0 5,0

3,0

5,0

7,5

5,0

4,0

2,0

10,0

7,5

3,5

4,0

15,0 7,5

4,0

7,5

10,0 10,0

6,0

2,5

15,0 10,0

6,5

5,0

20,0 10,0 6,0

10,0

12,5 20,0

7,5

3,0

20,0 15,0 10,0

7,0

25,0 15,0 8,0

15,0 15,0

8,0

3,5

25,0 20,0 15,0 10,0

20,0 12,0

17,5

10,0

30,0 30,0 20,0

Metodyka badań – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

Rys. 4.10. Próbki proszku zawierającego
enzym umieszczone w kapsułkach i szczelnie

zamykanym słoiku z nasyconym roztworem soli

Rys. 4.11. Kapsułki, w których
umieszczano próbki proszku

zawierającego enzym: przykry-
wka (1), napełniona (2)

i zamknięta (3)

Rys. 4.12. Kapsułki wypełnione
badanym proszkiem zawierają-

cym enzym, w siatkach
z tworzywa sztucznego,

przygotowane do badania
inaktywacji termicznej

-amylazy

4.3.4. Wpływ dodatków stabilizujących na kinetykę inaktywacji cieplnej

-amylazy

4.3.4.1. Przygotowanie próbek

Kinetykę inaktywacji cieplnej

-amylazy badano w obecności następujących substancji

dodatkowych: mannitol, laktitol, sorbitol, glicerol, trehaloza, sacharoza. Substancje stabilizujące

dodawane były do 20 mM roztworu buforowego Bis-Tris o pH równym 7,0. Ponieważ celem tej

części pracy była weryfikacja hipotezy o wpływie ilości grup OH w roztworach na efekt

stabilizujący zastosowanych substancji stabilizujących (Guiavarc’h i wsp. 2003), ilości

dodawanych substancji były dobrane tak, aby zapewnić tę samą liczbę grup OH, ale

pochodzących z różnych źródeł. Stosowane stężenia substancji stabilizujących i odpowiadające

im ilości grup OH w roztworach przedstawiono w tabeli 4.4. Do obliczenia ilości grup OH

korzystano z następującego wzoru:

Metodyka badań – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

⋅

(4.10)

gdzie:

- liczba grup OH w jednostce badanego roztworu

(liczba grup/cm

)

- stężenie danej substancji dodatkowej (g/cm

)

- liczba Avogadro = 6,022·10

(liczba cząsteczek/mol)

- liczba grup OH w cząsteczce danej substancji dodatkowej (liczba

grup/cząsteczka)

- masa molowa danej substancji dodatkowej (g/mol)

Dodatek enzymu do roztworów był we wszystkich przypadkach taki sam i wynosił

1,8 FAU/cm

. Po sporządzeniu roztworów i dodaniu enzymu były one zamykane w kapilarach –

procedurę przedstawiono w punkcie 4.3.2.1.

Tabela 4.4. Stężenia substancji stabilizujących i odpowiadające im liczby

grup OH w roztworach

Liczba grup

OH/cm

Mannitol

mg/cm

Laktitol

mg/cm

Sorbitol
mg/cm

Glicerol

% (v/v)

Trehaloza

mg/cm

Sacharoza

mg/cm

0,198 x 10

100

100

8,1

140

0,281 x 10

200

0,314 x 10

200

13,0

0,396 x 10

200

0,595 x 10

300

24,8

420

0,725 x 10

30,0

0,992 x 10

500

41,0

705

Pogrubienie – systemy, w których przeprowadzono szczegółową analizę kinetyki
inaktywacji cieplnej

-amylazy w temperaturach 62, 64, 66 i 68°C

4.3.4.2. Obróbka cieplna

Inaktywację cieplną

-amylazy badano w temperaturze 68°C w przypadku wszystkich

przedstawionych powyżej stężeń dodatków stabilizujących, a także w roztworze buforowym bez

żadnych dodatków. Przy wybranych stężeniach przeprowadzono szczegółową analizę kinetyki

inaktywacji w temperaturach 62, 64, 66, 68°C. Były to następujące stężenia: 100 mg/cm

mannitolu, 200 mg/cm

laktitolu, 300 mg/cm

sorbitolu, 30 % (v/v) glicerolu, 200 mg/cm

trehalozy, 200 mg/cm

sacharozy.

Sposób przeprowadzania doświadczeń – jak w punkcie 4.3.2.2.

Metodyka badań – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

4.3.5. Wyznaczanie parametrów kinetycznych inaktywacji cieplnej

-amylazy

Wyznaczenie parametrów kinetycznych inaktywacji enzymów na podstawie uzyskanych

danych eksperymentalnych wymaga postępowania dwustopniowego. Najpierw określa się, za

pomocą jakich wyrażeń matematycznych opisywać się będzie relacje między wartościami

zależnymi i niezależnymi. Następnie dobiera się odpowiednie metody regresji, jakie będą

stosowane w celu dopasowania dostępnych danych do wybranych równań z jak największą

dokładnością.

Termin „kinetyka” oznacza postęp badanej reakcji w czasie. To, w jaki sposób dana

reakcja przebiega (np. liniowo, nieliniowo) opisywane jest za pomocą modeli kinetycznych.

Przebieg reakcji w czasie opisywany jest za pomocą kinetycznego modelu pierwszorzędowego.

Model drugorzędowy określa wpływ określonego parametru (np. temperatury) na parametry

modelu pierwszorzędowego.

Przy wyznaczaniu parametrów kinetycznych reakcji najpierw określa się sposób

przebiegu badanej reakcji w czasie. W przypadku inaktywacji termicznej wielu enzymów,

w tym

-amylazy, często stosuje się opis za pomocą równania reakcji pierwszego rzędu

(Guiavarc’h i wsp. 2002, Terebiznik i wsp. 1997). W tym modelu podstawowym parametrem

kinetycznym jest stała szybkości reakcji

(równanie 4.11). Do opisu degradacji

mikroorganizmów lub inaktywacji enzymów często stosowany jest też model czasu śmierci

cieplnej (Thermal Death Time, Bigelow 1921), opierający się na parametrze kinetycznym

nazywanym czasem dziesięciokrotnej redukcji i definiowanym jako czas potrzebny,

w danej temperaturze, do zmniejszenia ilości żywych mikroorganizmów (lub do zmniejszenia

aktywności enzymu) o 90 % (równanie 4.13).

Do pełnego opisu modelu inaktywacji stosowane są równania opisujące wpływ

eksperymentalnie stosowanych parametrów (np. temperatury) na pierwszorzędowe parametry

kinetyczne. Najczęściej stosowanym równaniem opisującym wpływ temperatury na stałą

szybkości reakcji jest równanie Arrheniusa. Zależność między temperaturą a stałą szybkości

reakcji jest wyrażana za pomocą energii aktywacji

(równanie 4.12). W równolegle

stosowanym modelu czasu śmierci cieplnej zależność między temperaturą a wartością

opisywana jest za pomocą wartości

(równanie 4.14).

Po określeniu za pomocą jakich równań będą wyznaczane parametry kinetyczne

inaktywacji, można przejść do drugiego etapu, czyli praktycznego wyznaczania tych

parametrów na podstawie danych eksperymentalnych, za pomocą regresji metodą

najmniejszych kwadratów. Sposób przeprowadzania regresji również może być różny,

stosowane są metody jedno- i dwustopniowe.

Metodyka badań – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

W metodzie dwustopniowej najpierw wyznacza się za pomocą liniowej regresji prostej

parametry pierwszorzędowe, czyli

. W drugim etapie za pomocą tej samej techniki

wyznacza się parametry drugorzędowe, czyli

w oparciu o wcześniej wyznaczone

parametry pierwszorzędowe. Zaletą tej metody jest to, że ważność modelu może być oceniona

graficznie, a parametry obliczane są bezpośrednio z równania regresji. Wadą tej metody jest

to, że w rezultacie stosowania wyników pierwszej regresji jako danych do drugiej regresji, błąd

pierwszej regresji wpływa na dokładność szacowania parametrów drugorzędowych. Schemat

postępowania w dwustopniowym szacowaniu parametrów kinetycznych inaktywacji

-amylazy

przedstawiono w tabeli 4.5.

Tabela 4.5. Równania stosowane do dwustopniowego wyznaczania
parametrów kinetycznych inaktywacji

-amylazy, przebiegającej zgodnie

z równaniem reakcji pierwszego rzędu

1. Model pierwszorzędowy –

przebieg procesu w czasie

2. Model drugorzędowy – wpływ temperatury

M O D E L R E A K C J I I - g o R Z Ę D U + R Ó W N A N I E A R R H E N I U S A

−











(4.11)













−



(4.12)

M O D E L C Z A S U Ś M I E R C I C I E P L N E J

⋅

−









log



(4.13)

−

log



(4.14)

W jednostopniowej metodzie wyznaczania parametrów kinetycznych inaktywacji

-amylazy zestaw danych jest traktowany całościowo. Szacowane są tylko parametry

drugorzędowe (

, z

), symultanicznie za pomocą regresji nieliniowej metodą najmniejszych

kwadratów. Wartości te wyznaczane są z równań 4.17 i 4.18, które otrzymano poprzez

podstawienie wartości

w równaniach 4.11 i 4.13 zgodnie z równaniami 4.15 i 4.16.





























−

ref

exp

(4.15)

ref

−

⋅

(4.16)

Metodyka badań – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

Schemat postępowania w jednostopniowym szacowaniu parametrów kinetycznych

inaktywacji

-amylazy przedstawiono w tabeli 4.6.

Tabela 4.6. Równania stosowane do jednostopniowego wyznaczania

parametrów kinetycznych inaktywacji

-amylazy, przebiegającej zgodnie

z równaniem reakcji pierwszego rzędu

M O D E L R E A K C J I I - g o R Z Ę D U + R Ó W N A N I E A R R H E N I U S A

ref

⋅





























−

exp



(4.17)

M O D E L C Z A S U Ś M I E R C I C I E P L N E J

ref

−

⋅

−



(4.18)

Szacowanie parametrów kinetycznych inaktywacji cieplnej

-amylazy na podstawie

uzyskanych danych eksperymentalnych wykonywano za pomocą programu komputerowego

SAS.

4.4. METODY STATYSTYCZNE

4.4.1. Analiza wariancji

Za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji badano zróżnicowanie poziomu aktywności

względnej suszonej

-amylazy oraz parametrów opisujących przebieg procesu suszenia

rozpyłowego, ze względu na zastosowane parametry suszenia – temperaturę powietrza

wlotowego oraz strumień surowca. Testowano hipotezę o równości średnich oraz wykonano

analizę porównań wielokrotnych metodą Student-Newman-Keuls w celu podzielenia średnich na

grupy jednorodne, między składnikami których nie występują istotne statystycznie różnice.

Analizę wykonano przy użyciu programu Statgraphics 5.0.

4.4.2. Test t-Studenta

Za pomocą testu t-Studenta weryfikowano hipotezę o równości współczynników

kierunkowych prostych otrzymanych po wykreśleniu zależności między temperaturą powietrza

wylotowego a strumieniem surowca przy czterech temperaturach powietrza wlotowego podczas

Metodyka badań – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

suszenia rozpyłowego preparatu

-amylazy. W celu weryfikacji hipotezy o równości

współczynników kierunkowych porównywano te współczynniki parami na podstawie testu

istotności dla weryfikacji hipotez statystycznych:

emp

−

(4.19)

gdzie:

- wartości współczynników kierunkowych dwóch porównywanych

prostych wyznaczone za pomocą regresji prostej

- błąd standardowy szacowania wartości współczynników

kierunkowych dwóch porównywanych prostych za pomocą regresji

prostej

Obliczone

emp

porównywano z tablicową wartością

tab

, odczytaną dla poziomu istotności

=0,05 i liczby stopni swobody

-2

, gdzie

oznaczają liczbę punktów na podstawie

których szacowano wartość współczynników kierunkowych. Gdy

emp

tab

przyjmowano

hipotezę o równości współczynników kierunkowych (Łomnicki 1999).

Omówienie i dyskusja wyników – Materiały

5. OMÓWIENIE I DYSKUSJA WYNIKÓW

5.1. CHARAKTERYSTYKA MATERIAŁÓW DO BADAŃ

5.1.1. Preparat

-amylazy Fungamyl 800L

5.1.1.1. Masa molowa białka

Bezpośrednio po zakończeniu oznaczenia obraz otrzymany na żelu skanowano,

a następnie analizowano za pomocą programu komputerowego Amersham Biosciences. Obraz

utrwalony na żelu poliakryloamidowym przedstawiono na rysunku 5.1. W lewej kolumnie

widoczne są pasma odpowiadające białkom standardowym o znanych masach molowych.

Pojedyncze pasmo w prawej kolumnie odpowiada badanemu białku. Występowanie tylko

jednego pasma w tej kolumnie świadczy o czystości preparatu enzymatycznego, tzn. braku

zanieczyszczeń innymi białkami oraz o braku izoenzymów o różnych masach molowych.

Rys. 5.1. Białka uwidocznione na żelu poliakryloamidowym po
przeprowadzeniu elektroforezy SDS PAGE

Położenie pasm białek standardowych o znanych masach molowych porównano

z położeniem pasma białka enzymatycznego zawartego w preparacie Fungamyl 800L i na tej

podstawie jego masę molową określono na 56,4 kDa.

Otrzymana wartość jest zgodna z wartościami masy cząsteczkowej

-amylaz, jakie są

podawane w literaturze. Janeček i Baláž (1992) podają, że masa molowa

-amylaz kształtuje

się na poziomie od 45,0 do 60,0 kDa. Według Repsa (2003) masa cząsteczkowa

-amylazy

syntetyzowanej przez

Aspergillus oryzae

wynosi 52,6 kDa. Achremowicz i Wójcik (2000) podają

zakres wartości od 49,0 do 52,6 kDa.

Omówienie i dyskusja wyników – Materiały

5.1.1.2. Zawartość białka

Wyniki oznaczenia przedstawiono w tabeli 5.1.

Tabela 5.1. Wyniki oznaczenia zawartości białka w preparacie Fungamyl 800L

Zawartość białka

[mg/cm

]

Absorban
cja

Krzywa

wzorcowa

0,00

0,145

0,25

0,461

0,50

0,740

0,75

1,002

1,00

1,236

Absorbancja Fungamyl 800L:

0,618; 0,624; 0,633; 0,635

Średnia: 0,628 ± 0,008

Na podstawnie wyników oznaczenia wykreślono krzywą wzorcową obrazującą zależność

między absorbancją a zawartością białka standardowego w próbce. Krzywą tę przedstawiono

na rysunku 5.2.

y = 1,0892x + 0,1722

= 0,9968

0,0

0,5

1,0

1,5

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Zawartość białka (mg/cm

)

cja

Rys. 5.2. Krzywa wzorcowa – zależność między absorbancją a zawartością

białka w próbce

Omówienie i dyskusja wyników – Suszenie rozpyłowe

-amylazy

Podobną zawartość białka (225 mg/cm

) w tym samym preparacie Fungamyl 800L podają

Graber i Combes (1989).

5.1.1.3. Zawartość suchej substancji

Zawartość suchej substancji w preparacie enzymatycznym Fungamyl 800L wynosiła

57,0 % (zawartość wody 0,75 g H

O/g s.s.).

5.1.2. Maltodekstryna

Zawartość wody w maltodekstrynie produkowanej przez „Nowamyl” S.A. wynosiła

0,11 g H

O/g s.s., a w maltodekstrynie z Sigma-Aldrich 0,08 g H

O/g s.s.

5.2. SUSZENIE ROZPYŁOWE PREPARATU

-AMYLAZY

5.2.1. Parametry opisujące przebieg suszenia rozpyłowego

5.2.1.1. Temperatura powietrza wylotowego

Średnią temperaturę powietrza wylotowego w czasie suszenia rozpyłowego preparatu

-amylazy, w czterech różnych temperaturach powietrza wlotowego i przy czterech różnych

strumieniach surowca, przedstawiono na rysunku 5.3 i w tabeli 10.1.

100

120

160

180

200

220

0,4

0,8

1,2

1,7

Temperatura powietrza wlotowego (

Strumień surowca (cm

/s):

(

)

Rys. 5.3. Średnia temperatura powietrza wylotowego (°C) w czasie suszenia

rozpyłowego preparatu

-amylazy w zależności od temperatury powietrza

wlotowego i strumienia surowca

Zmniejszanie temperatury powietrza wlotowego oraz zwiększanie strumienia surowca

powodowało obniżanie temperatury powietrza wylotowego. Na podstawie przeprowadzonej

analizy wariancji wpływ obu zmiennych parametrów suszenia (temperatury powietrza

Omówienie i dyskusja wyników – Suszenie rozpyłowe

-amylazy

wlotowego i strumienia surowca) na wartość temperatury powietrza wylotowego został uznany

za istotny statystycznie (Tabela 10.2). Zależność między strumieniem surowca

a temperaturą wylotową, przy stałej temperaturze powietrza wlotowego, była prostoliniowa

(Rys. 5.4). Obniżanie temperatury powietrza wylotowego przy wyższych strumieniach surowca

było wynikiem zwiększonego odparowania wody i zwiększonego pobierania ciepła przemiany

fazowej przez parującą wodę. Przy strumieniu surowca równym 0,4 cm

/s strumień

odparowanej wody wynosił około 1 kg/h, a gdy strumień surowca zwiększono do

1,7 cm

/s w ciągu jednej godziny z materiału odparowało około 5 kg wody (Rys. 5.5). Podobne

wyniki prezentowali Ståhl i wsp. (2002) oraz Nath i Satpathy (1998). W pracy przedstawionej

przez Ståhl i wsp. (2002) temperatura powietrza wylotowego w czasie suszenia rozpyłowego

insuliny w temperaturze powietrza wlotowego 100°C przy strumieniu surowca 0,003 cm

wynosiła 72°C, a po zwiększeniu strumienia do 0,083 cm

/s zmniejszyła się do 59°C (przy tej

samej temperaturze powietrza wlotowego). Nath i Satpathy (1998) podają, że przy stałej

temperaturze powietrza wlotowego 140°C, temperatura powietrza wylotowego zmniejszyła się

z 58 do 48°C, gdy strumień surowca zwiększono z 7,0 do 15,0 cm

/min. Ponadto, autorzy

stwierdzili, że zależność między czterema różnymi szybkościami zasilania a obserwowaną

temperaturą powietrza wylotowego przy stałej temperaturze powietrza wlotowego była

prostoliniowa.

100

120

0,5

1,5

Strumień surowca (cm

/s)

emp

ra p

iet

ylo

(

)

160

180

200

220

Temperatura powietrza wlotowego (

C):

Rys. 5.4. Zależność między strumieniem surowca a temperaturą powietrza
wylotowego przy temperaturach powietrza wlotowego: 160°C (



) R

=0,98;

180°C (



) R

=0,96; 200°C (



) R

=0,94; 220°C (



) R

=0,93

Za pomocą testu t-Studenta zweryfikowano hipotezę o równości współczynników

kierunkowych prostych otrzymanych po wykreśleniu zależności między temperaturą powietrza

Omówienie i dyskusja wyników – Suszenie rozpyłowe

-amylazy

wylotowego a strumieniem surowca w czterech temperaturach powietrza wlotowego (Rys. 5.4).

Stwierdzono, że współczynniki te nie różnią się statystycznie istotnie (Tabela 10.3). Można

przyjąć, że średnia wartość współczynnika kierunkowego jest równa –29,8. Oznacza to, że

zwiększenie strumienia zasilającego o 1 cm

spowodowałoby zmniejszenie temperatury

powietrza opuszczającego suszarkę o około 30°C, niezależnie od temperatury powietrza

wlotowego.

5.2.1.2. Strumień odparowanej wody

Średni strumień wody odparowanej podczas suszenia rozpyłowego preparatu

-amylazy,

w czterech różnych temperaturach powietrza wlotowego i przy czterech różnych strumieniach

surowca, obliczono z równania 4.6 i przedstawiono na rysunku 5.5 oraz w tabeli 10.4.

Zwiększanie strumienia surowca wpływało na znaczne zwiększenie ilości wody

odparowywanej w jednostce czasu. Strumień odparowanej wody przy suszeniu przy strumieniu

surowca 0,4 cm

/s był około pięciokrotnie mniejszy niż przy suszeniu przy strumieniu surowca

1,7 cm

/s. W wyniku zwiększonego odparowywania wody i zwiększonego pobierania ciepła

przemiany fazowej, w czasie suszenia przy większych strumieniach surowca, obniżaniu ulegała

temperatura powietrza wylotowego (Rys. 5.4, Tabela 10.1). Na podstawie przeprowadzonej

analizy wariancji wpływ strumienia surowca na zmiany strumienia odparowanej wody uznano

za statystycznie istotny, a wpływ temperatury powietrza wlotowego za nieistotny (Tabela 10.5).

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

160

180

200

220

mie

ej w

y (

)

0,4

0,8

1,2

1,7

Temperatura powietrza wlotowego (

Strumień surowca (cm

/s):

Rys. 5.5. Średni strumień wody (kg/h) odparowywanej w czasie suszenia
rozpyłowego preparatu

-amylazy w zależności od temperatury powietrza

wlotowego i strumienia surowca

Omówienie i dyskusja wyników – Suszenie rozpyłowe

-amylazy

5.2.1.3. Wilgotność powietrza wylotowego

Na rysunku 5.6 i w tabeli 10.6 przedstawiono średnią wilgotność powietrza wylotowego

(obliczona na podstawie równania 4.4) w czasie suszenia rozpyłowego preparatu

-amylazy

w czterech różnych temperaturach powietrza wlotowego i przy czterech różnych strumieniach

surowca.

Zwiększanie strumienia surowca, a co za tym idzie strumienia wody usuwanej w czasie

suszenia, powodowało około trzykrotne zwiększenie wilgotności powietrza wylotowego

(porównując suszenie przy strumieniach zasilających 0,4 i 1,7 cm

/s). Na podstawie przeprowa-

dzonej analizy wariancji wpływ strumienia surowca na zmiany wilgotności powietrza

wylotowego uznano za statystycznie istotny, a wpływ temperatury powietrza wlotowego za

nieistotny (Tabela 10.7).

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

160

180

200

220

ilg

ść

a w

ylo

/kg

.s.)

0,4

0,8

1,2

1,7

Temperatura powietrza wlotowego (

Strumień surowca (cm

/s):

Rys 5.6. Średnia wilgotność powietrza wylotowego (kg H

O/kg p.s.) w czasie

suszenia rozpyłowego preparatu

-amylazy w zależności od temperatury

powietrza wlotowego i strumienia surowca

5.2.1.4. Właściwe zużycie powietrza

Średnie właściwe zużycie powietrza w czasie suszenia rozpyłowego preparatu

-amylazy

(obliczone z równania 4.7), w zależności od zastosowanej temperatury powietrza wlotowego

oraz strumienia surowca, przedstawiono na rysunku 5.7 i w tabeli 10.8.

Właściwe zużycie powietrza w czasie suszenia rozpyłowego przyjmowało wartości od

53,6 do 500,0 kg p.s./kg H

O. Najniższe wartości, na poziomie od 53,6 do 73,5 kg p.s./kg H

zanotowano w przypadku suszenia przy największym strumieniu surowca równym 1,7 cm

/s.

Najwyższe wartości, na poziomie około dziesięciokrotnie wyższym (od 344,8 do

Omówienie i dyskusja wyników – Suszenie rozpyłowe

-amylazy

500,0 kg p.s./kg H

O) zanotowano podczas suszenia przy najmniejszym strumieniu surowca

równym 0,4 cm

/s. Porównując powyższe wartości można stwierdzić, że suszenie

z zastosowaniem wyższych strumieni surowca było bardziej korzystne z punktu widzenia

ekonomiczności przeprowadzanego procesu.

Na podstawie przeprowadzonej analizy wariancji wpływ zmian strumienia surowca na

zmiany właściwego zużycia powietrza uznano za statystycznie istotny (Tabela 10.9). Po

przeprowadzeniu porównań wielokrotnych stwierdzono występowanie trzech grup

jednorodnych (Tabela 10.10). Nie stwierdzono statystycznie istotnej różnicy między średnim

poziomem właściwego zużycia powietrza podczas suszenia przy strumieniu surowca

1,2 i 1,7 cm

/s. Obie wartości średnie należały do tej samej grupy jednorodnej. W pozostałych

dwu grupach jednorodnych znalazły się wartości właściwego zużycia powietrza zanotowane

podczas suszenia przy strumieniu surowca 0,4 i 0,8 cm

/s. Wpływ temperatury powietrza

wlotowego uznano za nieistotny.

100

200

300

400

500

600

700

800

160

180

200

220

łaś

ciw

ycie

iet

.s./k

)

0,4

0,8

1,2

1,7

Temperatura powietrza wlotowego (

Strumień surowca (cm

/s):

Tabela 5.7. Średnie właściwe zużycie powietrza (kg p.s./kg H

O) w czasie

suszenia rozpyłowego preparatu

-amylazy w zależności od temperatury

powietrza wlotowego i strumienia surowca

5.2.1.5. Właściwe zużycie ciepła

Średnie właściwe zużycie ciepła w czasie suszenia rozpyłowego preparatu

-amylazy,

w zależności od zastosowanej temperatury powietrza wlotowego oraz strumienia surowca,

obliczone na podstawie równania 4.9, przedstawiono na rysunku 5.8 i w tabeli 10.11.

Właściwe zużycie ciepła wahało się w granicach od 4112 kJ/kg H

O do 49550 kJ/kg H

Najniższe wartości, na poziomie od 4000 do 6000 kJ/kg H

O, zanotowano w przypadku

Omówienie i dyskusja wyników – Suszenie rozpyłowe

-amylazy

suszenia przy największym strumieniu surowca 1,7 cm

/s. Najwyższe wartości, na poziomie

około dziesięciokrotnie większym (od 30000 do 50000 kJ/kg H

O), zanotowano przy suszeniu

przy najmniejszym strumieniu surowca 0,4 cm

/s. Suszenie z zastosowaniem wyższych

strumieni surowca było bardziej korzystne z punktu widzenia ekonomiczności

przeprowadzanego procesu.

Na podstawie przeprowadzonej analizy wariancji wpływ zmian strumienia surowca na

poziom właściwego zużycia ciepła uznano za statystycznie istotny (Tabela 10.12). Podobnie jak

w przypadku właściwego zużycia powietrza, po przeprowadzeniu porównań wielokrotnych nie

stwierdzono jednak statystycznie istotnej różnicy między średnim poziomem właściwego

zużycia ciepła przy suszeniu przy strumieniu surowca 1,2 i 1,7 cm

/s (Tabela 10.13). Obie

wartości średnie należały do tej samej grupy jednorodnej. W pozostałych dwu grupach

jednorodnych znalazły się wartości właściwego zużycia ciepła przy suszeniu przy strumieniu

surowca 0,4 i 0,8 cm

/s. Wpływ temperatury powietrza wlotowego uznano za nieistotny.

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

160

180

200

220

łaś

ciw

ycie

ciep

ła

J/kg

)

0,4

0,8

1,2

1,7

Temperatura powietrza wlotowego (

Strumień surowca: (cm

/s):

Rys. 5.8. Średnie właściwe zużycie ciepła (kJ/kg H

O) w czasie suszenia

rozpyłowego preparatu

-amylazy w zależności od temperatury powietrza

wlotowego i strumienia surowca

5.2.2. Charakterystyka otrzymanych proszków

5.2.2.1. Zawartość wody

Średnią zawartość wody w suszach po suszeniu rozpyłowym preparatu

-amylazy,

w zależności od temperatury powietrza wlotowego i strumienia surowca, przedstawiono na

rysunku 5.9 i w tabeli 10.14. Wartość ta wahała się w granicach od 0,029 do

Omówienie i dyskusja wyników – Suszenie rozpyłowe

-amylazy

0,160 g H

O/g s.s, a na podstawie przeprowadzonej analizy wariancji wpływ obu zmiennych

parametrów suszenia (temperatury powietrza wlotowego i strumienia surowca) został uznany

za istotny statystycznie (Tabela 10.15).

Zawartość wody w suszach była zależna od temperatury powietrza wylotowego, a więc

tej, przy której zachodziło odparowanie wody. Kreśląc zależność u=f(t) (Rys. 5.10) można

zauważyć, że zależność ta jest liniowa. Jednocześnie otrzymane susze można podzielić na dwie

grupy – o niższej i wyższej zawartości wody – uzyskane odpowiednio podczas suszenia

w wyższych i niższych temperaturach powietrza wylotowego.

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

160

180

200

220

ść w

(

)

0,4

0,8

1,2

1,7

Temperatura powietrza wlotowego (

Strumień surowca (cm

/s):

Rys. 5.9. Średnia zawartość wody w suszach (g H

O/g s.s.)

w zależności od temperatury powietrza wlotowego i strumienia surowca

Omówienie i dyskusja wyników – Suszenie rozpyłowe

-amylazy

u = -0,0015*t + 0,1852

= 0,886

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

100

120

ść

(g/

)

Temperatura powietrza wylotowego
(

Rys. 5.10. Zależność między

średnią zawartością wody
w suszach a temperaturą

powietrza wylotowego w czasie
suszenia rozpyłowego; dane

eksperymentalne: 0,4 cm

(



), 0,8 cm

/s (



), 1,3 cm

(



), 1,7 cm

/s (



); model

u= a·t+b dopasowany za

pomocą regresji prostej (—),
R

= 0,886

Susze z pierwszej grupy (o niższych zawartościach wody), otrzymane po suszeniu

w średniej temperaturze powietrza wylotowego od 104,3 do 77,3°C charakteryzowały się

zawartością wody od 0,03 do 0,05 g H

O/g s.s. Susze z drugiej grupy, o wyższej zawartości

wody – od 0,07 do 0,11 g H

O/g s.s., suszone były w temperaturze powietrza wylotowego od

72,7 do 51,0°C.

Ogólną zależność końcowej zawartości wody w suszu od temperatury powietrza

wylotowego w czasie suszenia rozpyłowego podaje Masters (1985), a potwierdzają min.

doświadczenia suszenia rozpyłowego fosfatazy alkalicznej przeprowadzone przez Etzel i wsp.

(1996). Zawartość wody w suszu otrzymanym po suszeniu przy temperaturze powietrza

wylotowego 80°C wynosiła 6,0 % (0,06 g H

O/g s.s.), 100°C – 4,2 % (0,04 g H

O/g s.s),

120°C – 2,4 % (0,02 g H

O/g s.s).

Jak wcześniej wspomniano, obniżanie temperatury powietrza wylotowego przy stałej

temperaturze powietrza wlotowego było wynikiem zwiększania strumienia surowca. Można więc

stwierdzić za Masters (1985), że zwiększanie strumienia zasilającego wpływa na zwiększanie

końcowej zawartości wody w suszu, poprzez obniżanie temperatury odparowania wody

(temperatury powietrza wylotowego). Zależność tę obserwowali również Zbiciński i wsp.

(2002). Zwiększenie szybkości zasilania suszarki rozpyłowej 10 %-owym roztworem

maltodekstryny z 5 do 10 kg/h powodowało około pięciokrotny wzrost zawartości wody.

5.2.2.2. Morfologia cząstek

Omówienie i dyskusja wyników – Suszenie rozpyłowe

-amylazy

Na rysunku 5.11 i 5.12 przedstawiono wybrane zdjęcia cząstek proszku suszonych

rozpyłowo przy dwóch strumieniach surowca: 0,4 i 1,7 cm

/s w temperaturze 160°C. Widoczne

są różnice w wielkości, kształcie i wyglądzie powierzchni cząstek. Cząstki uzyskane po suszeniu

przy niższym strumieniu surowca charakteryzowały się mniejszymi rozmiarami, a ich

powierzchnia była bardziej pofałdowana. Rozpylanie cieczy przy mniejszym strumieniu surowca

jest bardziej efektywne, tzn. powstające krople mają mniejsze rozmiary (Masters 1985).

Zmniejszenie rozmiarów kropel umożliwia ich dokładniejsze wysuszenie, w wyniku czego

uzyskane susze charakteryzowały się niższą końcową zawartością wody, a ich powierzchnia

była bardziej pofałdowana, prawdopodobnie ze względu na większy skurcz cząstek. Przy

większym strumieniu surowca otrzymane cząstki charakteryzowały się bardziej sferycznym

kształtem i większymi wymiarami.

Według Zbicińskiego i wsp. (2001) przy wyższych temperaturach powietrza suszącego

może następować częściowa destrukcja materiału prowadząca do powstawania szorstkich

i chropowatych cząstek. Maa i wsp. (1997) podają, że susząc rozpyłowo roztwór białka

w niższej temperaturze powietrza wylotowego (a więc, w przypadku regulacji tej wartości za

pomocą strumienia surowca, przy większym strumieniu surowca) uzyskiwano cząstki

o bardziej regularnym sferycznym kształcie. Odwrotną zależność podaje Etzel i wsp. (1997).

Proszek uzyskany po suszeniu rozpyłowym w najwyższej temperaturze powietrza wylotowego

wykazywał największy udział cząstek o regularnym sferycznym kształcie.

Rys. 5.11. Zdjęcia cząstek proszku po

suszeniu przy strumieniu surowca

Rys. 5.12. Zdjęcia cząstek proszku po

suszeniu przy strumieniu surowca

Omówienie i dyskusja wyników – Suszenie rozpyłowe

-amylazy

0,4 cm

/s (powiększenie 220x)

1,7 cm

/s (powiększenie 220x)

5.2.2.3. Właściwości fizyczne proszków

Określenie właściwości fizycznych proszków, takich jak gęstość nasypowa, zwilżalność

i rozpuszczalność jest istotne, gdyż właściwości te warunkują możliwość i łatwość ich

praktycznego wykorzystania materiału w procesie produkcyjnym. Do zbadania właściwości

fizycznych proszków wybrano materiał wysuszony w temperaturze 220°C przy zastosowaniu

dwóch skrajnych strumieni zasilających (czynnik mający większy wpływ na badane zmienne niż

temperatura powietrza wlotowego).

Gęstość nasypowa luźna proszków otrzymanych poprzez suszenie w temperaturze

powietrza wlotowego 220°C przy strumieniu surowca 0,4 i 1,7 cm

/s wynosiła odpowiednio

400 i 380 kg/m

. Gęstość nasypowa utrzęsiona wynosiła odpowiednio 580 i 600 kg/m

. Znaczne

zwiększenie gęstości nasypowej utrzęsionej w stosunku do gęstości luźnej jest cechą

charakterystyczną dla proszków o właściwościach kohezyjnych, do których jest zaliczana

maltodekstryna (Peleg 1977, Kwapińska 2002). Tego rodzaju proszki charakteryzują się

również słabą zwilżalnością i sypkością. W celu polepszenia tych właściwości i ułatwienia

stosowania proszku w procesie produkcyjnym stosowane jest aglomerowanie, czyli proces

powiększania rozmiarów cząstek poprzez łączenie ich w większe skupiska, w których tworzące

je cząstki są nadal rozpoznawalne (Domian 2002).

Otrzymane susze charakteryzowały się bardzo dobrą rozpuszczalnością na

poziomie 99 %.

5.2.2.4. Zawartość sacharydów redukujących

Celem oznaczeń sacharydów redukujących było zbadanie, czy wydłużony czas podawania

surowca do dysku rozpylającego, przy mniejszych strumieniach surowca, miał wpływ na zmianę

składu chemicznego (zawartość sacharydów redukujących) podawanego roztworu, co mogłoby

wpływać na zmianę oddziaływania tego roztworu na enzym w czasie suszenia. Ewentualny

wpływ wydłużonego czasu podawania surowca na zmianę składu chemicznego podawanego

roztworu mógłby być wynikiem oddziaływania enzymu na maltodekstrynę.

Zawartość sacharydów redukujących w proszkach otrzymanych poprzez suszenie

w temperaturze powietrza wlotowego 220°C przy strumieniu surowca 0,4 i 1,7 cm

/s wynosiła

odpowiednio 13,5 i 12,7 %. W maltodekstrynie stwierdzono zawartość sacharydów

redukujących na poziomie 9,6 %. Na podstawie wyników oznaczenia zawartości sacharydów

redukujących w proszkach, otrzymanych po suszeniu przy strumieniu surowca 0,4 i 1,7 cm

/s,

Omówienie i dyskusja wyników – Suszenie rozpyłowe

-amylazy

można stwierdzić, że wydłużony czas podawania surowca (z 4 do 10 minut) nie miał istotnego

wpływu na zawartość sacharydów redukujących w suszach. Zawartość ta była zwiększona

w stosunku do zawartości początkowej w maltodekstrynie, lecz różnica między zawartością

w proszkach otrzymanych po suszeniu przy strumieniu surowca 0,4 i 1,7 cm

/s była

w granicach błędu statystycznego. Surowiec podawany był do dysku rozpylającego

w temperaturze 20°C, podczas gdy temperatura optymalna działania enzymu wynosi 37°C.

Również pH roztworu nie było optymalne dla działania enzymu. Ponadto,

-amylaza nie jest

enzymem, w wyniku działania którego może dochodzić do rozkładu polisacharydu do cukrów

prostych, a obecności innych enzymów w preparacie nie stwierdzono. Tak więc zwiększona

zawartość sacharydów redukujących w suszach w stosunku do maltodekstryny przed

suszeniem była prawdopodobnie spowodowana działaniem destrukcyjnym procesu rozpylania.

Taki destrukcyjny wpływ rozpylania roztworu maltodekstryny niskoscukrzonej w dysku

rozpyłowym obserwował również Stolarek (2003).

5.2.3. Podsumowanie – przebieg suszenia

Reasumując, przebieg suszenia był ściśle uzależniony od zmian badanych parametrów:

temperatury powietrza wlotowego oraz strumienia surowca. Suszenie przy niższych

strumieniach surowca prowadziło do uzyskania proszków o niższej zawartości wody, co

wynikało z różnic w temperaturze wylotowej powietrza. Zmniejszanie strumienia surowca

powodowało zmniejszenie strumienia odparowywanej wody, w rezultacie czego temperatura

powietrza wylotowego była wyższa niż przy zastosowaniu wyższych strumieni surowca.

Zwiększenie temperatury powietrza wylotowego powodowało lepsze wysuszenie cząstek.

Ponadto, rozmiary kropel przy mniejszych strumieniach surowca są mniejsze (Masters 1985),

co również umożliwia ich lepsze wysuszenie. Podwyższanie temperatury powietrza wlotowego,

przy danym strumieniu surowca, powodowało zwiększenie temperatury powietrza wylotowego

oraz zmniejszenie zawartości wody w suszach.

Strumień surowca miał również wpływ na zużycie ciepła i powietrza podczas procesu

suszenia. Znacznie wydajniej, ze względu na ilość ciepła i powietrza zużytego na odparowanie

jednostki wody, przebiegało suszenie przy wyższych strumieniach surowca.

5.2.4. Aktywność

-amylazy w otrzymanych suszach

Średnią względną aktywność

-amylazy w otrzymanych suszach (obliczoną z równania

4.3), w zależności od temperatury powietrza wlotowego i strumienia surowca, przedstawiono

na rysunku 5.13 oraz w tabeli 10.16.

Aktywność względna

-amylazy w otrzymanych suszach wahała się od 56,7 do 90,1 %.

Zależała ona zarówno od zastosowanej temperatury suszenia, jak i strumienia surowca.

Omówienie i dyskusja wyników – Suszenie rozpyłowe

-amylazy

Najwyższą aktywność względną enzymu, od 86,6 do 90,1 %, zanotowano w suszach

otrzymanych poprzez suszenie przy strumieniu surowca 1,7 cm

/s. Susze otrzymane podczas

suszenia przy strumieniu surowca 0,4 cm

/s charakteryzowały się najniższą aktywnością

względną na poziomie od 56,7 do 66,0 %, w zależności od temperatury suszenia. Przy każdej

z zastosowanych temperatur powietrza wlotowego zwiększanie strumienia surowca wpływało

na zwiększenie aktywności enzymu w suszu. Przykładowo, średnia aktywność enzymu

suszonego w temperaturze powietrza wlotowego 160ºC przy czterech kolejnych strumieniach

surowca (0,4; 0,8; 1,2; 1,7 cm

/s) wynosiła kolejno: 66,0; 71,1; 80,2; 86,6 %. Wpływ

temperatury powietrza wlotowego na aktywność względną enzymu przy kolejnych strumieniach

surowca był różny. Przy zastosowaniu strumienia surowca 1,2 i 1,7 cm

/s obserwowano wzrost

aktywności względnej wraz ze wzrastającą temperaturą powietrza wlotowego. Przy strumieniu

surowca 0,4 cm

/s zależność ta była odwrotna, a przy strumieniu surowca 0,8 cm

początkowo obserwowano wzrost (przy wzroście temperatury od 160 do 180ºC) a następnie

100

140

160

180

200

220

240

ść w

lęd

-amylaz

(

)

0.4

0.8

1.3

1.7

Strumień surowca (cm

/s):

Temperatura powietrza wlotowego (

Rys. 5.13. Zależność między

średnią aktywnością względną
suszonej

-amylazy

a temperaturą powietrza

wlotowego i szybkością
zasilania; dane eksperymen-

talne: strumień surowca 0,4
cm

/s (



), 0,8 cm

/s (



), 1,2

/s (



), 1,7 cm

/s (



);

model dopasowany za pomocą

regresji prostej przy szybkości
zasilania 0,4 cm

(

—

) R

=0,99; 0,8 cm

/s (

—

)

=0,96; 1,2 cm

/s (

—

) R

0,86; 1,7 cm

/s (

—

) R

=0,99

zmniejszenie (przy wzroście temperatury od 180 do 200 i 220ºC) aktywności względnej

enzymu wraz ze wzrostem temperatury powietrza wlotowego.

Inaktywacja enzymów w czasie suszenia jest wywołana głównie działaniem podwyższonej

temperatury. Jednakże, jeśli przy bardzo intensywnych warunkach suszenia dochodzi do

usunięcia z układu również części wody strukturalnej stabilizującej strukturę białka, inaktywacja

Omówienie i dyskusja wyników – Suszenie rozpyłowe

-amylazy

może mieć również charakter ksero-inaktywacji (Strumiłło i wsp. 1991). Zależność między

końcową zawartością wody w suszu a aktywnością względną

-amylazy przedstawiono na

rysunku 5.14. Zgodnie z tym rysunkiem można stwierdzić, że aktywność enzymu w suszach

o niższej zawartości wody była niższa – w suszach o zawartości wody od 0,03 do

0,05 g H

O/g s.s. wynosiła od 56,7 do 75,3 %. W suszach o wyższej zawartości wody, od 0,07

do 0,11 g H

O/g s.s., aktywność enzymu kształtowała się na poziomie od 80,2 do 90,1 %.

Jednakże, na podstawie parabolicznego kształtu krzywej w zakresie wyższych zawartości wody,

można przypuszczać, że zależność między zwiększaniem zawartości wody w suszach

a zwiększaniem aktywności enzymu osiąga maksimum na pewnym poziomie zawartości wody.

Dalsze zwiększanie zawartości wody w suszu nie prowadzi do uzyskania większej aktywności

względnej

-amylazy po suszeniu rozpyłowym. Tę maksymalną wartość można nazwać

optymalną zawartością wody w suszu, ze względu na zachowanie aktywności

-amylazy.

Na podstawie danych eksperymentalnych wartość tę można oszacować na

0,07 – 0,09 g H

O/g s.s. Niemniej jednak, wartość ta odnosi się tylko do suszenia rozpyłowego

-amylazy w warunkach, jakie zastosowano w doświadczeniach.

Ponieważ, jak wcześniej wspomniano, zawartość wody w suszach jest ściśle związana

z temperaturą powietrza wylotowego w czasie suszenia, aktywność

-amylazy w suszach jest

również skorelowana z tą temperaturą (Rys. 5.15). Podobną zależność między aktywnością

względną enzymu (fosfataza alkaliczna) suszonego rozpyłowo a temperaturą powietrza

wylotowego w czasie suszenia podaje Etzel i wsp. (1997). Aktywność względna enzymu

suszonego w temperaturze powietrza wylotowego 80°C wynosiła 81 %, 100°C – 45 %,

120°C – 8,1 %.

Na podstawie danych eksperymentalnych można stwierdzić, że w celu otrzymania suszu

o wysokiej aktywności względnej

-amylazy, warunki suszenia należy dobrać tak, aby końcowa

zawartość wody kształtowała się na poziomie 0,07 – 0,09 g H

O/g s.s. Aby otrzymać susz o tej

zawartości wody temperatura powietrza wylotowego powinna wynosić 70 – 80°C.

Omówienie i dyskusja wyników – Suszenie rozpyłowe

-amylazy

= 0,8866

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

0,01

0,05

0,09

0,13

ść w

lęd

-a

mylaz

y (

Zawartość wody w suszu

(g H

O/g s.s.)

= 0,7497

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

100

120

ść w

lęd

-a

mylaz

y (

Temperatura powietrza

wylotowego (

Rys. 5.14. Zależność między średnią
aktywnością względną suszonej

-amylazy (%) a średnią zawartością

wody w suszach (g H

O/g s.s.); dane

eksperymentalne: 0,4 cm

/s (



) 0,8

/s (



),1,3 cm

/s (



), 1,7 cm

/s (



);

model dopasowany za pomocą regresji

prostej (—) (R

= 0,89)

Rys. 5.15. Zależność między średnią
aktywnością względną suszonej

-amylazy (%) a średnią temperaturą

wylotową w czasie suszenia
rozpyłowego (°C); dane eksperymen-

talne: 0,4 cm

/s (



) 0,8 cm

/s (



1,3 cm

/s (



), 1,7 cm

/s (



); model

dopasowany za pomocą regresji
prostej (—) (R

= 0,75)

Na podstawie przeprowadzonej analizy wariancji (Tabela 10.17) wpływ strumienia

surowca na aktywność względną

-amylazy został uznany za istotny statystycznie. Wpływ

temperatury powietrza wlotowego na aktywność enzymu został uznany za nieistotny, jednak

wydaje się, że wynik ten należy traktować z pewną ostrożnością. Jak wcześniej przedstawiono,

najważniejszym czynnikiem wpływającym na końcową aktywność enzymu była zawartość wody

w suszu. Ponieważ wpływ obu zmiennych parametrów suszenia na zawartość wody był istotny

statystycznie, to nie można stwierdzić, że zmiany temperatury powietrza wlotowego nie miały

istotnego wpływu na aktywność enzymu (uzależnioną od zawartości wody w suszu), jak

wskazywałaby dwuczynnikowa analiza wariancji. W tym przypadku zastosowanie analizy

wariancji nie prowadzi do właściwych wniosków, ponieważ nie uwzględnia ona dodatkowych

zależności między zmiennymi.

Ogólnie stwierdza się, że suszenie rozpyłowe jest odpowiednią metodą suszenia

-amylazy, ponieważ enzym ten charakteryzuje się zwiększoną odpornością na podwyższoną

temperaturę w warunkach obniżonej zawartości wody (Meerdink i van’t Riet 1991 i 1995,

Omówienie i dyskusja wyników – Suszenie rozpyłowe

-amylazy

Samborska i Witrowa-Rajchert 2002). Szczegółową analizę kinetyki inaktywacji

-amylazy

w systemach o różnej zawartości wody przedstawiono w części drugiej pracy. Ze względu na tę

właściwość, po suszeniu rozpyłowym (przy zastosowaniu odpowiednich parametrów suszenia),

w czasie którego czas działania wysokiej temperatury na materiał o wysokiej i średniej

zawartości wody jest bardzo krótki, względna aktywność enzymu jest wysoka. W czasie

suszenia rozpyłowego następuje szybkie odparowanie wody, zwiększające odporność

-amylazy na wysokie temperatury. Jednakże, jak wcześniej wspomniano, wpływ procesu

suszenia na aktywność enzymu nie zależy tylko od szybkości suszenia, powodującej

zwiększenie odporności cieplnej

-amylazy, lecz zależy również od końcowej zawartości wody

w preparacie enzymatycznym. Ta ostatnia nie może być niższa od pewnej wartości granicznej,

zapewniającej zachowanie nienaruszonej struktury białka. Dalsze zwiększanie intensywności

procesu suszenia nie prowadzi do większego zachowania aktywności enzymu. Tak więc,

w zakresie stosowanych parametrów eksperymentalnych, zwiększanie efektywności suszenia

poprzez zmniejszanie strumienia surowca nie prowadziło do otrzymania preparatu o wyższej

aktywności, ponieważ zwiększanie intensywności odparowania prowadziło do otrzymania suszy

o zawartości wody poniżej zawartości granicznej, gwarantującej zachowanie nienaruszonej

struktury białka. Jedynie rozpatrując wyniki otrzymane przy suszeniu z zastosowaniem

strumienia surowca 1,7 cm

/s oraz 1,3 cm

/s zaobserwowano pozytywny wpływ suszenia w

bardziej intensywnych warunkach na zwiększanie się aktywności względnej enzymu po

suszeniu. Podwyższanie temperatury wlotowej powietrza w obu przypadkach powodowało

zwiększenie końcowej aktywności względnej

-amylazy, co jest potwierdzeniem stwierdzenia,

że im szybsze odparowanie i przejście przez zakres wysokich i średnich zawartości wody,

w którym

-amylaza jest mało odporna na wysoką temperaturę, tym mniejsza degradacja

enzymu. W przypadku obu tych strumieni surowca zwiększanie intensywności suszenia poprzez

zwiększanie temperatury powietrza wlotowego i wylotowego powodowało również zmniejszanie

się zawartości wody, czemu towarzyszyło zwiększanie aktywności względnej enzymu. Można

zatem stwierdzić, że poprzez zwiększanie intensywności odparowania wody przy strumieniu

surowca 1,7 i 1,3 cm

/s zawartość wody w suszach zmniejszała się w kierunku zawartości

optymalnej, ze względu na maksymalne zachowanie aktywności enzymu. Wartość optymalna

zawartości wody została osiągnięta przy suszeniu w temperaturze 200 i 220°C przy strumieniu

surowca 1,7 i 1,3 cm

/s i wynosiła 0,07 – 0,09 g H

O/g s.s. Aktywność względna

-amylazy

suszona z zastosowaniem powyżej wymienionych parametrów wahała się od 85 do 90 %.

Jednakże dalsze zwiększanie szybkości odparowania, poprzez zmniejszenie strumienia surowca

do 0,8 i 0,4 cm

/s, nie wpływało pozytywnie na końcową aktywność enzymu, ponieważ zbyt

intensywne warunki wymiany masy i ciepła mogły prowadzić do usuwania lub naruszenia tzw.

Omówienie i dyskusja wyników – Suszenie rozpyłowe

-amylazy

wody strukturalnej, stabilizującej natywną konformację białka. Zbyt szybkie suszenie mogło

również uniemożliwić zastępowanie cząsteczek wody stabilizujących strukturę białka

cząsteczkami węglowodanów (np. glukozy obecnej w maltodekstrynie), co jest również znaną

przyczyną stabilizacji cząsteczek białka w warunkach obniżonej zawartości wody (Sun i wsp.

1998). Zwiększenie intensywności odparowania, poprzez zmniejszenie strumienia surowca do

0,8 cm

/s, spowodowało obniżenie aktywności względnej enzymu do poziomu od 65,7 do

75,3 %, w zależności od zastosowanej temperatury suszenia. Zwiększanie temperatury

suszenia oraz zmniejszanie zawartości wody w suszach, otrzymywanych przy tym strumieniu

surowca, powodowało zmniejszenie aktywności względnej amylazy, co mogło być związane

z coraz bardziej intensywnym naruszaniem struktury białka wywołanym usuwaniem wody

strukturalnej. Najniższą aktywność

-amylazy suszonej przy strumieniu surowca 0,8 cm

/s,

wynoszącą 65,7 %, zanotowano po suszeniu w temperaturze powietrza wlotowego 220°C.

Średnia zawartość wody w suszu otrzymanym w tych warunkach wynosiła 0,03 g H

O/g s.s.

Niemal identyczne wartości aktywności enzymu i zawartości wody otrzymano po suszeniu

z zastosowaniem najniższego strumienia surowca 0,4 cm

/s w temperaturze 160°C. Dalsze

zwiększanie intensywności suszenia poprzez zwiększanie temperatury powietrza wlotowego nie

prowadziło jednak do zmniejszania zawartości wody w suszach. Można więc przyjąć, że

zawartość wody na poziomie około 0,03 g H

O/g s.s. jest wartością minimalną, jaką można

uzyskać w danych warunkach eksperymentalnych. Można przypuszczać, że cała ilość wody

możliwej do usunięcia została odparowana. Zwiększanie temperatury powietrza wlotowego

powodowało obniżanie aktywności względnej enzymu z poziomu od 64,3 do 56,7 %

Omówienie i dyskusja wyników – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

w temperaturach powietrza wlotowego odpowiednio 160 i 220°C. Jednakże, aktywność

względna enzymu suszonego przy najbardziej intensywnych warunkach procesu odparowania

(56 %, 0,4 cm

/s, 220°C) była również dość wysoka. Mimo znacznego wysuszenia i możliwego

naruszenia wody strukturalnej, podwyższenie termostabilności enzymu poprzez szybkie

odparowanie oraz krótki czas suszenia i działania podwyższonej temperatury na enzym

pozwoliły na zachowanie ponad 50 % aktywności początkowej enzymu.

5.2.5. Podsumowanie

Głównym parametrem decydującym o końcowej aktywności względnej suszonej

-amylazy jest końcowa zawartość wody w suszu. Szybkie odparowanie wody, jakie następuje

w czasie suszenia rozpyłowego, jest korzystne ze względu na zwiększanie się odporności

enzymu na podwyższoną temperaturę, jednak nie może ono prowadzić do zbyt dużego stopnia

wysuszenia prowadzącego do naruszenia struktury białka w wyniku usuwania wody

strukturalnej. Zawartość wody gwarantująca uzyskanie maksymalnej stabilności cieplnej

-amylazy, gdy nie występuje jeszcze niekorzystny wpływ dehydracji związany z niszczeniem

struktury białka, może być nazwana optymalną zawartością wody w preparacie

enzymatycznym, gwarantującą maksymalne zachowanie aktywności enzymu.

Zastosowane parametry suszenia, przy których osiągnięto optymalną zawartość wody,

gwarantujące maksymalne zachowanie aktywności enzymatycznej preparatu

-amylazy,

okazały się również korzystne z punktu widzenia ekonomiczności procesu suszenia (najmniejsze

wartości właściwego zużycia powietrza i ciepła).

5.3. KINETYKA INAKTYWACJI CIEPLNEJ

-AMYLAZY

5.3.1. Optymalizacja oznaczenia aktywności

-amylazy

Po wykonaniu oznaczenia aktywności

-amylazy przy siedmiu stężeniach enzymu

otrzymywano wykres jak na rysunku 5.16A. Powyżej stężenia 1,8 FAU/cm

wykres zaczął

przyjmować postać nieprostoliniową, wskazując na to, że enzym nie był już wysycany

substratem. W czasie oznaczenia aktywności objawiało się to również spłaszczeniem wykresu

absorbancji w funkcji czasu (Rys. 5.17).

Przyjęto, że maksymalne stężenie początkowe amylazy, zapewniające wykonywanie

oznaczenia w warunkach wysycenia enzymu substratem w czasie trwania całego oznaczenia

wynosi 1,8 FAU/cm

(Rys. 5.16B).

Omówienie i dyskusja wyników – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

Stężenie

-amylazy (FAU/ml)

A
B

Rys. 5.16. Zależność między

stężeniem

-amylazy

a oznaczoną aktywnością:
w warunkach wysycenia enzymu
substratem (



) R

=0,99;

w warunkach niedosytu
substratu (



)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

120

180

240

Czas (s)

Rys 5.17. Przykładowy wykres
uzyskany w czasie oznaczenia

aktywności amylazy przy zbyt
dużym stężeniu enzymu. Po

180 s trwania oznaczenia cały
substrat został zużyty

5.3.2. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w systemach o różnej

zawartości wody

Badanie kinetyki inaktywacji cieplnej a-amylazy prowadzono w trzech systemach

o wysokiej zawartości wody (roztwory S1, S2 i S3) oraz w trzech systemach o niskiej

zawartości wody (suszone liofilizacyjnie proszki S4, S5 i S6).

5.3.2.1. Adsorpcja pary wodnej i izoterma sorpcji

Końcową zawartość wody w suszonych liofilizacyjnie próbkach, po adsorpcji wody do

stanu równowagi nad nasyconymi roztworami soli, przedstawiono w tabeli 5.2.

Tabela 5.2. Zawartość wody w próbkach po adsorpcji wody do stanu

równowagi przy aktywności wody od 0,11 do 0,98; systemy o niskiej

Omówienie i dyskusja wyników – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

zawartości

wody S4-S6

Równowagowa wilgotność

względna nasyconych roztworów

soli w temperaturze 4°C (%)

Zawartość wody w próbkach

(g H

O/g s.s.)

LiCl

11,26 ± 0,47

0,029 ± 0,001 (S6)

COOK

23,38 ±0,53

0,048 ± 0,004

MgCl

33,60 ± 0,28

0,060 ± 0,003 (S5)

43,13 ± 0,30

0,078 ± 0,001

NaBr

63,51 ± 0,72

0,163 ± 0,007 (S4)

80,55 ± 0,96

0,381 ± 0,015

98,48 ± 0,91

2,722 ± 0,131

Na podstawie otrzymanych wartości wykreślono izotermę sorpcji, którą przedstawiono na

rysunku 5.18. Do danych eksperymentalnych za pomocą regresji nieliniowej dopasowano

model opierający się na równaniu GAB. Na rysunku 5.19. przedstawiono porównanie danych

eksperymentalnych z danymi uzyskanymi po dopasowaniu modelu.

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

0,2

0,4

0,6

0,8

Aktywność wody

art

ść

H2O

0,5

1,5

2,5

0,5

1,5

2,5

Zawartość wody (exp)

ść

)

Rys. 5.18. Izoterma sorpcji

-amylazy

suszonej w obecności maltodekstryny: dane
eksperymentalne (), model dopasowany za
pomocą regresji nieliniowej na podstawie

równania GAB (



)

Rys. 5.19. Porównanie danych

eksperymentalnych (exp)
z wartościami uzyskanymi

poprzez dopasowanie modelu za
pomocą regresji nieliniowej

(pred)

Ponieważ zawartość białka enzymatycznego w materiale suszonym wynosiła zaledwie

1,4 g/100 g s.s. maltodekstryny, a więc 1,4 % materiału, kształt izotermy, który jest zależny od

składu chemicznego, był uwarunkowany głównie obecnością cukrów.

5.3.2.2. Parametry kinetyczne inaktywacji

-amylazy

Omówienie i dyskusja wyników – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

Na rysunku 5.20. przedstawiono wyniki inaktywacji cieplnej enzymu w systemach

S1 – S3 w czasie 5 minut w temperaturach 40, 55, 70, 85 i 100°C. Inaktywacja enzymu

w systemach o zmniejszającej się zawartości wody następowała przy wyższych temperaturach.

W systemie S1 (roztworze wodnym bez dodatku maltodekstryny) całkowita inaktywacja

enzymu w czasie 5 minut następowała już w temperaturze 70°C. Dodatek maltodekstryny do

roztworu wodnego wpłynął na podwyższenie temperatury, w której następowała całkowita

inaktywacja enzymu. W systemie S2 (3,5 g H

O/g s.s.) i S3 (1,8 g H

O/g s.s.) była to

temperatura 85°C. Jednakże, odporność enzymu na podwyższoną temperaturę w obu tych

systemach w temperaturze pomiędzy 55 a 85°C różniła się. Po 5 minutach inaktywacji

w temperaturze 70°C aktywność względna enzymu w systemie S2 wynosiła 63 %,

a w systemie S3 równa była 89 %. Na podstawie tych doświadczeń dokonano wyboru czterech

temperatur dla każdego systemu S1 – S3, przy których następnie badano dokładnie kinetykę

inaktywacji. Temperatury te oraz czasy inaktywacji przedstawiono wcześniej w tabeli 4.1.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

100

Temperatura (

Rys. 5.20. Inaktywacja cieplna

-amylazy w czasie 5 min:

system S1 (







S2 (







), S3 (







)

Kinetyka inaktywacji

-amylazy w systemach S1 – S5 mogła być ściśle opisana

równaniem reakcji pierwszego rzędu. Świadczy o tym linearność zależności log

czasu (wykresy prezentowane poniżej dla wszystkich systemów) oraz ln

od czasu (wykres

prezentowany poniżej dla systemu S1) oraz wysokie współczynniki determinacji R

, na

poziomie od 0,95 do 0,99, uzyskane po dopasowaniu modelu do danych eksperymentalnych za

pomocą regresji liniowej. Stałe szybkości reakcji inaktywacji

-amylazy

w systemach

o wysokiej i niskiej zawartości wody, wyznaczone po dopasowaniu danych eksperymentalnych

do modelu reakcji pierwszego rzędu w oparciu o równanie 4.11, przedstawiono w tabeli 5.3.

W tabeli 5.4. przedstawiono czasy dziesięciokrotnej redukcji aktywności enzymu

wyznaczone

na podstawie równania 4.13.

Omówienie i dyskusja wyników – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

Kinetykę inaktywacji

-amylazy w systemie S1 (roztwór wodny bez dodatku

maltodekstryny), opisaną modelem reakcji pierwszego rzędu, przedstawiono na rysunkach 5.21

i 5.22 oraz w tabeli 10.18. Czas dziesięciokrotnej redukcji

jest to czas, przy którym wartość

log

przy danej temperaturze osiąga wartość –1. Wartość ta zmniejsza się wraz ze

wzrostem temperatury, tzn. obniżenie aktywności początkowej enzymu o 90 % zachodzi

w krótszym czasie. W systemie S1 wartość

w temperaturach 62,5; 65,0; 67,5 i 70,0°C

wynosiła odpowiednio 17,4; 8,9; 7,0 i 2,7 min. Stała szybkości reakcji inaktywacji

jest

wartością bezwzględną współczynnika nachylenia prostej na wykresie zależności ln

czasu (Rys. 5.22). Ulega ona zwiększeniu wraz ze wzrostem temperatury, tzn., że reakcja

inaktywacji przebiega z większą szybkością. W systemie S1 wartość

w temperaturach 62,5;

65,0; 67,5 i 70,0°C wynosiła odpowiednio 0,132; 0,258; 0,330 i 0,826 min

-1

Wyznaczenie kinetycznych parametrów pierwszorzędowych

na podstawie zależności

log

od czasu oraz ln

od czasu było pierwszym etapem wyznaczania parametrów

kinetycznych w dwustopniowej metodzie regresji liniowej. Drugim etapem było wyznaczenie

parametrów drugorzędowych

za pomocą regresji liniowej na podstawie zależności log

od temperatury i ln

od odwrotności temperatury absolutnej zgodnie z równaniami 4.14 i 4.12.

Kinetyczne parametry drugorzędowe przedstawiono w dalszej części pracy.

Zależność między czasem inaktywacji a aktywnością

-amylazy w czterech różnych

temperaturach w systemie S1 przedstawiono na rysunku 5.23. Dane eksperymentalne

opisywano za pomocą regresji nieliniowej modelem równania reakcji pierwszego rzędu,

połączonym z równaniem Arrheniusa zgodnie z równaniem 4.17 lub na podstawie modelu

czasu śmierci cieplnej zgodnie z równaniem 4.18. Na rysunku 5.23 dane uzyskane na

podstawie modelu przedstawiono liniami ciągłymi o kolorach odpowiadających kolorom serii

danych eksperymentalnych otrzymanych w kolejnych temperaturach. Na rysunku 5.24

przedstawiono porównanie danych eksperymentalnych inaktywacji

-amylazy w systemie S1 z

wartościami uzyskanymi poprzez dopasowanie modelu za pomocą regresji nieliniowej.

Zgrupowanie punktów wokół prostej x=y świadczy o dobrym dopasowaniu zastosowanego

modelu.

Omówienie i dyskusja wyników – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

Czas (min)

62,5

65,0

67,5

70,0

Temperatura (

Rys. 5.21. Kinetyka

inaktywacji

-amylazy

w systemie S1: dane
eksperymentalne otrzymane
w temperaturze 62,5°C (



);

65,0°C (



); 67,5°C (



);

70,0°C (



), model dopaso-

wany za pomocą regresji

liniowej dla temperatury
62,5°C (



) R

=0,99; 65,0°C

(



) R

=0,99; 67,5°C (



)

=0,98; 70,0°C (



) R

=0,95

-5

-4

-3

-2

-1

Czas (min)

62,5

65,0

67,5

70,0

Temperatura (

Rys. 5.22. Kinetyka

inaktywacji

-amylazy

w systemie S1: dane
eksperymentalne otrzymane
w temperaturze 62,5°C (



);

65,0°C (



); 67,5°C (



);

70,0°C (



), model dopaso-

wany za pomocą regresji

liniowej dla temperatury
62,5°C (



) R

=0,99; 65,0°C

(



) R

=0,99; 67,5°C (



)

=0,98; 70,0°C (



) R

=0,95

Omówienie i dyskusja wyników – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

0,2

0,4

0,6

0,8

Czas (min)

62,5 65,0 67,5 70,0

Temperatura (

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

A/A

(exp)

(

)

Rys. 5.23. Zależność między czasem
inaktywacji a aktywnością względną

-amylazy

w systemie S1 (woda): dane eksperymentalne
otrzymane w temperaturze 62,5°C (



); 65,0°C

(



); 67,5°C (



); 70,0°C (



), model dopaso-

wany za pomocą regresji nieliniowej dla
temperatury 62,5°C (



); 65,0°C (



);

67,5°C (



)

; 70,0°C (



)

Rys. 5.24. Porównanie danych
eksperymentalnych (exp)

inaktywacji

-amylazy

w systemie S1 z wartościami
uzyskanymi poprzez dopaso-

wanie modelu za pomocą regresji
nieliniowej (pred)

Dla kolejnych systemów S2 – S5 o zmniejszającej się zawartości wody, w których

badano kinetykę inaktywacji

-amylazy, przedstawiono wykresy zależności log

od czasu

(regresja liniowa),

od czasu (regresja nieliniowa) oraz graficzne porównanie danych

eksperymentalnych inaktywacji z wartościami uzyskanymi poprzez dopasowanie modelu za

pomocą regresji nieliniowej. Wyniki przeprowadzonych eksperymentów przedstawiono

w tabelach 10.19 (system S2), 10.20 (system S3), 10.21 (system S4), 10.22 (system S5).

Omówienie i dyskusja wyników – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

0,2

0,4

0,6

0,8

Czas (min)

70,0

72,5

73,5

75,0

Temperatura (

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

A/A

(exp)

(

)

Rys. 5.25. Zależność między czasem

inaktywacji a aktywnością względną

-amylazy

w systemie S2: dane eksperymentalne
otrzymane w temperaturze 70,0°C (



); 72,5°C

(



); 73,5°C (



); 75,0°C (



), model dopaso-

wany za pomocą regresji nieliniowej dla

temperatury 70,0°C (



); 72,5°C (



);

73,5°C (



)

; 75,0°C (



)

Rys. 5.26. Porównanie danych

eksperymentalnych (exp)
inaktywacji

-amylazy

w systemie S2 z wartościami

uzyskanymi poprzez dopaso-
wanie modelu za pomocą regresji

nieliniowej (pred)

-1,5

-1

-0,5

Czas (min)

75,0

73,5

72,5

70,0

Temperatura (

Rys. 5.27. Kinetyka inaktywacji

-amylazy w systemie S2: dane

eksperymentalne w temperaturze
70,0°C (



); 72,5°C (



); 73,5°C

(



); 75,0°C (



), model

dopasowany za pomocą regresji

liniowej dla temperatury 70,0°C
(



) R

=0,98; 72,5°C (



)

=0,99; 73,5°C (



)

=0,99;

75,0°C (



) R

=0,99

Omówienie i dyskusja wyników – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

0,2

0,4

0,6

0,8

Czas (min)

73,5

75,0

76,5

78,5

Temperatura (

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

A/A

(exp)

(

)

Rys. 5.28. Zależność między czasem

inaktywacji a aktywnością względną

-amylazy

w systemie S3: dane eksperymentalne
otrzymane w temperaturze 73,5°C (



); 75,0°C

(



); 76,5°C (



); 78,5°C (



), model dopaso-

wany za pomocą regresji nieliniowej dla

temperatury 73,5°C (



); 75,0°C (



);

76,5°C (



)

; 75,8°C (



)

Rys. 5.29. Porównanie danych

eksperymentalnych (exp)
inaktywacji

-amylazy

w systemie S3 z wartościami

uzyskanymi poprzez dopaso-
wanie modelu za pomocą regresji

nieliniowej (pred)

-1,5

-1

-0,5

Czas (min)

78,5

76,5

75,0

73,5

Temperatura (

Rys. 5.30. Kinetyka inaktywacji

-amylazy w systemie S3: dane

eksperymentalne w temperaturze
73,5°C (



); 75,0°C (



); 76,5°C

(



); 78,5°C (



), model

dopasowany za pomocą regresji

liniowej dla temperatury 73,5°C
(



) R

=0,99; 75,0°C (



)

=0,98; 76,5°C (



)

=0,97;

78,5°C (



) R

=0,97

Omówienie i dyskusja wyników – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

0,2

0,4

0,6

0,8

Czas (min)

95,0

97,0

98,5

100

Temperatura (

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

A/A

(exp)

(

)

Rys. 5.31. Zależność między czasem

inaktywacji a aktywnością względną

-amylazy

w systemie S4: dane eksperymentalne
otrzymane w temperaturze 95,0°C (



); 97,0°C

(



); 98,5°C (



); 100,0°C (



), model dopaso-

wany za pomocą regresji nieliniowej dla

temperatury 95,0°C (



); 97,0°C (



);

98,5°C (



)

; 100,0°C (



)

Rys. 5.32. Porównanie danych

eksperymentalnych (exp)
inaktywacji

-amylazy

w systemie S4 z wartościami

uzyskanymi poprzez dopaso-
wanie modelu za pomocą regresji

nieliniowej (pred)

-2

-1,5

-1

-0,5

Czas (min)

95,0

97,0

98,5

100

Temperatura (

Rys. 5.33. Kinetyka inaktywacji

-amylazy w systemie S4: dane

eksperymentalne w temperaturze
95,0°C (



); 97,0°C (



); 98,5°C

(



); 100,0°C (



), model

dopasowany za pomocą regresji

liniowej dla temperatury 95,0°C
(



) R

=0,98; 97,0°C (



)

=0,99; 98,5°C (



)

=0,99;

100,0°C (



) R

=0,97

Omówienie i dyskusja wyników – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

0,2

0,4

0,6

0,8

Czas (min)

100,0 102,5
105,0 107,5

Temperatura (

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

A/A

(exp)

(

)

Rys. 5.34. Zależność między czasem

inaktywacji a aktywnością względną

-amylazy

w systemie S5: dane eksperymentalne
otrzymane w temperaturze 100,0°C (



);

102,5°C (



); 105,0°C (



); 107,5°C (



model dopasowany za pomocą regresji

nieliniowej dla temperatury 100,0°C (



);

102,5°C (



); 105,0°C (



)

; 107,5°C (



)

Rys. 5.35. Porównanie danych

eksperymentalnych (exp)
inaktywacji

-amylazy

w systemie S5 z wartościami

uzyskanymi poprzez dopaso-
wanie modelu za pomocą regresji

nieliniowej (pred)

-1,5

-1

-0,5

Czas (min)

100,0

102,5

105,0

107,5

Temperatura (

Rys. 5.36. Kinetyka inaktywacji

-amylazy w systemie S5: dane

eksperymentalne w temperaturze
100,0°C (



); 102,5°C (



);

105,0°C (



); 107,5°C (



model dopasowany za pomocą

regresji liniowej dla temperatury
100,0°C (



) R

=0,98; 102,5°C

(



) R

=0,98; 105,0°C (



)

=0,98; 107,5°C (



) R

=0,96

Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w systemie S6 o najniższej zawartości wody

0,029 g H

O/g s.s. nie mogła być opisana modelem reakcji pierwszego rzędu, tak jak

w pozostałych systemach. Lepsze dopasowanie do danych eksperymentalnych wykazał model

„biphasic” (równanie 2.7), zakładający istnienie dwóch frakcji enzymu – termolabilnej (a

)

i termostabilnej (a

). W dalszej części pracy termolabilna frakcja enzymu w systemie S6 będzie

oznaczana jako S6l, a frakcja termostabilna jako S6s. Według modelu „biphasic” obie frakcje

Omówienie i dyskusja wyników – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

enzymu niezależnie od siebie podlegają inaktywacji zgodnie z modelem reakcji pierwszego

rzędu. Frakcja labilna wykazuje większą wartość stałej inaktywacji

(Tabela 5.3) i mniejszą

wartość czasu dziesięciokrotnej redukcji

(Tabela 5.4). Wyniki eksperymentów mających na

celu zbadanie kinetyki inaktywacji

-amylazy w systemie S6 przedstawiono tabeli 10.23.

Zależność między czasem inaktywacji a aktywnością

-amylazy w czterech różnych

temperaturach w systemie S6 przedstawiono na rysunku 5.37. Dane eksperymentalne

opisywano za pomocą regresji nieliniowej modelem „biphasic”, czyli niezależnie dla obu

frakcji enzymu równaniem reakcji pierwszego rzędu połączonym z równaniem Arrheniusa

zgodnie z równaniem 4.17 lub na podstawie modelu czasu śmierci cieplnej zgodnie

z równaniem 4.18. Na rysunku 5.37 dane uzyskane na podstawie modelu przedstawiono liniami

ciągłymi o kolorach odpowiadających kolorom serii danych eksperymentalnych otrzymanych w

kolejnych temperaturach. Na rysunku 5.38. przedstawiono porównanie danych

eksperymentalnych inaktywacji

-amylazy w systemie S6 z wartościami uzyskanymi poprzez

dopasowanie modelu za pomocą regresji nieliniowej. Zgrupowanie punktów wokół prostej x=y

świadczy o dobrym dopasowaniu zastosowanego modelu.

0,2

0,4

0,6

0,8

Czas (min)

100

105

110

115

Temperatura (

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

A/A

(exp)

(

)

Rys. 5.37. Zależność między czasem
inaktywacji a aktywnością względną

-amylazy

w systemie S6: dane eksperymentalne
otrzymane w temperaturze 100,0°C (



);

105,0°C (



); 110,0°C (



); 115,0°C (



model dopasowany za pomocą regresji
nieliniowej dla temperatury 100,0°C (



);

105,0°C (



); 110,0°C (



)

; 115,0°C (



)

Rys. 5.38. Porównanie danych
eksperymentalnych (exp)

inaktywacji

-amylazy

w systemie S6 z wartościami
uzyskanymi poprzez dopaso-

wanie modelu za pomocą regresji
nieliniowej (pred)

W tabeli 5.3 przedstawiono stałe szybkości reakcji inaktywacji

-amylazy

, a w tabeli 5.4

czas dziesięciokrotnej redukcji aktywności

-amylazy w systemach o wysokiej i niskiej

Omówienie i dyskusja wyników – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

zawartości wody. Obserwowano znaczne zwiększanie stabilności cieplnej

-amylazy wraz

z obniżaniem zawartości wody. Na podstawie przedstawionych tabel oraz wykresów można

zaobserwować, że wraz ze zmniejszaniem się zawartości wody zakres temperatur, w których

następowała inaktywacja cieplna

-amylazy, przesuwał się w kierunku wyższych temperatur.

Enzym w roztworze wodnym (S1) ulegał inaktywacji cieplnej w zakresie temperatury od 62,5

do 70,0°C. Po zmniejszeniu zawartości wody do 0,029 g H

O/g s.s. (S6) temperaturę, w której

badano kinetykę inaktywacji cieplnej enzymu, zwiększono do 100 – 115°C w celu uzyskania

mierzalnych wartości

. W przypadku zastosowania tej samej temperatury w systemach

o różnej zawartości wody obserwowano mniejszą wartość stałej szybkości reakcji inaktywacji

oraz większy czas dziesięciokrotnej redukcji w systemie o niższej zawartości wody.

Przykładowo, w temperaturze 75°C stała szybkości inaktywacji

wynosząca

0,100

0,006 min

-1

w systemie S3 o zawartości wody 1,8 g H

O/g s.s. uległa zwiększeniu do

0,365

0,016 min

-1

, gdy zawartość wody wzrosła do 3,5 g H

O/g s.s. (S2). Równocześnie czas

dziesięciokrotnej redukcji

zmniejszył się z 22,9

1,3 do 6,3

0,3 min.

Podobny ochronny wpływ niskiej zawartości wody na stabilność cieplną

-amylazy był

obserwowany wcześniej przez Terebiznik i wsp. (1997) (

-amylaza z

Aspergillus oryzae

) oraz

Saraiva i wsp. (1992 i 1996) i Haentjens i wsp. (1998) (

-amylaza pochodzenia bakteryjnego

z gatunku

Bacillus

W pracy przedstawionej przez Terebiznik i wsp. (1997) badano stabilność

cieplną

-amylazy z

Aspergillus oryzae

w roztworze wodnym oraz w systemie o niskiej

zawartości wody otrzymanym poprzez liofilizację i adsorpcję wody do stanu równowagi nad

nasyconym roztworem CH

COOK. Usuwanie wody wpłynęło na znaczne zwiększenie stabilności

cieplnej enzymu. Czas potrzebny do obniżenia aktywności enzymu o połowę, w czasie obróbki

cieplnej w 60°C, wynoszący 6 min w przypadku badania kinetyki inaktywacji w roztworze

wodnym, wzrósł do 100 min, gdy kinetykę badano w systemie o niskiej zawartości wody. Ze

względu na niepodawanie przez autorów wyżej cytowanej publikacji czasów dziesięciokrotnej

redukcji

i stałych szybkości reakcji

, trudne jest bezpośrednie porównanie wyników

otrzymanych w bieżącej pracy, poza stwierdzeniem, że obserwowano podobny wpływ

stabilizujący niskiej zawartości wody.

W systemie S6 o zawartości wody 0,029 g H

O/g s.s. kinetyka inaktywacji stabilnej frakcji

-amylazy (S6s) charakteryzowała się zacznie niższymi wartościami stałej szybkości

inaktywacji

oraz wyższymi wartościami czasu dziesięciokrotnej redukcji

w porównaniu

z frakcja labilną (S6l). Przykładowo, w temperaturze 105°C stała szybkości inaktywacji frakcji

labilnej enzymu wynosiła 0,386 ± 0,112 min

-1

, podczas gdy dla frakcji stabilnej wartość ta

wynosiła 0,070 ± 0,049 min

-1

Omówienie i dyskusja wyników – Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy

Istnienie dwóch frakcji enzymu o różnej stabilności cieplnej w systemie o najniższej

zawartości wody S6, może być związane z podatnością maltodekstryny na tworzenie stanu

szklistego w czasie suszenia oraz z teorią przemiany szklistej (Samborska i wsp. 2004). Ross

i Karel (1991) podają temperaturę przemiany szklistej maltodekstryny (DE 5) o różnej

zawartości wody (Rys. 2.16.). Jeśli porówna się przedstawione wartości z temperaturą, w której

prowadzono badanie kinetyki inaktywacji

-amylazy w systemach o różnej zawartości wody,

można zauważyć, że jedynie w przypadku systemu S6 badanie kinetyki prowadzono

w temperaturze poniżej temperatury przemiany szklistej. W przypadku systemu S4 wartość T

oszacowana na podstawie rysunku 2.15 wynosi około 25°C, podczas gdy badanie kinetyki

inaktywacji prowadzono w temperaturach od 95 – 100°C. Podobnie w przypadku systemu S5,

w którym wartość T

wynosząca 87°C również była niższa od temperatury stosowanej w czasie

badania kinetyki inaktywacji cieplnej. Wynika z tego, że stan szklisty wytworzony w czasie

liofilizacji ulegał uplastycznieniu w czasie obróbki cieplnej. Jedynie w przypadku systemu S6,

o najniższej zawartości wody, temperatura przemiany szklistej wynosząca około 120°C była

wyższa niż temperatura stosowana w czasie obróbki cieplnej (100 – 115°C). Można więc

przypuszczać, że maltodekstryna w tym systemie, w czasie badania kinetyki inaktywacji

cieplnej, występowała w stanie szklistym. Jednakże, ponieważ przemiana szklista nie jest

przemianą zachodzącą „nagle” w temperaturze T

, lecz stopniowo w pewnym zakresie

temperatur zbliżonych do T

, można przypuszczać, że niewielka różnica temperatur pomiędzy

temperaturą przemiany szklistej a temperaturą obróbki cieplnej mogła spowodować tylko

częściowe występowanie maltodekstryny w systemie S6 w stanie szklistym, co z kolei mogło

być przyczyną występowania dwóch frakcji enzymu o różnej stabilności cieplnej. Stabilna

frakcja enzymu, unieruchomiona w stanie szklistym, charakteryzowała się mniejszą stałą

szybkości reakcji inaktywacji niż frakcja labilna, znajdująca się w częściowo uplastycznionych

regionach polimeru. Wartość stałej szybkości reakcji inaktywacji frakcji labilnej enzymu

w systemie S6 była zbliżona do wartości w systemie S5, co potwierdza powyższe rozważania.

Wysoka lepkość składników występujących w stanie szklistym oraz znacznie ograniczona

ruchliwość cząsteczek są znanymi przyczynami stabilizacji struktury białek w wyniku

uniemożliwiania zachodzenia zmian konformacyjnych prowadzących do denaturacji (Buitink

i wsp. 2000).

Obecność dwóch frakcji enzymu w systemie S6 można również wyjaśnić faktem, że stan

szklisty może być złożony z bardziej i mniej zagęszczonych regionów. Te drugie, nazywane np.

„niejednorodnościami” (ang. „heterogenities”) lub „fluktuacjami gęstości” (ang. „density

Tabela 5.3. Stała szybkości reakcji inaktywacji cieplnej

-amylazy w systemach o wysokiej i niskiej zawartości

wody

S6l

S6s

0,029 g H

O/g s.s.

Frakcja labilna

Frakcja stabilna

0,060 g H

O/g s.s. 0,163 g H

O/g s.s.

1,8 g H

O/g s.s.

3,5 g H

O/g s.s.

Roztwór wodny

enzymu bez

dodatku

maltodekstryny

Temp. (

k (min

-1

)

62,5

0,132 (± 0,005)

65,0

0,258 (± 0,005)

67,5

0,330 (± 0,018)

70,0

0,071 (± 0,004)

0,826 (± 0,080)

72,5

0,130 (± 0,003)

73,5

0,058 (± 0,003)

0,192 (± 0,007)

75,0

0,100 (± 0,006)

0,364 (± 0,016)

76,5

0,216 (± 0,014)

78,5

0,497 (± 0,041)

95,0

0,072 (± 0,033)

97,0

0,103 (± 0,009)

98,5

0,232 (± 0,005)

100,0

0,066 (± 0,004)

0,095 (± 0,004)

0,411 (± 0,005)

102,5

0,140 (± 0,008)

105,0

0,386 (± 0,112)

0,070 (± 0,049)

0,268 (± 0,017)

107,5

0,638 (± 0,060)

110,0

1,828 (± 0,247)

0,188 (± 0,029)

115,0

2,028 (± 0,027)

0,300 (± 0,006)

Tabela 5.4. Czas dziesięciokrotnej redukcji aktywności

-amylazy w systemach o wysokiej i niskiej zawartości wody

S6l

S6s

0,029 g H

O/g s.s.

Frakcja labilna

Frakcja stabilna

0,060 g H

O/g s.s. 0,163 g H

O/g s.s.

1,8 g H

O/g s.s.

3,5 g H

O/g s.s.

Roztwór wodny

enzymu bez

dodatku

maltodekstryny.

Temp. (

D (min)

62,5

17,4 ± 0,6

65,0

8,9 ± 0,2

67,5

7,0 ± 0,4

70,0

32,3 ± 1,7

2,7 ± 0,3

72,5

17,7 ± 0,4

73,5

40,0 ± 2,1

12,0 ± 0,4

75,0

22,9 ± 1,3

6,3 ± 0,3

76,5

10,7 ± 0,7

78,5

4,6 ± 0,4

95,0

31,9 ± 2,1

97,0

22,4 ± 1,1

98,5

9,9 ± 0,4

100,0

34,8 ± 2,4

24,2 ± 1,1

5,6 ± 0,5

102,5

16,5 ± 0,9

105,0

5,9 ± 1,7

32,8 ± 23,0

8,6 ± 0,5

107,5

3,6 ± 0,3

110,0

1,3 ± 0,2

12,3 ± 1,8

115,0

1,1 ± 0,01

7,6 ± 0,1

fluctuations”), są obszarami mobilnymi, w których mogą występować ruchy polimerów lub ruchy uwięzionego wewnątrz gazu i małych cząsteczek

(Rounant i wsp. 2004, Chan i wsp. 1984, Stillinger i Hodgon 1994). Enzym znajdujący się w takim regionie polimeru o zwiększonej możliwości

występowania ruchów cząsteczek, może charakteryzować się mniejszą stabilnością cieplną niż enzym znajdujący się w bardziej „unieruchomionej”

frakcji stanu szklistego.

Występowanie dwóch frakcji enzymu o różnej stabilności cieplnej zaobserwowali również De Cordt i wsp. (1994), badając kinetykę

inaktywacji cieplnej

-amylazy z

Bacillus licheniformis

unieruchomionej na złożu koralików krzemionkowych pokrytych warstwą silikonu.

Należy jednak zauważyć, że

-amylaza w systemach, które powyżej uznano za występujące w czasie obróbki cieplnej w stanie lepko-

sprężystym, również wykazuje zwiększającą się stabilność cieplną wraz ze zmniejszaniem zawartości wody. Oznacza to, że występowanie

maltodekstryny w stanie szklistym nie jest głównym czynnikiem wpływającym na odporność cieplną enzymu. Jak wcześniej wspominano, istotne

jest ograniczenie ruchliwości cząsteczek w warunkach niskiej zawartości wody, uniemożliwiające zachodzenie zmian strukturalnych prowadzących

do denaturacji białka. Istotną rolę w procesie stabilizacji pełni również zastępowanie cząsteczek wody niezbędnych do utrzymania natywnej

struktury białka przez cząsteczki cukru, w wyniku tworzenia wiązań wodorowych (Terebiznik i wsp. 1998). Przy zmniejszającej się zawartości

wody a zwiększającej względnej zawartości cukrów, wymiana ta staje się coraz bardziej efektywna, co razem ze zmniejszającą się ruchliwością

cząsteczek przyczynia się do stabilizacji struktury białka, nawet gdy kinetyka inaktywacji badana jest

w temperaturach powyżej temperatury przemiany szklistej. Ponadto, pewną rolę w stabilizacji

-amylazy mogą odgrywać bezpośrednie oddziaływania maltodekstryny jako substratu tego enzymu, z jego centrum aktywnym, powodujące

usztywnianie

cząsteczki

białka

(De

Cordt

i wsp. 1994).

Wyniki

otrzymane

tej

części

pracy,

stwierdzające

wzrost

odporności

cieplnej

-amylazy w systemach o niskiej zawartości wody, są pomocne w wytłumaczeniu korzystnego wpływu suszenia rozpyłowego na zachowanie

aktywności enzymu. Ponieważ w czasie tego rodzaju suszenia następuje szybkie odparowanie wody, to równocześnie następuje szybki wzrost

odporności

-amylazy na działanie podwyższonej temperatury, a czas przebywania enzymu o niskiej odporności cieplnej (w środowisku o wysokiej

zawartości wody) w środowisku o podwyższonej temperaturze jest bardzo krótki. To pozwala na otrzymanie preparatu enzymatycznego o

wysokiej aktywności. Jednakże, pomimo tego, że w obu częściach pracy zmiany zawartości wody były w tym samym zakresie – od 3,5 do 0,03

g H

O/g s.s, to wyników otrzymanych w obu częściach pracy nie można porównywać bezpośrednio. W dyskusji wyników

dotyczących suszenia rozpyłowego zwrócono uwagę, że susze o najniższej zawartości wody (około 0,03 g H

O/g s.s.) wykazywały najniższą

aktywność względną, mimo, że w drugiej części pracy wykazano, że przy tej zawartości wody

-amylaza charakteryzowała się największą

odpornością na podwyższona temperaturę. Jednakże, badanie kinetyki inaktywacji cieplnej prowadzono w zupełnie innych warunkach – tzn.

proszek o tej samej zawartości wody otrzymano w wyniku liofilizacji i powolnego dosuszania. Takie łagodne warunki usuwania wody nie

prowadziły prawdopodobnie do zniszczenia struktury enzymu, lecz jedynie do takich zmian konformacyjnych, które powodowały zwiększenie

stabilności cieplnej. W czasie suszenia rozpyłowego drastyczne warunki wymiany ciepła i masy, prowadzące do otrzymania suszu o tej samej

zawartości wody, powodowały prawdopodobnie zniszczenie struktury białka. Tak więc, pojawiające się w literaturze stwierdzenie, że im szybciej i

bardziej intensywnie będzie prowadzony proces suszenia, tym lepsze zachowanie aktywności enzymu, jest prawdziwe tylko, jeśli proces suszenia

jest prowadzony do osiągnięcia pewnej granicznej zawartości wody. Zwiększanie intensywności procesu, prowadzące do dalszego obniżania

zawartości wody, nie wpływa korzystnie na zachowanie aktywności enzymu. Zwiększona degradacja enzymu przy zawartości wody niższej od

optymalnej mogła być spowodowana występowaniem frakcji enzymu o obniżonej stabilności cieplnej (frakcji labilnej). Prawdopodobne istnienie

tej frakcji enzymu obserwowano w przypadku proszku otrzymanego za pomocą liofilizacji (system S6), lecz nie można wykluczyć, że podczas

suszenia rozpyłowego również następuje tworzenie stanu szklistego maltodekstryny, prawdopodobnie odpowiedzialnego za istnienie dwóch frakcji

enzymu o różnej odporności cieplnej.

Na rysunku 5.39. przedstawiono logarytmiczną zależność czasu dziesięciokrotnej redukcji

aktywności

-amylazy od temperatury we

wszystkich

sześciu

systemach

wysokiej

i niskiej zawartości wody, z uwzględnieniem labilnej i stabilnej frakcji enzymu w systemie

o zawartości wody 0,029 g H

O/g s.s. (S6). Model dopasowany za pomocą regresji liniowej na podstawie równania 4.14 przedstawiono na tym

samym

wykresie

pomocą

linii

prostych

o kolorach takich samych jak dane eksperymentalne dla odpoowiedniego systemu. Wykres ten jest graficznym przedstawieniem drugiego etapu

w dwustopniowym wyznaczaniu drugorzędowych parametrów kinetycznych inaktywacji enzymu (wartość

), na podstawie modelu czasu śmierci

cieplnej, za pomocą regresji liniowej. Zgodnie z równaniem 4.14 odwrotność wartości bezwzględnej współczynnika nachylenia prostej na

wykresie

log

w funkcji temperatury jest równa wartości

. Wartość ta jest określana jako wzrost (lub obniżenie) temperatury, powodujący

dziesięciokrotne zmniejszenie (lub zwiększenie) czasu dziesięciokrotnej redukcji

. Na wykresie log

w funkcji temperatury wartość ta może być

odczytana jako różnica temperatury odpowiadająca zmianie

o jeden cykl logarytmiczny

(np. z log

=1 do log

=0). Wartość

jest zatem miarą wrażliwości czasu dziesięciokrotnej redukcji

na zmiany temperatury, a miarą wartości

jest współczynnik nachylenia prostej na wykresie log

w funkcji temperatury. Im większa wartość bezwzględna tego współczynnika tym większa

wartość

. Wszystkie wartości

przedstawiono w tabeli 5.5.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

110

130

Temperatura (

S1
S2
S3
S4
S5
S6s
S6l

Rys. 5.39. Zależność

między czasem
dziesięciokrotnej redukcji D

a temperaturą inaktywacji
cieplnej

-amylazy w systemie

S1 (



), S2 (



), S3 (



S4 (



), S5 (



), S6s (



S6l (



)

Ze względu na mniejsze błędy szacowania wartości

występujące w metodzie regresji nieliniowej (z wyjątkiem systemu S3 i S6l) w

dalszej części omówienia i dyskusji wyników podawane będą tylko wartości otrzymane za pomocą tej metody szacowania.

Wartości

inaktywacji cieplnej

-amylazy

w badanych systemach znajdowały się

w przedziale od 4,7 ± 0,2 do 15,6 ± 1,6°C (Tabela 5.12). Wśród wszystkich badanych systemów największą wartość

oszacowano w przypadku

frakcji

stabilnej

enzymu

systemie

o zawartości wody 0,029 g H

O/g s.s. (S6s). Jednocześnie, jest to wartość najbardziej odbiegająca od wartości oszacowanych w pozostałych

100

systemach. Wartości

w systemach od S1 do S5 oraz S6l wykazują nieznaczne zróżnicowanie, bez wyraźnego wpływu zawartości wody na tę

wartość.

podstawie

zwiększonej

wartości

frakcji

stabilnej

enzymu

w systemie S6 można stwierdzić, że enzym w tej frakcji jest znacznie mniej wrażliwy na zmiany temperatury, tzn. aby dziesięciokrotnie zmniejszyć

czas dziesięciokrotnej redukcji

należy zwiększyć temperaturę o 15,6 ± 1,6°C. Aby taki sam efekt osiągnąć w pozostałych systemach potrzebne

jest trzykrotnie (np. system S3,

=4,7 ± 0,2°C) lub dwukrotnie mniejsze podwyższenie temperatury (np. system S5,

=8,8 ± 0,2°C).

Zwiększona wartość

we frakcji stabilnej enzymu w systemie S6, wskazująca na mniejszą wrażliwość na zmiany temperatury, może być

związana z unieruchomieniem tej frakcji enzymu w stanie szklistym utworzonym przez maltodekstrynę w czasie liofilizacji. Wpływ występowania

tego stanu materii na właściwości materiału był opisany we wcześniejszej części pracy. De Cordt i wsp. (1994), badając kinetykę inaktywacji

amylazy z

Bacillus licheniformis

oszacowali wartość

inaktywacji tego enzymu we frakcji stabilnej i labilnej, których występowanie było związane

z unieruchomieniem enzymu na złożu koralików silikonowych pokrytych warstwą silikonu. Nie stwierdzono znacznych różnic w wartości

w obu

frakcjach enzymu (

= 11,2°C;

= 10,0°C). Jednakże, możliwość porównania wyników obu prac jest ograniczona ze względu na inne źródło

enzymu oraz inny charakter unieruchomienia frakcji stabilnej enzymu.

Saraiva i wsp. (1992) podają wartości

inaktywacji cieplnej

-amylazy z

Bacillus amyloliquefaciens

w systemach o różnej zawartości wody

(adsorpcja wody przy aktywności wody a

od 0,11 do 0,88). Autorzy prezentują wartości w przedziale od 18,7 do 30,7°C i nie stwierdzają

występowania

korelacji

między

tymi

dwoma

zmiennymi

(zawartość

wody

i wartość z).

Na rysunku 5.40 przedstawiono logarytmiczną zależność stałej szybkości reakcji inaktywacji

-amylazy

od odwrotności temperatury

absolutnej we wszystkich sześciu systemach o wysokiej i niskiej zawartości wody, z uwzględnieniem labilnej i stabilnej frakcji enzymu w systemie

o zawartości wody 0,029 g H

O/g s.s. (S6). Wykres ten, nazywany wykresem Arrheniusa, jest graficznym przedstawieniem drugiego etapu

w dwustopniowym wyznaczaniu drugorzędowych parametrów kinetycznych inaktywacji enzymu (

) za pomocą regresji liniowej na podstawie

równania 4.12. Zgodnie z tym równaniem, wartość bezwzględna współczynnika nachylenia prostej na wykresie ln

w funkcji odwrotności

temperatury absolutnej, pomnożona przez stałą gazową R, jest równa energii aktywacji reakcji inaktywacji enzymu

. Wśród wszystkich

badanych

systemów

najmniejszą

wartość

101

oszacowano w przypadku frakcji stabilnej enzymu w systemie o zawartości wody 0,029 g H

O/g s.s. (S6s). Dwustopniowe szacowanie za

pomocą regresji liniowej dało wynik 178,3 ± 34,9 kJ/mol, a jednostopniowe szacowanie za pomocą regresji nieliniowej – 179,4 ± 18,4 kJ/mol.

Wszystkie wartości energii aktywacji przedstawiono w tabeli 5.5.

Energia aktywacji reakcji inaktywacji cieplnej

-amylazy

w badanych systemach znajdowała się w przedziale od 179,4 ± 18,4 do

497,1 ± 19,6 kJ/mol. Wartość energii aktywacji reakcji inaktywacji jest uzależniona od mechanizmu tego procesu. Otrzymane wartości są

charakterystyczne

dla

energii

aktywacji

denaturacji

białka,

która

znajduje

się

w przedziale 225-500 kJ/mol (Strumiłło i wsp. 1991). Można więc stwierdzić, że inaktywacja enzymu jest skutkiem denaturacji białka

enzymatycznego.

Podobne wartości

reakcji inaktywacji cieplnej trzech

-amylaz pochodzenia bakteryjnego w roztworze wodnym podają Weemaes i wsp.

(1996). Energia aktywacji reakcji

-3,0

-2,0

-1,0

0,0

1,0

0,0025

0,0027

0,0029

0,0031

1/T

S1
S2
S3
S4
S5
S6s
S6l

Rys. 5.40. Wykres Arrheniusa –
zależność między stałą szybkości

reakcji inaktywacji k
a temperaturą inaktywacji

-amylazy w systemie

S1 (



), S2 (



), S3 (



), S4 (



S5 (



), S6s (



), S6l (



)

102

Tabela 5.5. Drugorzędowe parametry kinetyczne inaktywacji

-amylazy

w systemach S1 - S6: energia aktywacji reakcji inaktywacji E

oraz wartość z, szacowane dwustopniową metodą regresji

liniowej (L) lub jednostopniową metodą regresji nieliniowej (NL)

Energia aktywacji (kJ/mol)

z (

NL*

S6l

S6s

0,029 g H

O/g s.s.

Frakcja

labilna

395,6 (± 11,4)

390,2 (± 29,5)

7,0 (± 0,3)

6.9 (± 0.5)

Frakcja

stabilna 178,3 (± 34,9)

179,4 (± 18,4)

15,7 (± 3,1)

15.6 (± 1.6)

0,060 g H

O/g s.s.

300,6 (± 37,6)

306,3 (± 8,2)

9,1 (± 1,1)

8,8 (± 0,2)

0,163 g H

O/g s.s.

413,1 (± 62,6)

430,2 (± 22,7)

6,4 (± 1,0)

6,1 (± 0,3)

1,8 g H

O/g s.s.

445,4 (± 16,9)

497,1 (± 19,6)

5,3 (± 0,2)

4,7 (± 0,2)

3,5 g H

O/g s.s.

319,8 (± 37,4)

296,2 (± 22,3)

7,2 (± 0,8)

7,7 (± 0,6)

Roztwór wodny enzymu bez

dodatku maltodekstryny

220,9 (± 33,7)

221,3 (± 8,0)

10,0 (± 1,5)

9,9 (± 0,3)

* L – regresja liniowa, NL – regresja nieliniowa

inaktywacji

-amylazy z

Bacillus subtilis

była równa 234,5 kJ/mol, z

Bacillus amyloliquefaciens

274,1 kJ/mol, a z

Bacillus licheniformis

361,3

kJ/mol.

Wśród wszystkich badanych systemów najmniejszą wartość

oszacowano w przypadku frakcji stabilnej enzymu w systemie o zawartości

wody 0,029 g H

O/g s.s. (S6s). Jednocześnie jest to wartość najbardziej odbiegająca od wartości oszacowanych w pozostałych systemach.

Energia aktywacji w systemach od S1 do S5 oraz S6l wykazuje pewne zróżnicowanie, jednak brak widocznego wyraźnego wpływu zawartości

wody

tę

wartość.

Podobną

wartość

(199,0 ± 6,5) inaktywacji cieplnej

-amylazy w systemie o podobnej zawartości wody (0,02 g H

O/g s.s.) podaje Sadykow i wsp. (1997).

103

Terebiznik i wsp. (1997), badając stabilność cieplną

-amylazy z

Aspergillus oryzae

w roztworze wodnym oraz w systemie o niskiej zawartości wody, również nie stwierdzili istotnego wpływu zawartości wody na energię aktywacji

reakcji inaktywacji. Wartość

inaktywacji

-amylazy w systemie o niskiej zawartości wody równa była 212

23 kJ/mol. Według tych autorów,

mimo że usunięcie wody miało znaczący wpływ na zwiększenie stabilności cieplnej enzymu, wartość

niezależna od zawartości wody wskazuje

na niezmieniony mechanizm inaktywacji. Jednakże autorzy nie podają, jaka była zawartość wody w otrzymanym przez nich systemie ani wartości

w roztworze wodnym, a więc trudne jest porównanie tych wyników z wynikami prezentowanymi w bieżącej pracy. Jednak, jeśli stwierdzili, że

nie

było

istotnej

różnicy

wartości

oszacowanej

dla

inaktywacji

-amylazy

w systemie o niskiej zawartości wody oraz w roztworze wodnym to można przyjąć, że ta ostatnia była zbliżona do wartości 212

23 kJ/mol.

Wartość

reakcji

inaktywacji

-amylazy

w roztworze wodnym, jaką oszacowano w bieżącej pracy, była bardzo zbliżona i wynosiła 221,3

8,0 kJ/mol.

Wartości energii aktywacji reakcji inaktywacji

-amylazy

, przedstawione w tabeli 5.5, są częściowo zgodne z wartościami

przedstawionymi przez Meerdink i van’t Riet (1991), którzy prezentują energię aktywacji reakcji inaktywacji

-amylazy z

Bacillus

licheniformis

Przy zawartości wody 1,8 g H

O/g s.s. wartość

podawana w cytowanej pracy, wynosi 350 kJ/mol, a przy zawartości wody 0,09 g H

O/g s.s.

zmniejsza się do 120 kJ/mol. W bieżącej pracy obserwowano podobny trend obniżenia

wraz o obniżeniem zawartości wody od 1,8 g H

O/g s.s.

Wartość

oszacowana przy tej zawartości wody, wynosząca 497,1 ± 19,6 kJ/mol zmniejsza się do 179,4 ± 18,4 kJ/mol, lecz zawartość wody,

przy której to następuje, równa 0,029 g H

O/g s.s., jest inna niż w pracy cytowanej powyżej. Dodatkowo, obniżenie to zanotowano tylko dla

frakcji stabilnej enzymu.

Adamiec i wsp. (1995), Sadykov i wsp. (1997) oraz Meerdink i vant’Riet (1991) przedstawiają wyniki badań, z których wynika, że istnieje

zależność

między

zawartością

wody

a energią aktywacji reakcji inaktywacji enzymów, jednak podawane zależności są ze sobą sprzeczne. Według Sadykov’a i wsp. (1997)

reakcji

inaktywacji

-amylazy zmniejsza się od 200 kJ/mol do 110 kJ/mol przy zwiększeniu zawartości wody od 0,01 g H

O/g s.s. do 3,0 g H

O/g s.s.

Według Meerdink i vant’Riet (1991), w podobnym zakresie zawartości wody wartość ta ulega zwiększeniu od 100 do 350 kJ/mol. Adamiec i wsp.

(1995) z kolei podają, że kierunek tej zależności zależy od właściwości enzymu, mając charakter wzrostowy w przypadku fosfatazy alkalicznej, a

104

odwrotny w przypadku lipazy. Niemniej jednak, we wszystkich przypadkach same wartości energii aktywacji reakcji inaktywacji są podobne i w

tym samym przedziale co prezentowane w bieżącej pracy.

5.3.3. Wpływ dodatków stabilizujących na kinetykę inaktywacji cieplnej

-amylazy

Substancje dodatkowe, takie jak cukry i alkohole wielowodorotlenowe, stosuje się w celu zwiększenia stabilności cieplnej enzymów

występujących w formie ciekłej. W ostatniej części pracy przeprowadzono badania mające na celu stwierdzenie, czy efekt stabilizujący tych

związków, w przypadku

-amylazy, związany jest z liczbą grup hydroksylowych występujących w ich cząsteczkach lub z ogólną liczbą tych grup w

roztworze.

Kinetyka inaktywacji

-amylazy w 20 mM roztworze buforowym Bis-Tris oraz w tym roztworze z dodatkami alkoholi wielowodorotlenowych i

cukrów mogła być ściśle opisana modelem czasu śmierci cieplnej. Świadczy o tym linearność zależności log

od czasu (na rysunku 5.42

przedstawiono

przykładowy

wykres

kinetyki

inaktywacji

-amylazy

systemie

z dodatkiem 30 % glicerolu) oraz wysokie współczynniki determinacji R

, na poziomie od 0,94 do 0,99, uzyskane po dopasowaniu modelu do

danych eksperymentalnych za pomocą regresji liniowej. Przykładową zależność między czasem inaktywacji a aktywnością

-amylazy

w czterech różnych temperaturach w systemie z dodatkiem 30 % glicerolu przedstawiono na rysunku 5.41. Dane eksperymentalne opisywano za

pomocą regresji nieliniowej na podstawie modelu czasu śmierci cieplnej zgodnie z równaniem 4.18. Porównanie danych eksperymentalnych

wszystkich doświadczeń z tej części pracy z wartościami uzyskanymi poprzez dopasowanie modelu za pomocą regresji nieliniowej przedstawiono

na rysunku 5.43. Zgrupowanie punktów wokół linii x=y świadczy o dobrym dopasowaniu zastosowanego modelu.

Czas dziesięciokrotnej redukcji aktywności

-amylazy

w temperaturze 68°C we wszystkich systemach o różnych zawartościach dodatków

stabilizujących

przedstawiono

w tabeli 5.6. Wyniki wszystkich przeprowadzonych eksperymentów przedstawiono w tabelach 10.24 - 10.34. Zastosowane dodatki we wszystkich

stężeniach spowodowały wydłużenie czasu dziesięciokrotnej redukcji, co świadczy o ich działaniu stabilizującym na enzym. Zauważalne są różnice

efektywności

stabilizacji

zależności

rodzaju

substancji

oraz

jej

stężenia.

W przypadku mannitolu i laktitolu wzrost wartości

w stosunku do roztworu buforowego jest niewielki. Zastosowanie sorbitolu, glicerolu i

105

trehalozy, zawłaszcza w wyższych stężeniach, spowodowało większy wzrost stabilności enzymu. Najbardziej skutecznym dodatkiem stabilizującym

okazała się być sacharoza. Zastosowanie 1,2 M roztworu (705 mg/cm

) pozwoliło na uzyskanie ponad trzydziestokrotnego wzrostu czasu

dziesięciokrotnej redukcji

0,2

0,4

0,6

0,8

120

160

Czas (min)

62,0

64,0

66,0

68,0

Temperatura (

-1,2

-1

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

120

160

Czas (min)

62,0

64,0

66,0

68,0

Temperatura (

Rys. 5.41. Zależność między czasem
inaktywacji a aktywnością względną

-amylazy w roztworze buforowym

20 mM Bis-Tris z dodatkiem 30 % (v/v)
glicerolu: dane eksperymentalne
otrzymane w temperaturze 62,0°C (



);

64,0°C (



); 66,0°C (



); 68,0°C (



model dopasowany za pomocą regresji
nieliniowej dla temperatury 62,0°C (



);

64,0°C (



); 66,0°C (



)

; 68,0°C (



Rys. 5.42. Kinetyka inaktywacji

-amylazy w roztworze buforowym

20 mM Bis-Tris z dodatkiem 30 % (v/v)

glicerolu: dane eksperymentalne
otrzymane w temperaturze 62,0°C (



);

64,0°C (



); 66,0°C (



); 68,0°C (



model dopasowany za pomocą regresji

liniowej dla temperatury 62,0°C (



)

=0,96; 64,0°C (



) R

=0,99; 66,0°C

(



)

=0,99; 68,0°C (



) R

=0,96.

106

Liczba

grup

OH/cm

Roztwór

buforowy

20 mM Bis-

Tris, pH 7,0

Roztwór buforowy 20 mM Bis-Tris, pH 7,0 z dodatkiem:

mannitolu laktitolu

sorbitolu

glicerolu

trehalozy sacharozy

D (min) w temperaturze
68°C

2,4 ± 0,2

0,198 x 10

3,1 ± 0,2

3,8 ± 0,2

5,3 ± 0,5

5,4 ± 0,7 10,2 ± 0,4

0,281 x 10

7,5 ± 0,5 14,2 ± 0,4

0,314 x 10

4,2 ± 0,3

6,9 ± 0,4

0,396 x 10

4,5 ± 0,2

0,595 x 10

7,9 ± 0,4

11,4 ± 1,0 15,4 ± 0,9 81,3 ± 1,5

0,725 x 10

14,5 ± 1,2

0,992 x 10

13,2 ± 0,7 33,7 ± 1,8 47,4 ± 4,1

* Stężenia roztworów o różnych zawartościach grup OH podano w tabeli 4.4

Sacharoza wykazała również najlepsze właściwości ochronne w pracy przedstawionej przez Busto i wsp. (1999). Zastosowanie od 1 do 2 M

roztworu zwiększyło stabilność lipoksygenazy w temperaturze 70°C o 400-600 %. Dodatek alkoholi wielowodorotlenowych jak mannitol, sorbitol i

glicerol był mniej korzystny lub wcale nie miał wpływu na stabilność cieplną enzymu.

Pozytywny wpływ zastosowanych dodatków na odporność cieplną

-amylazy zwiększał się wraz ze wzrostem ich stężenia. Zwiększenie to, w

badanym zakresie stężeń, miało charakter wykładniczy o współczynniku korelacji R

od 0,97 do 0,99. Wpływ stężenia dodatków stabilizujących na

czas dziesięciokrotnej redukcji

w temperaturze 68°C przedstawiono na rysunku 5.44. Podobną zależność, między stężeniem sorbitolu a

„efektem ochronnym” wywieranym na

-amylazę z

Aspergillus oryzae

, podali wcześniej Graber i Combes (1989). „Efekt ochronny” definiowano

jako stosunek czasu potrzebnego do zmniejszenia aktywności enzymu o połowę w obecności dodatku stabilizującego i czasu potrzebnego do

zmniejszenia aktywności enzymu o połowę bez obecności tego dodatku w roztworze buforowym. Wielkość ta, wynosząca 200 w 2,5 M roztworze

sorbitolu, uległa zwiększeniu nawet do 2000, gdy stężenie sorbitolu zwiększono do 4 M.

108

Jeśli przyjąć, że mechanizm stabilizacji enzymu w obecności alkoholi wielowodorotlenowych i cukrów związany jest z hydratacją

preferencyjną białka, jak opisano

Stężenie substancji dodatkowej (M)

°C

(

)

Sorbitol
Glicerol
Trehaloza
Sacharoza

Rys. 5.44. Wpływ stężenia (M)
sorbitolu (



) R

=0,97, glicerolu

(



) R

=0,98; trehalozy (



)

=0,99 i sacharozy (



) R

=0,99

na czas dziesięciokrotnej redukcji
D (min) w temperaturze 68°C.

w rozdziale 2.4.2.1, to można zauważyć, że cukry, dla których źródłem wykluczenia z obszaru białka jest wzrost napięcia powierzchniowego,

wykazywały lepsze właściwości ochronne niż alkohole wielowodorotlenowe, których wykluczanie związane jest z interakcjami o naturze

chemicznej. Poza wpływem na budowę całego systemu, w którym rozpuszczone jest białko

i substancja dodatkowa, źródłem działania ochronnego zastosowanych dodatków mogą być ich potencjalne oddziaływania z samą cząsteczką

białka. Wykazano, że alkohole wielowodorotlenowe mają podobieństwo do grup polarnych białka i są nawet opisane jako inhibitory

współzawodniczące

-amylazy,

mogą

więc

wchodzić

bezpośrednie

interakcje

z centrum aktywnym enzymu (Timasheff 1993, Timasheff i Arakawa 1989, Graber i Combes 1989). Oddziaływania te, zwiększając „sztywność”

cząsteczki enzymu, powodują zwiększenie jej odporności na zmiany strukturalne prowadzące do denaturacji i inaktywacji. Jednakże bezpośrednie

oddziaływania z łańcuchami polipeptydowymi mogą być też niekorzystne, ponieważ mogą prowadzić do stabilizacji nieaktywnej enzymatycznie

struktury rozwiniętej białka. Mimo, że „co-solvent” jest wykluczony z bezpośredniego sąsiedztwa cząsteczki białka, nieliczne cząsteczki mogą

109

migrować poprzez warstwę hydratacyjną w okolice rozwiniętych łańcuchów polipeptydowych i, poprzez oddziaływania z wyeksponowanymi

regionami niepolarnymi białka, wpływać na zwiększenie stabilności rozwiniętej struktury oraz uniemożliwiać jej ewentualny powrót do aktywnej

struktury natywnej (Timasheff 1993).

Wielu autorów rozważa wpływ ilości grup OH na stabilność cieplną enzymów. Sugeruje się, że efekt stabilizujący alkoholi

wielowodorotlenowych i cukrów związany jest z liczbą grup OH w cząsteczce danej substancji (Busto i wsp. 1999, Graber i Combes 1989) lub z

ogólną liczbą grup OH w danym roztworze (Noel i Combes 2003, Guiavarc’h i wsp. 2003).

Na podstawie pierwszej z cytowanych hipotez (liczba grup OH w cząsteczce substancji stabilizującej) należałoby spodziewać się następującego

uszeregowania substancji zastosowanych w bieżącej pracy pod względem ich wzrastającego wpływu ochronnego: glicerol (3*OH) < mannitol,

sorbitol, (6*OH) < trehaloza, sacharoza (8*OH) < laktitol (9*OH). Jednakże, otrzymane wyniki nie potwierdzają powyższej hipotezy. Laktitol,

który ma największą liczbę grup OH w cząsteczce spośród zastosowanych substancji, wykazał mniejszy wpływ na czas dziesięciokrotnej redukcji

niż inne związki. Również efekt ochronny substancji o tej samej liczbie grup OH w cząsteczce (sacharoza, trehaloza) był zróżnicowany.

Jeżeli chodzi o drugą z cytowanych hipotez (wpływ ogólnej liczby grup OH w danym roztworze), to w tabeli 5.6 przedstawiono czas

dziesięciokrotnej redukcji

uzyskany po zastosowaniu różnych stężeń dodatków, w odniesieniu do ogólnej liczby grup OH w danym roztworze.

Można zauważyć, że w systemach o tej samej zawartości grup OH wartość

różniła się w zależności od źródła tych grup. Przykładowo, przy

zawartości

grup

1 cm

równej

0,595·10

wartość

wynosiła 7,9 ± 0,4 min, gdy dodatkiem stabilizującym był sorbitol, 11,4 ± 1,0 min w obecności glicerolu, 15,4 ± 0,9 min w

przypadku trehalozy, a po zastosowaniu sacharozy wartość ta wyniosła nawet 81,3 ± 1,5 min. Zależność między liczbą grup OH w danym

roztworze a otrzymaną wartością

w temperaturze 68°C przedstawiono na rysunku 5.45.

110

0,2

0,4

0,6

0,8

Liczba grup OH * 10

°C

(

)

Sorbitol

Glicerol

Trehaloza

Sacharoza

Rys. 5.45. Wpływ liczby grup OH
zapewnionych przez sorbitol (



)

=0,98, glicerol (



) R

=0,98;

trehalozę (



) R

=0,99

i sacharozę (



) R

=0,99 na czas

dziesięciokrotnej redukcji D (min)

w temperaturze 68°C

Jego analiza potwierdza, że ogólna liczba grup OH w danym roztworze nie jest czynnikiem decydującym o stabilności cieplnej

-amylazy.

Bardziej istotny jest rodzaj zastosowanej substancji. Dla każdej substancji rozpatrywanej oddzielnie istnieje ścisła zależność między liczbą grup OH

a efektem ochronnym, lecz ma to związek ze zwiększeniem stężenia roztworów. Istnienie zależności między ogólną liczbą grup OH w roztworze

a otrzymaną wartością

podczas badania wpływu substancji dodatkowych (takich samych jak w bieżącej pracy) na kinetykę inaktywacji cieplnej

pektynoesterazy

(PME)

wyekstrahowanej

z pomidorów, stwierdzili Guiavarc’h i wsp. (2003). Ogólna liczba grup OH w roztworach była związana z ich efektem ochronnym, bez względu na

rodzaj substancji zapewniającej źródło grup OH. Autorzy stwierdzili, że stabilność cieplna PME może być przewidywana na podstawie znajomości

liczby grup OH w danym systemie

W tabeli 5.7 przedstawiono drugorzędowe parametry kinetyczne inaktywacji

-amylazy (wartość

) w 20 mM roztworze buforowym Bis-

Tris oraz z dodatkami substancji stabilizujących. Wartości

znajdują się w przedziale wielkości charakterystycznych dla inaktywacji

-amylazy.

Energia aktywacji reakcji inaktywacji przyjmuje wartości charakterystyczne dla energii aktywacji denaturacji białka. Zarówno wartość

jak

111

wykazują pewne zróżnicowanie w zależności od zastosowanych dodatków, brak jednak zależności między tymi wartościami a liczbą grup OH w

roztworach.

De Cordt i wsp. (1994), badając kinetykę inaktywacji

-amylazy z

Bacillus amyloliquefaciens

w roztworze buforowym oraz z dodatkiem

glicerolu (35,1 %), zaobserwowali zmniejszenie wartości z z 7,36°C do 6,46°C po zastosowaniu dodatku glicerolu. Gdy porówna się wartości

uzyskane w bieżącej pracy, również widoczne jest zmniejszenie tej wartości po zastosowaniu glicerolu (5,8 ± 0,1°C) w stosunku do roztworu

buforowego (7,8 ± 0,4°C).

Tabela 5.7. Drugorzędowe parametry kinetyczne inaktywacji

-amylazy

w 20 mM roztworze buforowym Bis-Tris oraz z dodatkami substancji stabilizują-cych: energia aktywacji reakcji inaktywacji
E

oraz wartość z, szacowane dwustopniową metodą regresji liniowej (L) lub jednostopniową metodą regresji nieliniowej

(NL).

Roztwór

buforowy

20 mM Bis-

Tris, pH 7,0

Roztwór buforowy 20 mM Bis-Tris, pH 7,0 z dodatkiem:

100 mg/cm

mannitolu

200 mg/cm

laktitolu

300 mg/cm

sorbitolu

30 % (v/v)

glicerolu

200 mg/cm

trehalozy

200 mg/cm

sacharozy

z (°C)

8,1 ± 0,9

7,5 ± 0,9

5,4 ± 0,3

6,0 ± 0,4

6,1 ± 0,5

8,1 ± 1,0

5,7 ± 0,7

NL*

7,8 ± 0,4

7,6 ± 0,3

4,9 ± 0,1

6,3 ± 0,2

5,8 ± 0,1

7,9 ± 0,3

5,4 ± 0,2

(kJ/mol)

245,1 ± 26,5 289,7 ± 41,2 407,2 ± 26,4 369,7 ± 26,8 364,3 ± 25,8 277,4 ± 15,9 386,2 ± 44,9

280,7 ± 13,8 277,0 ± 11,8 446,3 ±12,2 349,2 ± 9,8

378,9 ± 8,1 277,0 ± 11,8 401,5 ± 12,5

* L – regresja liniowa, NL – regresja nieliniowa

5.3.4. Podsumowanie

Kinetyka inaktywacji cieplnej preparatu

-amylazy z

Aspergillus oryzae

w prawie wszystkich środowiskach, w których badano przebieg tego

procesu (o różnej zawartości wody oraz w obecności dodatków stabilizujących) mogła być ściśle opisana równaniem reakcji pierwszego rzędu oraz

112

za pomocą modelu czasu śmierci cieplnej. Wyjątkiem była kinetyka inaktywacji

-amylazy w systemie o najniższej z zastosowanych zawartości

wody równej 0,029 g H

O/g s.s., kiedy to stosowano model „biphasic”. Model ten zakłada istnienie dwóch frakcji enzymu o różnej stabilności

cieplnej. Wpływ temperatury na stałą szybkości reakcji inaktywacji cieplnej enzymu, we wszystkich zastosowanych systemach, był opisywany

równaniem Arrheniusa.

Stwierdzono, że zarówno obniżanie zawartości wody jak i zastosowanie substancji dodatkowych, takich jak alkohole wielowodorotlenowe i

dwucukry, wpłynęło na zwiększenie stabilności cieplnej

-amylazy. Temperaturę, w której badano kinetykę inaktywacji cieplnej zwiększono około

dwukrotnie (z 60 do 115°C) po zmniejszeniu zawartości wody z systemu stanowiącego roztwór wodny enzymu do systemu o zawartości wody

0,029 g H

O/g s.s. Zwiększanie stabilności enzymów w środowisku o niskiej zawartości wody jest spowodowane głównie ograniczoną ruchliwością

cząstek i niemożliwością zachodzenia niekorzystnych zmian strukturalnych prowadzących do denaturacji. W przypadku obecności maltodekstryny

możliwe jest także bezpośrednie oddziaływanie tego związku z centrum aktywnym enzymu, wpływające na usztywnienie jego struktury. Istnienie

dwóch

frakcji

enzymu

różnej

stabilności

cieplnej,

w systemie o najniższej zawartości wody, może być związane z występowaniem maltodekstryny w stanie szklistym i częściowym

unieruchomieniem enzymu w materii o wysokiej lepkości.

Wszystkie zastosowane alkohole wielowodorotlenowe oraz dwucukry wpływały na zwiększenie stabilności cieplnej

-amylazy. Najbardziej

korzystnie wpływała sacharoza, której dodatek w stężeniu 1,2 M zwiększył czas dziesięciokrotnej redukcji

ponad trzydziestokrotnie

w stosunku do wartości

w roztworze buforowym.

Zastosowanie substancji dodatkowych, w celu obniżenia degradacji materiałów w czasie suszenia, jest często stosowane w przypadku

liofilizacji. Związki te, nazywane w tym przypadku substancjami ochronnymi, zmniejszają występowanie niekorzystnych przemian (podczas

zamrażania i suszenia) obniżających jakość suszonych preparatów. Mogą być dodawane zarówno do podłoża hodowlanego jak i bezpośrednio

przed procesem zamrażania. Do najczęściej stosowanych substancji ochronnych należą: sacharoza, trehaloza, glicerol, związki zawierające jony

wapnia, NH

Cl (Witrowa-Rajchert i Samborska 2002). Pozytywny wpływ zastosowanych w niniejszej pracy dodatków na stabilność cieplną

amylazy wskazuje na potencjalną możliwość zastosowania tych substancji jako dodatków ochronnych również

113

Wnioski

6. WNIOSKI

1. Suszenie rozpyłowe jest odpowiednią metodą suszenia preparatu

-amylazy z

Aspergillus

oryzae

, za pomocą której, pod warunkiem zastosowania odpowiednich parametrów

procesu, możliwe jest otrzymanie preparatu enzymatycznego o wysokiej aktywności.

2. Głównym czynnikiem wpływającym na końcową aktywność

-amylazy po suszeniu

rozpyłowym, w badanym zakresie parametrów procesu, jest zawartość wody w suszu.

W celu maksymalnego zachowania aktywności tego enzymu po suszeniu wartość ta

powinna być jak najbardziej zbliżona do tzw. optymalnej zawartości wody. Zarówno

zmniejszanie jak i zwiększanie zawartości wody w suszu poniżej lub powyżej optymalnej

zawartości wody prowadzi do obniżenia aktywności

-amylazy. Optymalna zawartość

wody po suszeniu dla badanego preparatu

-amylazy i badanego zakresu parametrów

procesu znajduje się w przedziale 0,07 – 0,09 g H

O/g s.s.

3. Zastosowanie parametrów suszenia prowadzących do otrzymania suszu o optymalnej

zawartości wody jest również korzystne ze względu na ekonomiczność prowadzonego

procesu suszenia. Właściwe zużycie powietrza i właściwe zużycie ciepła zanotowane

w czasie suszenia z zastosowaniem tych parametrów charakteryzowało się najmniejszymi

wartościami.

4. Głównym parametrem wpływającym na końcową zawartość wody w suszu, a więc

i na aktywność

-amylazy, jest temperatura powietrza wylotowego w czasie suszenia.

Wartość ta może być regulowana poprzez zmianę temperatury powietrza wlotowego

i strumienia surowca. Im większy strumień surowca, przy stałej temperaturze powietrza

wlotowego, tym niższa temperatura powietrza wylotowego i tym wyższa zawartość wody

w suszach.

5. Zbyt intensywne suszenie, np. prowadzone przy niskiej wartości strumienia surowca

(rozpylenie roztworu na mniejsze kropelki), powoduje zwiększoną degradację enzymu,

wynikającą prawdopodobnie z naruszania wody strukturalnej stabilizującej cząsteczkę

białka lub z destrukcji termicznej materiału.

6. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w systemach o różnej zawartości wody oraz

z dodatkami substancji stabilizujących może być opisana równaniem reakcji pierwszego

rzędu i modelem czasu śmierci cieplnej. Wyjątkiem jest system o najniższej zawartości

wody 0,029 g H

O/g s.s., w którym enzym podlega inaktywacji zgodnie z modelem

109

Wnioski

„biphasic”, zakładającym istnienie dwóch frakcji enzymu o różnej stabilności cieplnej.

Powodem występowania dwóch frakcji enzymu może być unieruchomienie części enzymu

w stanie szklistym utworzonym przez maltodekstrynę.

7. Wpływ temperatury na kinetykę inaktywacji cieplnej

-amylazy może być opisywany

równaniem Arrheniusa. Otrzymane wartości energii aktywacji reakcji inaktywacji wskazują

na to, że inaktywacja cieplna

-amylazy w systemach o różnej zawartości wody oraz

z dodatkami substancji stabilizujących jest spowodowana denaturacją białka

enzymatycznego.

8. Enzym

-amylaza charakteryzuje się zwiększającą się stabilnością cieplną w

warunkach

o zmniejszającej się zawartości wody. Może być to związane z ograniczaniem

ruchliwości cząstek redukującym możliwość zachodzenia zmian strukturalnych

prowadzących do denaturacji, substytuowaniem cząsteczek wody niezbędnych do

utrzymania natywnej struktury białka przez sacharydy pochodzące z

maltodekstryny lub bezpośrednim oddziaływaniem maltodekstryny jako substratu

-amylazy z centrum aktywnym enzymu, co prowadzi do zwiększenia sztywności

cząsteczki białka.

9. Stabilność cieplna

-amylazy zwiększa się w obecności zastosowanych dodatków

stabilizujących. Efekt stabilizujący nie zależy od liczby grup hydroksylowych w

cząsteczce zastosowanego związku ani od ogólnej ilości tych grup w roztworze,

lecz

rodzaju

i stężenia substancji dodatkowej, wykazując znacznie większy wpływ na stabilność

-amylazy w przypadku dwucukrów niż w przypadku alkoholi

wielowodorotlenowych. Najlepszymi właściwościami ochronnymi charakteryzuje się

sacharoza.

110

Streszczenie

7. STRESZCZENIE

Celem pracy było określenie możliwości zastosowania suszenia rozpyłowego do suszenia

płynnego preparatu

-amylazy pochodzenia pleśniowego (

Aspergillus oryzae

) oraz zbadanie

wpływu takich parametrów suszenia rozpyłowego jak strumień surowca oraz temperatura

powietrza suszącego na przebieg tego procesu oraz końcową aktywność enzymu. Ponadto

zakres pracy obejmował wykonanie badań mających na celu określenie wpływu zawartości

wody oraz obecności dodatków stabilizujących (alkoholi wielowodorotlenowych i dwucukrów)

na kinetykę inaktywacji cieplnej

-amylazy.

Przebieg suszenia był ściśle uzależniony od zmian badanych parametrów: temperatury

powietrza wlotowego oraz strumienia surowca. Suszenie przy niższych strumieniach surowca

prowadziło do uzyskania proszków o niższej zawartości wody, co wynikało z różnic

w temperaturze wylotowej powietrza. Zmniejszanie strumienia surowca powodowało

zmniejszenie ilości wody odparowywanej w jednostce czasu, w rezultacie czego temperatura

powietrza wylotowego była wyższa niż przy zastosowaniu wyższych strumieni surowca.

Zwiększenie temperatury powietrza wylotowego powodowało lepsze wysuszenie cząstek.

Podwyższanie temperatury powietrza wlotowego, przy danym strumieniu surowca,

powodowało zwiększenie temperatury powietrza wylotowego oraz zmniejszenie zawartości

wody w suszach.

Aktywność względna

-amylazy w otrzymanych suszach wahała się od 56,7 do 90,1 %.

Stwierdzono, że głównym parametrem decydującym o końcowej aktywności względnej

suszonej

-amylazy jest końcowa zawartość wody w suszu. Szybkie odparowanie wody, jakie

następuje w czasie suszenia rozpyłowego, jest korzystne ze względu na zwiększanie się

odporności enzymu na podwyższona temperaturę, jednak nie może ono prowadzić do zbyt

dużego stopnia wysuszenia, prowadzącego prawdopodobnie naruszenie struktury białka

w wyniku usuwania wody strukturalnej. Zawartość wody gwarantująca uzyskanie maksymalnej

aktywności względnej

-amylazy w suszu, gdy nie występuje jeszcze niekorzystny wpływ

dehydracji związany z niszczeniem struktury białka, nazwana została optymalną zawartością

wody w preparacie enzymatycznym. Stwierdzono, że w celu otrzymania suszu o wysokiej

aktywności względnej

-amylazy, warunki suszenia należy dobrać tak, aby końcowa zawartość

wody kształtowała się na poziomie wartości optymalnej 0,07 – 0,09 g H

O/g s.s. Aby otrzymać

susz o tej zawartości wody temperatura powietrza wylotowego powinna wynosić 70-80

Zastosowanie parametrów suszenia prowadzących do otrzymania suszu o optymalnej

zawartości wody jest również korzystne ze względu na ekonomiczność prowadzonego procesu

111

Streszczenie

suszenia. Właściwe zużycie powietrza i ciepła zanotowane w czasie suszenia z zastosowaniem

tych parametrów charakteryzowało się najmniejszymi wartościami.

Kinetykę inaktywacji

-amylazy w systemach o zmniejszającej się zawartości wody oraz

zawierających substancje stabilizujące opisywano równaniem reakcji pierwszego rzędu

i modelem czasu śmierci cieplnej. Jedynie kinetyka inaktywacji w systemie o najniższej

zawartości wody 0,029 g H

O/g s.s. opisywana była modelem „biphasic”, zakładającym

istnienie dwóch frakcji enzymu o różnej stabilności cieplnej.

Stwierdzono znaczne zwiększanie stabilności cieplnej

-amylazy wraz z obniżaniem

zawartości wody, co prawdopodobnie było wynikiem zmniejszenia możliwości zachodzenia

zmian konformacyjnych prowadzących do denaturacji w rezultacie ograniczania ruchliwości

cząsteczek. Inną możliwą przyczyną stabilizacji enzymu mógł być wpływ węglowodanów

polegający na zastępowaniu w cząsteczce białka enzymatycznego cząsteczek wody

niezbędnych do utrzymania natywnej struktury białka.

Istnienie dwóch frakcji enzymu o różnej stabilności cieplnej w systemie o najniższej

zawartości wody powiązano z możliwością występowania maltodekstryny w stanie szklistym,

ponieważ zakres temperatur stosowanych podczas badania kinetyki inaktywacji cieplnej był

niższy od temperatury przemiany szklistej maltodekstryny przy tej zawartości wody. Stabilna

frakcja enzymu unieruchomiona prawdopodobnie w stanie szklistym charakteryzowała się

mniejszą stałą szybkości reakcji inaktywacji niż frakcja labilna znajdująca się w częściowo

uplastycznionych regionach polimeru (lub w regionach stanu szklistego charakteryzujących się

większą mobilnością cząsteczek).

Wyniki drugiej części pracy, dotyczącej kinetyki inaktywacji

-amylazy w systemach

o różnej zawartości wody, były pomocne w wytłumaczeniu korzystnego wpływu suszenia

rozpyłowego na zachowanie aktywności enzymu. Ten rodzaj suszenia pozwala na otrzymanie

preparatu enzymatycznego o wysokiej aktywności, ponieważ w czasie szybkiego odparowania

wody następuje równocześnie szybki wzrost odporności

-amylazy na podwyższoną

temperaturę, a czas działania podwyższonej temperatury na enzym o niskiej odporności

cieplnej (w środowisku o wysokiej zawartości wody) jest bardzo krótki. Jednocześnie

stwierdzono, że intensyfikacja procesu suszenia pozwala na zwiększenie aktywności względnej

enzymu, tylko jeśli proces jest prowadzony do otrzymania pewnej granicznej zawartości wody.

Dalsze zwiększanie intensywności procesu, prowadzące do dalszego obniżania zawartości

wody, nie wpływa korzystnie na zachowanie aktywności enzymu.

Zastosowanie substancji dodatkowych, takich jak alkohole wielowodorotlenowe

i dwucukry, wpłynęło na zwiększenie stabilności cieplnej

-amylazy. Pozytywny wpływ

zastosowanych dodatków na odporność cieplną

-amylazy zwiększał się wraz ze wzrostem ich

112

Abstract

8. ABSTRACT

Dry solid formulations are often developed to provide an acceptable protein and enzymes

shelf life. Spray-drying is the most common method for drying of liquids. It is widely used in

a dairy and pharmaceutical industry for dehydration of various substances, such as: milk,

whey, antibiotics, vitamins, enzymes. The main advantage of this method is the fact that it

enables to transfer a solution, suspension or emulsion into a powder in one-step process. The

drying performs with a high efficiency and is far less expensive than freeze drying. During

drying droplets come immediately in a contact with a flow of hot drying medium, usually air.

Because of the rapid water evaporation the temperature of droplets is maintained low. The

cooling effect of evaporation on the droplets is observed. Due to a short drying time and

a relatively low product temperature, spray-drying can be successfully used for drying of

extremely heat-sensitive materials.

The objective of this work was to investigate the effect of spray drying conditions on the

activity of

Aspergillus oryzae

-amylase and the process development. Several experiments

were performed to determine the influence of following variables: feed ratio speed, inlet and

outlet drying air temperature. Fungal

-amylase was dissolved in a maltodextrin solution and

spray-dried in a laboratory drier. Water concentration and residual enzyme activity were

determined in obtained powders as a function of the drying conditions. It was found that both

temperature and feed ratio speed affected the retention of the enzyme activity after drying.

The relative enzyme activity in obtained powders ranged from 56.7 to 90.1 %, depending on

process parameters. Water content was the main factor which affected the final relative

enzyme activity. Fast evaporation during spray drying allows to obtain an active dry enzyme

preparation, cause

-amylase is characterised by an increased thermal stability at low moisture

content conditions. However, rapid drying should not lead to protein damage, which can occur

as a result of evaporation of water essential for protein stability maintenance. The final water

content which ensures to obtain maximum relative activity of the enzyme in dry state, when

the protein destruction due to water evaporation is not observed, can be called optimum water

content in dry

-amylase preparation. It was found that this optimum water content ranged

from 0.07 – 0.09 g H

O/g db. In order to obtain powders of this water content higher value of

feed ratio speed (1.3 or 1.7 cm

/s) should be used, and low outlet air temperature

(70 – 80

C) should be kept during spray drying.

The thermal stability of

-amylase in systems of different moisture content was also

investigated. To obtain systems of reduced moisture content the enzyme was freeze-dried with

111

Abstract

addition of maltodextrin and equilibrated above saturated salt solutions. Other systems applied

were aqueous solutions of maltodextrin.

The thermal inactivation kinetics could be accurately described by a first order model in

all systems studied except the system of moisture content of 0.029 g H

O/g db, which showed

a biphasic inactivation pattern. Heat stability of the enzyme significantly increased in systems

at reduced moisture content. In all subsequent systems of reduced moisture content the heat

stability of the enzyme was increased, and reached maximum stability at the lowest moisture

content of 0.029 g H

O/g db. At this moisture content the existence of two enzyme fractions

was suggested, a heat labile and a heat stable fraction. A possible explanation for this

observation is glass forming properties of maltodextrin and its influence on enzyme stability.

The results of this part of work, dealing with

-amylase heat stability at different water

content conditions, were useful while explaining the enzyme behaviour during spray drying

process. This drying method allows to obtain highly active enzyme preparation cause during

rapid drying the heat stability of

-amylase increases as a result of rapid water content

reduction. Moreover, the contact time of dried enzyme material of low heat stability (material

of high water content) with hot drying medium is very short. Although fast drying leads to high

active enzymatic material, the drying ratio can not be too high. If the drying ratio is too high

and the final water content is lower than optimal, the protein degradation and enzyme activity

deterioration is observed.

The effect of sugars (disaccharides) and polyols on

-amylase thermal stability was

investigated. The largest protective effect was obtained with addition of sucrose. The influence

of trehalose and polyols on the enzyme heat stability was also positive, but less pronounced

than with sucrose. The protective effect was strongly related to the concentration of the

protective compound, following an exponential function. The number of hydroxyl groups per

molecule and the total amount of hydroxyl groups provided by additives to the system (

OH),

were not correlated with the heat stability of

-amylase. The source of OH groups was found

to be more important, sugars (especially sucrose) being more effective than polyols for similar

number of

OH values. The positive effect of applied substances on

-amylase heat stability

indicates that they could be used as protective additions during spray drying. The results of

carried research (not published yet, and not being a part of the current work) confirm this

hypothesis.

112

Spis literatury

9. SPIS LITERATURY

10. Achremowicz B, Wójcik W. 2000. Enzymy amylolityczne i inne hydrolazy O-glikozydowe.

Wydawnictwo Akademii Rolniczej w Lublinie, Lublin.

11. Acker LW. 1969. The practical approach to better low-moisture foods – water activity and

enzyme activity. Food Technol., 23, 1257-1270.

12. Adamiec J, Kamiński W, Markowski AS, Strumiłło C. 1995. Drying of biotechnological

products. In: Handbook of Industrial Drying (ed. AS Mujumdar). Marcel Deker Inc., New

York, vol. 2, 775-808.

13. Barrow GM. 1973. Chemia fizyczna. Państwowe Wydawnictwo Naukowe, Warszawa.

14. Bednarski W. 1997. Stan obecny i perspektywy biotechnologii żywności. Przem. Spoż.,

51(2), 29-32.

15. Belghith H, Chaabouni SE, Gargouri CA. 2001. Stabilisation of

Penicilium occitanis

cellulases by spray drying in presence of maltodextrin. Enzyme Microb. Technol., 28, 253-

258.

16. Bigelow WD. 1921. The logarithmic nature of thermal death time curves. J. Infect. Dis.,

29(5), 528-536.

17. Brennan JG. 2003. Spray drying. In: Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition (eds.

B Caballero, LC Trugo, PM Finglas). Academic Press Elsevier Science Ltd., Oxford, UK.

18. Buitink J, Van den Dries IJ, Hoekstra FA, Alberda M, Hemminga MA. 2000. High critical

temperature above T

may contribute to the stability of biological systems. Biophys. J.,

79, 1119-1128.

19. Busto MD, Apenten RK, Robinson DS, Wu Z. 1999. Kinetics of thermal inactivation of pea

seed lipoxygenases and the effect of additives on their thermostability. Food Chem., 65,

323-329.

20. Cardona S, Schebor C, Buera MP, Karel M, Chirife J. 1997. The thermal stability of

invertase in reduced-moisture amorphous matrices in relation to glassy state of trehalose.

J. Food Sci., 62, 105-112.

21. Chan RK, Pathmanthan K, Johari GP. 1986. Dieletric relaxations in the liquid and glassy

states of glucose and its water mixtures. J. Phys. Chem., 90(63), 6358-6362.

22. Colaco C, Sen S, Thangavelu M, Pinder S, Roser B. 1992. Extraordinary stability of

enzymes dried in trehalose: simplified molecular biology. Biotechnol., 10, 1007-1011.

116

Spis literatury

23. Combes D, Auzanneau I, Zwick A. 1992. Thermal stability of enzymes: influence of

solvation medium (a Raman spectroscopy study). In: Stability and stabilisation of enzymes

(eds. WJJ Van den Tweel, A Harder, RM Buitelaar). Elsevier, Maastricht, 29-36.

24. Czapski J. 2001. Wybrane kierunki rozwoju dodatków do żywności. Przem. Ferm. i Owoc.-

Warz., 45(2), 7-9.

25. Dajnowiec F, Reps, Jarmul I, Wasilewski R. 1997. Substytuty podpuszczki otrzymane przy

użyciu drobnoustrojów modyfikowanych metodą inżynierii genetycznej. Przem. Spoż.,

51(12), 39-42.

26. Davies N. 2001. Europa – rozprawa historyka z historią. Wydawnictwo Znak, Kraków.

27. De Cordt S, Avila I, Hendrickx M, Tobback P. 1994. DSC and protein-based time-

temperature integrators: case study of

-amylase stabilized by polyols and/or sugar.

Biotechnol. Bioeng., 44, 859-865.

28. De Cordt S., Hendrickx M., Maesmans G., Tobback P. 1994. The influence of polyalcohols

and carbohydrates on the thermostability of

- amylase. Biotechnol. Bioeng., 43, 107-

114.

29. Domian E. 2002. Aglomeracja w przemyśle spożywczym. Przem. Spoż., 56(8), 80-88.

30. Etzel MR, Suen SY, Halverson SL, Budijono S. 1996. Enzyme inactivation in a droplet

forming a bubble during drying. J. Food Eng, 27, 17-34.

31. Fágáin CÓ. 1995. Understanding and increasing protein stability. Biochim. Biophys. Acta,

1252, 1-14.

32. Finney J, Buffo R, Reineccius GA. 2002. Effects of type of atomisation and processing

temperatures on the physical properties and stability of spray dried flavours. J. Food Sci.,

67(3), 1108-1114.

33. Fitter J, Herrmann R, Hauß T, Lechner RE, Dencher NA. 2001. Dynamical properties of

-amylase in the folded and unfolded state: the role of thermal equilibrium fluctuations for

conformational entropy and protein stabilisation. Physica B., 301, 1-7.

34. Fu WY, Suen S, Etzel MR. 1995. Inactivation

of Lactococcus ssp. Lactis C2

and alkaline

phosphatase during spray drying. Drying Technol., 13 (5-7), 1463-1476.

35. Geeraerd AH, Herremans CH, Ludikhuyze LR, Hendrickx ME, Van Impe JF. 1998.

Evaluation of model parameter accuracy by using joint confidence regions: application to

117

Spis literatury

low complexity neural networks to describe enzyme inactivation. Math. Comput. Simul.,

48, 53-64.

36. Goerlich E. 1975. Stan szklisty. W: Chemia ciała stałego (red. J Dereń, J Haber,

R Pampuch). Państwowe Wydawnictwa Naukowe, Warszawa.

37. Graber M, Combes D. 1989. Effect of polyols on fungal alpha-amylase thermostability.

Enzyme Microb. Technol., 11, 673-677.

38. Grabowski S, Mujumdar AS, Ramaswamy HS, Strumiło C. 1997. Evaluation of fluidized

versus spouted bed drying of baker’s yeast. Drying Technol., 15 (2), 625-634.

39. Grajek W. 1999. Biotechnologiczne metody kształtowania jakości żywności – produkcja

dodatków do żywności oraz rośliny transgeniczne. W: Surowce, technologia i dodatki

a jakość żywności (red. J Czapski, W Grajek, E Pospiech). Wydawnictwo AR im. Augusta

Cieszkowskiego w Poznaniu, Poznań, 299-341.

40. Greenspan L. 1977. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. J. Res.

Nat. Bur. Stand. (US) – Physics Chem., 81A (1), 89-96.

41. Guiavarc’h YP, Deli V, Van Loey AM, Hendrickx ME. 2002. Development of an enzymic

time temperature integrator for sterilization processes based on

Bacillus licheniformis

-amylase at reduced water content. J. Food Sci., 67(1), 285-291.

42. Guiavarc’h YP, Sila D, Duvetter T, Van Loey A, Hendrickx. 2003. Influence of sugars and

polyols on the thermal stability of purified tomato and cucumber pectinmethylesterases:

a basis for TTI development. Enzyme Microb. Technol., 33, 544-555.

43. Haentjens TH, Van Loey AM, Hendrickx ME, Tobback PP. 1998. The use of

-amylase at

reduced moisture content to develop time temperature integrators for sterilization

processes. Lebensm.- Wiss. u.-Technol., 31, 467-472.

44. Holme DJ, Peck H. 1993. Proteins. In: Analytical biochemistry. Longman Scientific

& Technical, Harlow, UK, 399-421.

45. Janeček Š, Baláž S. 1992.

-Amylases and approaches leading to their enhanced stability.

FEBS Lett., 304(1), 1-3.

46. Johnson JAC, Etzel MR. 1993. Inactivation of lactic acid bacteria during spray drying.

AICHe Symposium Series, 89(297), 98-107.

47. Johnson ML. 1992. Why, when, and how biochemists should use least squares. Anal.

Biochem., 206, 215-225.

118

Spis literatury

48. Kalinowska H, Turkiewicz M, Bielecki S. 2000. Enzymy nowej generacji w produkcji

żywności. Przem. Spoż., 54(10), 3-5.

49. Kączkowski J. 1999. Podstawy biochemii. Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, Warszawa.

50. Klibanov AM. 1983. Thermostabilisation of enzymes. Adv. App. Microbiol., 29, 1-29.

51. Kuriki T, Imanaka T. 1999. The concept of the

-amylase family: structural similarity and

common catalytic mechanism. J. Biosci. Bioeng., 87(5), 557-565.

52. Kwapińska M. 2002. Wpływ parametrów suszenia i rozpylania na własności fizyczne

produktów. Rozprawa doktorska, Wydział Inżynierii Procesowej i Ochrony Środowiska,

Politechnika Łódzka.

53. Lee BH. 1996. Other microorganism-based processes and products. In: Fundamentals of

Food Biotechnology (ed. YH Hui). VCH Publishers, Inc., New York.

54. Lee BH. 1996. Principles of biochemistry. In: Fundamentals of Food Biotechnology (ed.

YH Hui). VCH Publishers, Inc., New York.

55. Lee JC, Timasheff SN. 1981. The stabilisation of proteins by sucrose. J Biol. Chem.,

256(14), 7193-7201.

56. Lévêque E, Janeček Š, Haye B, Belarbi A. 2000. Thermophilic archaeal amylolytic enzymes.

Enzyme Microb. Technol., 26, 3-14.

57. Lewicki PP. 1997. Water sorption isotherms and their estimation in food model mechanical

mixtures. J. Food Eng., 32, 47-68.

58. Lewicki PP. 1999. Właściwości wody w produktach spożywczych. Zeszyty Naukowe

Politechniki Łódzkiej. Inżynieria Chemiczna i Procesowa. 811(24), 29-46.

59. Lewicki PP. 1999. Suszenie. W: Inżynieria procesowa i aparatura przemysłu spożywczego

(red. PP Lewicki). Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, Warszawa, 359-392.

60. Lewicki PP. 2004. Water as a determinant of food engineering properties. A review.

J. Food Eng., 61(4), 483-495.

61. Ling AC, Lund DB. 1978. Determining kinetic parameters for isothermal inactivation of

heat resistant and heat labile isozymes from thermal destruction curves. J. Food Sci., 43,

1307-1310.

62. Ludikhuyze LR, Van den Broeck I, Weemaes CA, Herremans CH, Van Impe JF, Hendrickx

ME, Tobback PP. 1997. Kinetics for isobaric-isothermal inactivation of

Bacillus subtilis

-amylase. Biotechnol. Progr., 13, 532-538.

119

Spis literatury

63. Lumry R, Eyring H. 1954. Conformation changes of proteins. J Phys. Chem., 58, 110-120.

64. Łomnicki A. 1999. Wprowadzenie do statystyki dla przyrodników. Wydawnictwo Naukowe

PWN, Warszawa.

65. Maa Y, Costantino HR, Nguyen P, Hsu CC. 1997. The effect of operating and formulation

variables on the morphology of spray-dried protein particles. Pharm. Dev. Technol., 2(3),

213-223.

66. Marangoni AG. 2003. How do enzymes work? In: Enzyme kinetics – a modern approach.

Wiley Interscience, Hoboken, New Jersey, 41-43.

67. Masters K. 1985. Spray drying - Handbook. George Godwin, London, UK.

68. Mazzobre MF, Buera MP, Chirife J.1997. Protective role of trehalose on thermal stability of

lactase in relation to its glass and crystal forming properties and effect of delaying

crystallization. Lebensm.- Wiss. u.-Technol., 30, 324-329.

69. Meerdink G, Van’t Riet K. 1991. Inactivation of a thermostable

-amylase during drying.

J. Food Eng., 14, 83-102.

70. Meerdink G, van’t Riet K. 1995. Prediction of product quality during spray drying. Food

Bioprod. Proc., 73C, 165-170.

71. Mellor JD, Bell GA. 2003. Freeze-drying. In: Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition

(eds. B Caballero, LC Trugo, PM Finglas). Academic Press Elsevier Science Ltd., Oxford,

UK.

72. Mitura E, Kamiński W. 1994. Suszenie na nośnikach porowatych drożdży piekarskich

Saccharomyces cerevisiae. Biotechnologia, 26(3), 54-59.

73. Matsuura Y, Kusunoki M, Harada W, Kakudo M. 1984. Structure and possible catalytic

residues of Taka-amylase A. J. Biochem., 95, 697-705.

74. Nath S, Satpathy GR. 1998. A systematic approach for investigation of spray drying

prosesses. Drying Technol., 16(6), 1173-1193.

75. Nielsen JE, Borchert TV. 2000. Protein engineering of bacterial

-amylases. Biochim.

Biophys. Acta, 1543, 253-274.

76. Ninomiya K, Yamamoto T, Oheda T, Sato K, Sazaki G. 2001. Morphology and solubility of

multiple crystal forms of Taka-amylase A. J. Cryst. Growth, 222, 311-316.

120

Spis literatury

77. Noel M, Combes D. 2003.

Rhizomucor miehei

lipase: differential scanning calorimetry and

pressure/temperature stability studies in presence of soluble additives. Enzyme Microb.

Technol., 33, 299-308.

78. Noel TR, Ring SG, Whittam PA. 1990. Glass transition in low moisture food. Trends Food

Sci. Technol., 1, 62-67.

79. Obon JM, Manjon A, Iborra JL. 1996. Comparative thermostability of glucose

dehydrogenase from

Haloferax mediterranei

. Effects of salts and polyols. Enzyme Microb.

Technol., 19, 352-360.

80. Okello HO, Brennan JG, Lewis MJ, Gilmour S. 1998. Optimisation of the spray drying of the

enzyme polyphenol oxidase by response surface methodology. Proceedings of the 11

International Drying Symposium. Drying’98 (eds. A.S. Mujumdar, C.B. Akritidis,

D. Marinos-Kouris, G.D. Saravacos), Ziti Editions, Thessaloniki, vol. C, 1713-1722.

81. Peleg M. 1977. Flowability of foods and methods for its evaluation. J Food Proc. Eng.,

1, 303-328.

82. Pierce M M. 2003. Water – structures, properties and determination. In: Encyclopedia of

Food Sciences and Nutrition (eds. B Caballero, LC Trugo, PM Fingals). Academic Press

Elsevier Science Ltd, Oxford, UK.

83. Pijanowski E, Dłużewski M, Dłużewska A, Jarczyk A. 1996. Ogólna technologia żywności.

Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, Warszawa.

84. Polska Norma PN-71/74700. Przetwory skrobiowe. Metody badań dekstryn.

85. Praca zbiorowa. 2001. Materiały do ćwiczeń z biochemii (red. M Toczko, A Grzelińska).

Wydawnictwo SGGW, Warszawa.

86. Reps A. 2003. Biotechnologia składników żywności. W: Biotechnologia żywności (red.

W Bednarski, A Reps). Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, Warszawa, 257-321.

87. Rodwell VW. 1995. Enzymy: właściwości ogólne. W: Biochemia Harpera, (red. RK Murray,

DK Granner, P Mayes), Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa.

88. Ross Y. 1995. Glass transition-related physicochemical changes in foods. Food Technol.

49(10), 97-102.

89. Ross YH. 2003. Water activity – principles and measurement. In: Encyclopedia of Food

Sciences and Nutrition (eds. BCaballero, LC Trugo, PM Fingals). Academic Press Elsevier

Science Ltd, Oxford, UK.

121

Spis literatury

90. Ross Y, Karel M. 1991. Phase transitions of mixtures of amorphous polysaccharides and

sugars. Biotechnol. Progr., 7, 49-53.

91. Roudant G, Simatos D, Champion E, Contreras-Lopez M, Le Meste M. 2004. Molecular

mobility atound the glass transition temperature: a mini review. Inn. Food Sci. Emerging

Technol., 5, 127-134.

92. Rutkowski A, Sawicka-Żukowska R. 2002. Preparaty enzymatyczne a substancje

dodatkowe do żywności. Przem. Spoż., 56(8), 50-54.

93. Rutkowski A., Gwiazda S., Dąbrowski K. 1993. Dodatki funkcjonalne do żywności. Agro

& Food Technology, Katowice, 223-224.

94. Sadykov R.A., Pobedimsky D.G., Bakhtiyarov F.R. 1997. Drying of bioactive products:

inactivation kinetics. Drying Technol., 15(10), 2401-2420.

95. Samborska K, Guiavar’h Y, Van Loey A, Hendrickx M. 2004. The influence of moisture

content on the thermostability of

Aspergillus oryzae

-amylase. Przyjęto do druku

w Enzyme Microb. Technol.

96. Samborska K, Witrowa-Rajchert D. 2002. Ocena procesu suszenia rozpyłowego

handlowego płynnego preparatu

-amylazy. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość., 2(32),

170-178.

97. Saraiva J, De Cordt S, Hendrickx M, Oliveira J, Tobback P. 1992. Inactivation of

-amylase from Bacillus amyloliquefaciens at low moisture contents. In: Stability and

stabilisation of enzymes (eds. WJJ Van den Tweel, A Harder, RM Buitelaar) Proc.

International Symposium, Maastricht, The Nederlands, 459-466.

98. Saraiva J, Oliveira J, Lemos A, Hendrickx M. 1996. Analysis of the kinetic patterns of

horseradish peroxidase thermal inactivation in sodium phosphate buffer solutions of

different ionic strength. Int. J. Food Sci. Technol., 31, 223-231.

99. Saraiva J, Oliveira JC, Hendrickx M, Oliveira FAR., and Tobback P. 1996a. Analysis of the

inactivation kinetics of freeze dried α-amylase form

Bacillus amyloliquefaciens

at different

moisture contents. Lebensm.- Wiss. u.-Technol., 29, 260-266.

100.Schebor C, Buera M P, Chirife J. 1996. Glassy state in relation to the thermal inactivation

of the enzyme invertase in amorphous dried matrices of trehalose, maltodextrin and PVP.

J. Food Eng, 30, 269-282.

101.Scott WJ. 1953. Water relations of

Staphylococus aureus

at 30

C. Aust. J. Biol. Sci.,

6, 549-564.

122

Spis literatury

102.Slade L, Levine H. 2002. Progress in food processing and storage, based on amorphous

product technology. In: Amorphous food and pharmaceutical systems – the proceedings

of conference: The amorphous state – a critical review (ed. H Levine), The Royal Society

of Chemistry, Cambridge.

103.Smith PK, Krohn RI, Hermansin GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano MD, Fujimoto EK,

Goeke NM, Olson BJ, Klenk DC. 1987. Measurement of protein using bicinchoninic acid.

Anal Biochem., 163, (1), 279.

104.Soerensen HH, Kragg I, Pisecky J, Westergaard V. 1978. Analytical methods for dry milk

production. Niro Atomizer Diary Research Group. De Forenade Trykkerier, Copenhagen,

Denmark.

105.Ståhl K, Claesson M, Lilliehorn P, Lindén H, Bäckström K. 2002. The effect of process

variables on the degradation and physical properties of spray dried insulin intended for

inhalation. Int. J. Pharm., 233, 227-237.

106.Stillinger FH, Hodgdon JA. 1994. Translation-rotation paradox for diffusion in glass-

forming liquids. Phys. Rev., E 50(3), 2064-2068.

107.Stolarek K. 2003. Badanie procesu degradacji amylolitycznego preparatu enzymatycznego

podczas suszenia rozpyłowego. Praca magisterska, Wydział Technologii Żywności, Szkoła

Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie.

108.Strumiłło C., Markowski A., Adamiec J. 1991. Selected aspects of drying of

biotechnological products. Drying’91 (eds. AS Mujumdar, J Filkowa), Elsevier Science

Publishers, Amsterdam, 36-55.

109.Sun WQ, Davidson P, Chan HSO. 1998. Protein stability in the amorphous carbohydrate

matrix: relevance to anhydrobiosis. Biochim. Biophys. Acta, 1425, 245-254.

110.Terebiznik MR, Buera MP, and Pilosof AMR. 1997. Thermal stability of dehydrated

-amylase in trehalose matrices in relation to its phase transitions. Lebensm.- Wiss.

u.-Technol., 30, 513–518.

111.Timasheff SN, Arakawa T. 1989. Stabilisation of protein structure by solvents. In: Protein

structure, a practical approach (ed. TE Creighton). IRL Press, New York, 331-344.

112.Timasheff SN. 1993. The control of protein stability and association by week interactions

with water: How do solvents affect these processes? Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.,

22, 67-97.

123

Spis literatury

113.Tomazic SJ, Klibanow AM. 1988. Mechanisms of irreversible thermal inactivation of Bacillus

-amylases. J. Biol. Chem., 263 (7), 3086-3091.

114.Van Arsdel WB. 1963. Properties of water, water vapor and air. In: Food Dehydration (eds.

WB Van Arsdel, MJ Copley), The Avi Publishing Company, Westport.

115.Van Loey A, Arthawan A, Hendrickx M, Haentjens T, Tobback P. 1997. The development

and use of an

-amylase-based time-temperature integrator to evaluate in-pack

pasteurisation processes. Lebensm.- Wiss. u.-Technol., 1997, 30, 94-100.

116.Van Loey A, Haentjens TH, Hendrickx ME, Tobback PP. 1997. The development of an

enzymic time temperature integrator to assess thermal efficacy of sterilisation of low-acid

canned foods. Food Biotechnol., 11(2), 147-168.

117.Warchalewski JR. 2001. Zastosowanie enzymów w produkcji żywności na przełomie

wieków. Przem. Spoż., 55(8), 40-44.

118.Weder JKP, Belitz HD. 2003. Protein – chemistry. In: Encyclopedia of Food Sciences and

Nutrition (eds. B Caballero, LC Trugo, PM Finglas). Academic Press Elsevier Science Ltd.,

Oxford.

119.Weemaes C, De Cordt S, Goossens K, Ludikhuyze L, Hendrickx M, Heremans K, Tobback P.

High pressure, thermal and combined pressure-temperature stabilities of

-amylase from

Bacillus

species. Biotechnol. Bioeng., 1993, 50(1), 49-56.

120.Williams ML, Landel RF, Ferry JD. 1955. The temperature dependence of relaxation

mechanisms in amorphous polymers and other glass-forming liquids. J. Chem. Eng., 77,

3701-3707.

121.Witrowa-Rajchert D, Samborska K. 2002. Metody suszenia mikroorganizmów i produktów

syntezy mikrobiologicznej. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość., 2 (31), 5-15.

122.Whitaker JR. 2003. Enzymes – functions and characteristics. In: Encyclopedia of Food

Sciences and Nutrition (eds. B Caballero, LC Trugo, PM Finglas). Academic Press Elsevier

Science Ltd., Oxford, UK.

123.Zbiciński I, Strumiłło Cz, Kwapińska M, Piątkowski M. 2001. Wpływ parametrów suszenia

i atomizacji na wybrane własności produktu końcowego. Inżynieria Chemiczna

i Procesowa, 22(3E), 1549-1554.

124.Zbiciński I, Strumiłło Cz, Deląg A. 2002. Drying kinetics and particle residence time in

spray drying. Drying Technol., 20(9), 1751-1768.

124

Aneks

10. ANEKS

Tabela 10.1. Średnia temperatura powietrza wylotowego (°C) w czasie

suszenia rozpyłowego preparatu

-amylazy w zależności od temperatury

powietrza wlotowego i strumienia surowca

Temperatura

powietrza

wlotowego

(°C)

Strumień surowca (cm

/s)

0,4

0,8

1,2

1,7

Temperatura powietrza wylotowego (

160

90,0 ± 1,7

77,3 ± 1,5

61,3 ± 3,1

51,0 ± 1,0

180

97,7 ± 2,3

87,0 ± 3,0

65,7 ± 2,1

56,3 ± 1,2

200

100,3 ± 5,5

94,3 ± 3,5

73,7 ± 3,1

66,7 ± 1,2

220

106,0 ± 1,0

104,3 ± 6,0

89,3 ± 1,2

72,7 ± 2,1

Tabela 10.2. Dwuczynnikowa analiza wariancji – wpływ temperatury

powietrza wlotowego i strumienia surowca na temperaturę powietrza
wylotowego

w czasie suszenia rozpyłowego preparatu

-amylazy

Źródło zróżnicowania

p-value

Temperatura (

0,0000

Strumień surowca (cm

/s)

0,0000

Tabela 10.3. Test t-Studenta – weryfikacja hipotezy o równości
współczynników kierunkowych prostych otrzymanych po wykreśleniu

zależności między temperaturą powietrza wylotowego a strumieniem surowca
przy czterech temperaturach powietrza wlotowego podczas suszenia

rozpyłowego preparatu

-amylazy

Temperatura powietrza

wlotowego (

Współczynnik
kierunkowy

Błąd standardowy

160

-30,7

2,8

180

-33,6

4,6

200

-28,1

5,2

220

-27,0

5,1

Porównanie

Różnica

t empiryczne

t tablicowe

160-180

2,8

0,526

2,447

160-200

2,7

0,453

2,447

160-220

3,7

0,644

2,447

180-200

5,5

0,796

2,447

180-220

6,6

0,959

2,447

126

Aneks

200-220

1,1

0,149

2,447

Tabela 10.4. Średni strumień wody (kg/h) odparowywanej w czasie
suszenia rozpyłowego preparatu

-amylazy w zależności od temperatury

powietrza wlotowego i strumienia surowca

Temperatura

powietrza

wlotowego

(

Strumień surowca (cm

/s)

0,4

0,8

1,2

1,7

Strumień odparowanej wody (kg/h)

160

1,12 ± 0,02

2,35 ± 0,07

3,36 ± 0,10

4,91 ± 0,28

180

1,13 ± 0,05

2,40 ± 0,10

3,67 ± 0,12

5,01 ± 0,17

200

1,13 ± 0,06

2,46 ± 0,04

3,71 ± 0,10

5,03 ± 0,06

220

1,11 ± 0,05

2,47 ± 0,04

3,70 ± 0,15

5,02 ± 0,18

Tabela 10.5. Dwuczynnikowa analiza wariancji – wpływ temperatury
powietrza wlotowego i strumienia surowca na strumień wody odparowywanej

w czasie suszenia rozpyłowego preparatu

-amylazy

Źródło zróżnicowania

p-value

Temperatura (

0,5866

Strumień surowca (cm

/s)

0,0000

Tabela 10.6. Średnia wilgotność powietrza wylotowego (kg H

O/kg p.s.)

w czasie suszenia rozpyłowego

-amylazy w zależności od temperatury

powietrza wlotowego i strumienia surowca

Temperatura

powietrza

wlotowego

(

Strumień surowca (cm

/s)

0,4

0,8

1,2

1,7

Wilgotność powietrza wylotowego (kg H

O/kg p.s.)

160

0,0098 ± 0,0006

0,0140 ± 0,0018

0,0250 ± 0,0020

0,0317 ± 0,0015

180

0,0084 ± 0,0005

0,0140 ± 0,0016

0,0266 ± 0,0008

0,0304 ± 0,0030

200

0,0084 ± 0,0017

0,0154 ± 0,0013

0,0261 ± 0,0012

0,0298 ± 0,0029

220

0,0093 ± 0,0025

0,0169 ± 0,0027

0,0256 ± 0,0005

0,0266 ± 0,0051

Tabela 10.7. Dwuczynnikowa analiza wariancji – wpływ temperatury

powietrza wlotowego i strumienia surowca na wilgotność powietrza
wylotowego

w czasie suszenia rozpyłowego preparatu

-amylazy

Źródło zróżnicowania

p-value

127

Aneks

Temperatura (

0,9555

Strumień surowca (cm

/s)

0,0000

Tabela 10.8. Średnie właściwe zużycie powietrza (kg p.s./kg H

w czasie

suszenia rozpyłowego preparatu

-amylazy w zależności od temperatury

powietrza wlotowego i strumienia surowca

Temperatura

powietrza

wlotowego

(

Strumień surowca (cm

/s)

0,4

0,8

1,2

1,7

Właściwe zużycie powietrza (kg p.s./kg H

160

416,7 ± 80,0

159,4 ± 60,3

49,8 ± 5,0

53,6 ± 4,5

180

500,0 ± 80,0

158,7 ± 50,3

46,0 ± 1,8

57,5 ± 10,2

200

500,0 ± 58,3

129,9 ± 22,2

47,1 ± 2,7

59,4 ± 11,7

220

344,8 ± 50,0

108,7 ± 39,6

48,4 ± 1,0

73,5 ± 25,9

Tabela 10.9. Dwuczynnikowa analiza wariancji – wpływ temperatury

powietrza wlotowego i strumienia surowca na właściwe zużycie powietrza w
czasie suszenia rozpyłowego preparatu

-amylazy

Źródło zróżnicowania

p-value

Temperatura (

0,3128

Strumień surowca (cm

/s)

0,0000

Tabela 10.10. Porównania wielokrotne – wpływ strumienia surowca na

właściwe zużycie powietrza w czasie suszenia rozpyłowego preparatu

amylazy

Strumień surowca (cm

/s) Liczebność Średnia

Grupy

homogeniczne

1,2

47,9

1,7

63,3

0,8

147,0

0,4

472,3

Porównanie

Różnica

0,4-0,8

325,2

0,4-1,2

424,3

0,4-1,7

408,9

0,8-1,2

99,1

0,8-1,7

83,7

1,2-1,7

-15,4

* zanotowano statystycznie istotną różnicę

128

Aneks

Tabela 10.11. Średnie właściwe zużycie ciepła (kJ/kg H

O) w czasie

suszenia rozpyłowego preparatu

-amylazy w zależności od temperatury

powietrza wlotowego i strumienia surowca

Temperatura

powietrza

wlotowego

(

Strumień surowca (cm

/s)

0,4

0,8

1,2

1,7

Właściwe zużycie ciepła (kJ/kg H

160

31086,8 ± 9553,0

11530,6 ± 3659,3

4557,6 ± 314,8

4112,0 ± 148,1

180

49549,6 ± 25167,7

13100,5 ± 3750,6

4618,5 ± 179,8

4545,9 ± 400,0

200

40777,7 ± 10841,0

12160,1 ± 1158,5

5061,9 ± 293,0

5256,5 ± 483,4

220

32329,5 ± 5517,5

11746,3 ± 3496,4

5924,8 ± 128,6

6345,5 ± 1427,0

Tabela 10.12. Dwuczynnikowa analiza wariancji – wpływ temperatury

powietrza wlotowego i strumienia surowca na właściwe zużycie ciepła w
czasie suszenia rozpyłowego preparatu

-amylazy

Źródło zróżnicowania

p-value

Temperatura (

0,3917

Strumień surowca (cm

/s)

0,0000

Tabela 10.13. Porównania wielokrotne – wpływ strumienia surowca na

właściwe zużycie ciepła w czasie suszenia rozpyłowego preparatu

amylazy

Strumień surowca (cm

/s) Liczebność Średnia

Grupy

homogeniczne

1,2

5050,17

1,7

5184,33

0,8

12693,6

0,4

38435,8

Porównanie

Różnica

0,4-0,8

25742,2

0,4-1,2

33385,7

0,4-1,7

33251,5

0,8-1,2

7643,4

0,8-1,7

7509,2

1,2-1,7

-134,1

* zanotowano statystycznie istotną różnicę

129

Aneks

Tabela 10.14. Średnia zawartość wody w suszach (g H

O/g s.s.)

zależności od temperatury powietrza wlotowego i strumienia surowca w czasie
suszenia rozpyłowego preparatu

-amylazy

Temperatura

powietrza

wlotowego

(

Strumień surowca (cm

/s)

0,4

0,8

1,2

1,7

Zawartość wody w suszach (g H

O/g s.s.)

160

0,031 ± 0,006

0,051 ± 0,008

0,093 ± 0,024

0,106 ± 0,008

180

0,029 ± 0,003

0,040 ± 0,003

0,087 ± 0,050

0,097 ± 0,004

200

0,029 ± 0,007

0,036 ± 0,002

0,083 ± 0,048

0,085 ± 0,005

220

0,030 ± 0,008

0,032 ± 0,005

0,069 ± 0,004

0,075 ± 0,010

Tabela 10.15. Dwuczynnikowa analiza wariancji – wpływ temperatury

powietrza wlotowego i strumienia surowca na zawartość wody w suszach

Źródło zróżnicowania

p-value

Temperatura (

0,0001

Strumień surowca (cm

/s)

0,0000

Tabela 10.16. Średnia aktywność względna (%) suszonej

-amylazy

w zależności od temperatury powietrza wlotowego i strumienia surowca

Temperatura

powietrza

wlotowego

(

Strumień surowca (cm

/s)

0,4

0,8

1,2

1,7

Aktywność względna

α−

amylazy (%)

160

66,0 ± 1,8

71,1 ± 6,4

80,2 ± 3,2

86,6 ± 1,9

180

64,3 ± 1,2

75,3 ± 3,4

84,3 ± 1,6

88,0 ± 1,0

200

61,2 ± 1,3

71,2 ± 3,9

83,9 ± 2,6

89,0 ± 2,7

220

56,7 ± 4,9

65,7 ± 8,0

86,7 ± 1,2

90,1 ± 1,5

Tabela 10.17. Dwuczynnikowa analiza wariancji – wpływ temperatury
powietrza wlotowego i strumienia surowca na aktywność względną

suszonej

-amylazy

Źródło zróżnicowania

p-value

Temperatura (

0,3285

Strumień surowca (cm

/s)

0,0000

130

Aneks

Tabela 10.18. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w roztworze wodnym

Czas (min)

log (

)

ln (

)

Temperatura 62,5°C

0,0

0,485

1,000

0,000

1,0

0,406

0,837

-0,077

-0,178

2,5

0,355

0,732

-0,136

-0,312

5,0

0,261

0,538

-0,269

-0,620

7,5

0,153

0,315

-0,501

-1,154

10,0

0,121

0,249

-0,603

-1,388

12,5

0,091

0,188

-0,727

-1,673

17,5

0,050

0,103

-0,987

-2,272

Temperatura 65,0°C

0,0

0,420

1,000

0,000

0,2

0,389

0,926

-0,033

-0,077

0,5

0,376

0,895

-0,048

-0,111

1,0

0,341

0,812

-0,090

-0,208

2,5

0,239

0,569

-0,245

-0,564

5,0

0,113

0,269

-0,570

-1,313

7,5

0,068

0,162

-0,791

-1,821

10,0

0,037

0,088

-1,055

-2,429

15,0

0,008

0,019

-1,720

-3,961

Temperatura 67,5°C

0,0

0,485

1,000

0,000

0,5

0,351

0,724

-0,140

-0,323

1,0

0,297

0,612

-0,213

-0,490

2,0

0,196

0,404

-0,393

-0,906

4,0

0,088

0,181

-0,741

-1,707

6,0

0,044

0,091

-1,042

-2,400

8,0

0,027

0,056

-1,254

-2,888

10,0

0,019

0,039

-1,407

-3,240

Temperatura 70,0°C

0,0

0,420

1,000

0,000

0,1

0,402

0,957

-0,019

-0,044

0,3

0,314

0,748

-0,126

-0,291

0,5

0,270

0,643

-0,192

-0,442

1,0

0,203

0,483

-0,316

-0,727

2,5

0,080

0,190

-0,720

-1,658

3,5

0,048

0,114

-0,942

-2,169

5,0

0,004

0,010

-2,021

-4,654

131

Aneks

Tabela 10.19. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w systemie S2

o zawartości wody 3,5 g H

O/g s.s.

Czas (min)

log (

)

ln (

)

Temperatura 70,0°C

0,0

0,296

-0,529

0,000

0,5

0,260

-0,585

-0,130

1,0

0,253

-0,597

-0,157

2,5

0,216

-0,666

-0,315

5,0

0,178

-0,750

-0,509

7,5

0,142

-0,848

-0,735

10,0

0,127

-0,896

-0,846

20,0

0,068

-1,167

-1,471

Temperatura 72,5°C

0,0

0,286

1,788

0,252

0,000

0,5

0,242

1,513

0,180

-0,167

1,0

0,221

1,381

0,140

-0,258

2,5

0,187

1,169

0,068

-0,425

5,0

0,124

0,775

-0,111

-0,836

7,5

0,092

0,575

-0,240

-1,134

10,0

0,068

0,425

-0,372

-1,436

12,5

0,050

0,313

-0,505

-1,744

15,0

0,037

0,231

-0,636

-2,045

20,0

0,020

0,125

-0,903

-2,660

Temperatura 73,5°C

0,0

0,246

-0,609

0,000

0,5

0,229

-0,640

-0,072

1,0

0,207

-0,684

-0,173

2,5

0,146

-0,836

-0,522

5,0

0,087

-1,060

-1,039

7,5

0,051

-1,292

-1,574

10,0

0,033

-1,481

-2,009

12,5

0,025

-1,602

-2,286

Temperatura 75,0°C

0,0

0,247

0,988

-0,005

0,000

0,5

0,189

0,756

-0,121

-0,268

1,0

0,140

0,560

-0,252

-0,5677459

2,0

0,109

0,436

-0,361

-0,8180405

4,0

0,042

0,168

-0,775

-1,7717187

6,0

0,025

0,100

-1,000

-2,2905125

8,0

0,013

0,052

-1,284

-2,944439

132

Aneks

Tabela 10.20. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w systemie S3

o zawartości wody 1,8 g H

O/g s.s.

Czas (min)

log (

)

ln (

)

Temperatura 73,5°C

0,0

0,224

0,000

2,5

0,174

0,777

-0,110

-0,253

5,0

0,127

0,567

-0,246

-0,567

7,5

0,124

0,554

-0,257

-0,591

10,0

0,108

0,482

-0,317

-0,730

15,0

0,081

0,362

-0,442

-1,017

20,0

0,060

0,268

-0,572

-1,317

30,0

0,039

0,174

-0,759

-1,748

Temperatura 75,0°C

0,0

0,186

1,000

0,000

1,5

0,137

0,737

-0,133

-0,306

2,5

0,117

0,629

-0,201

-0,464

5,0

0,088

0,473

-0,325

-0,748

7,5

0,071

0,382

-0,418

-0,963

10,0

0,054

0,290

-0,537

-1,237

12,5

0,043

0,231

-0,636

-1,465

15,0

0,031

0,167

-0,778

-1,792

20,0

0,025

0,134

-0,872

-2,007

Temperatura 76,5°C

0,0

0,224

0,000

1,0

0,148

0,661

-0,180

-0,414

2,0

0,111

0,496

-0,305

-0,702

4,0

0,065

0,290

-0,537

-1,237

5,0

0,052

0,232

-0,634

-1,460

6,0

0,042

0,188

-0,727

-1,674

8,0

0,027

0,121

-0,919

-2,116

10,0

0,022

0,098

-1,008

-2,321

12,0

0,016

0,071

-1,146

-2,639

Temperatura 78,5°C

0,0

0,186

1,000

0,000

1,0

0,070

0,376

-0,424

-0,977

2,0

0,042

0,226

-0,646

-1,488

3,0

0,026

0,140

-0,855

-1,968

4,0

0,016

0,086

-1,065

-2,453

5,0

0,012

0,065

-1,190

-2,741

6,0

0,008

0,043

-1,366

-3,146

133

Aneks

Tabela 10.21. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w systemie S4

o zawartości wody 0,163 g H

O/g s.s.

Czas (min)

log (

)

ln (

)

Temperatura 95,0°C

0,0

0,250

1,000

0,000

5,0

0,174

0,697

-0,157

-0,361

7,5

0,132

0,648

-0,188

-0,434

10,0

0,126

0,503

-0,299

-0,688

15,0

0,075

0,298

-0,526

-1,211

20,0

0,070

0,278

-0,555

-1,279

25,0

0,040

0,160

-0,795

-1,830

Temperatura 97,0°C

0,0

0,203

1,000

0,000

1,0

0,191

0,938

-0,028

-0,064

2,5

0,162

0,798

-0,098

-0,226

5,0

0,119

0,584

-0,234

-0,538

7,5

0,076

0,374

-0,428

-0,984

10,0

0,075

0,368

-0,435

-1,001

15,0

0,043

0,213

-0,672

-1,547

20,0

0,027

0,132

-0,880

-2,027

Temperatura 98,5°C

0,0

0,134

1,000

0,000

1,0

0,103

0,770

-0,113

-0,261

2,0

0,084

0,627

-0,203

-0,467

3,0

0,064

0,477

-0,321

-0,739

4,0

0,062

0,465

-0,333

-0,766

6,0

0,030

0,227

-0,645

-1,484

8,0

0,024

0,180

-0,744

-1,713

12,0

0,008

0,058

-1,236

-2,846

Temperatura 100,0°C

0,0

0,250

1,000

0,000

1,0

0,149

0,597

-0,224

-0,515

2,5

0,070

0,282

-0,550

-1,267

5,0

0,032

0,130

-0,887

-2,043

7,5

0,006

0,026

-1,587

-3,653

10,0

0,005

0,019

-1,710

-3,938

134

Aneks

Tabela 10.22. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w systemie S5

o zawartości wody 0,060 g H

O/g s.s.

Czas (min)

log (

)

ln (

)

Temperatura 100,0°C

0,0

0,229

1,000

0,000

3,5

0,168

0,732

-0,136

-0,312

6,0

0,088

0,553

-0,257

-0,593

7,5

0,109

0,478

-0,321

-0,738

10,0

0,103

0,452

-0,345

-0,794

12,5

0,051

0,319

-0,496

-1,142

15,0

0,052

0,229

-0,640

-1,475

17,5

0,043

0,188

-0,726

-1,672

Temperatura 102,5°C

0,0

0,159

1,000

0,000

1,0

0,136

0,854

-0,069

-0,158

5,0

0,068

0,425

-0,371

-0,855

5,0

0,106

0,463

-0,335

-0,770

10,0

0,029

0,180

-0,745

-1,716

20,0

0,015

0,065

-1,187

-2,734

15,0

0,017

0,108

-0,966

-2,225

Temperatura 105,0°C

0,0

0,159

1,000

0,000

1,0

0,114

0,716

-0,145

-0,335

2,5

0,090

0,394

-0,405

-0,932

4,0

0,039

0,248

-0,605

-1,394

6,0

0,025

0,157

-0,803

-1,849

7,5

0,023

0,101

-0,998

-2,297

8,0

0,016

0,098

-1,010

-2,326

10,0

0,012

0,075

-1,126

-2,593

Temperatura 107,5°C

0,0

0,159

1,000

0,000

1,0

0,078

0,490

-0,310

-0,713

1,5

0,075

0,472

-0,326

-0,751

2,0

0,037

0,234

-0,631

-1,453

2,5

0,029

0,181

-0,742

-1,708

3,0

0,020

0,123

-0,910

-2,096

3,5

0,021

0,129

-0,889

-2,048

135

Aneks

Tabela 10.23. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w systemie S6

o zawartości wody 0,029 g H

O/g s.s.

Czas (min)

log (

)

ln (

)

Temperatura 100,0°C

0,251

1,000

0,000

2,5

0,216

0,861

-0,065

-0,150

5,0

0,176

0,703

-0,153

-0,353

10,0

0,110

0,439

-0,357

-0,822

15,0

0,105

0,417

-0,380

-0,874

20,0

0,069

0,276

-0,560

-1,289

25,0

0,057

0,227

-0,644

-1,483

30,0

0,029

0,116

-0,937

-2,158

Temperatura 105,0°C

0,0

0,251

1,000

0,000

2,5

0,129

0,514

-0,289

-0,666

5,0

0,059

0,237

-0,625

-1,440

7,5

0,056

0,222

-0,654

-1,506

10,0

0,030

0,121

-0,918

-2,113

15,0

0,026

0,104

-0,982

-2,260

20,0

0,013

0,053

-1,272

-2,930

30,0

0,006

0,024

-1,612

-3,711

Temperatura 110,0°C

0,0

0,251

1,000

0,000

1,0

0,098

0,392

-0,406

-0,936

2,0

0,063

0,252

-0,598

-1,378

3,5

0,047

0,186

-0,730

-1,681

6,5

0,022

0,087

-1,061

-2,443

10,0

0,012

0,048

-1,320

-3,041

15,0

0,008

0,031

-1,504

-3,463

20,0

0,004

0,015

-1,815

-4,178

Temperatura 115,0°C

0,0

0,251

1,000

0,000

1,0

0,068

0,269

-0,570

-1,313

2,0

0,035

0,138

-0,860

-1,980

4,0

0,017

0,066

-1,178

-2,712

5,0

0,013

0,053

-1,277

-2,941

7,0

0,007

0,027

-1,571

-3,617

10,0

0,003

0,012

-1,917

-4,413

136

Aneks

Tabela 10.24. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w roztworze

buforowym 20 mM Bis-Tris w temperaturach 62-68°C

Temperatura 62,0°C

Temperatura 64,0°C

Czas (min)

log (

)

Czas (min)

log (

)

0,0

0,221

1,000

0,000

0,0

0,228

1,000

0,000

3,5

0,101

0,457

-0,340

2,5

0,089

0,390

-0,409

3,5

0,111

0,502

-0,299

2,5

0,094

0,412

-0,385

7,0

0,055

0,249

-0,604

5,0

0,042

0,184

-0,735

7,0

0,063

0,285

-0,545

5,0

0,048

0,211

-0,677

10,5

0,028

0,127

-0,897

7,5

0,020

0,088

-1,057

10,5

0,033

0,149

-0,826

7,5

0,026

0,114

-0,943

14,0

0,018

0,081

-1,089

10,0

0,015

0,066

-1,182

14,0

0,021

0,095

-1,022

10,0

0,018

0,079

-1,103

Temperatura 66,0°C

Temperatura 68,0°C

Czas (min)

log (

)

Czas (min)

log (

)

0,0

0,245

1,000

0,000

0,0

0,231

1,000

0,000

1,5

0,112

0,457

-0,340

1,0

0,063

0,257

-0,590

1,5

0,131

0,535

-0,272

1,0

0,055

0,224

-0,649

3,0

0,075

0,306

-0,514

1,5

0,037

0,151

-0,821

4,5

0,035

0,143

-0,845

1,5

0,032

0,131

-0,884

4,5

0,032

0,131

-0,884

2,0

0,025

0,102

-0,991

6,0

0,018

0,073

-1,134

2,0

0,030

0,122

-0,912

2,5

0,021

0,086

-1,067

137

Aneks

Tabela 10.25. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w roztworze

buforowym

20 mM Bis-Tris z dodatkiem 100 mg/cm

mannitolu w temperaturach 62-

68°C

Temperatura 62,0°C

Temperatura 68,0°C

Czas (min)

log (

)

Czas (min)

log (

)

0,0

0,226

1,000

0,000

0,0

0,230

1,000

0,000

3,0

0,138

0,611

-0,214

1,0

0,097

0,422

-0,375

3,0

0,147

0,650

-0,187

1,0

0,098

0,426

-0,371

6,0

0,104

0,460

-0,337

1,5

0,067

0,291

-0,536

6,0

0,105

0,465

-0,333

1,5

0,074

0,322

-0,492

10,0

0,060

0,265

-0,576

2,0

0,048

0,209

-0,680

10,0

0,065

0,288

-0,541

2,0

0,047

0,204

-0,690

14,0

0,039

0,173

-0,763

2,5

0,030

0,130

-0,885

14,0

0,044

0,195

-0,711

2,5

0,040

0,174

-0,760

Temperatura 64,0°C

Temperatura 66,0°C

Czas (min)

log (

)

Czas (min)

log (

)

0,0

0,230

1,000

0,000

0,0

0,232

1,000

0,000

10,0

0,034

0,148

-0,829

5,0

0,039

0,168

-0,774

10,0

0,039

0,170

-0,770

5,0

0,044

0,190

-0,722

10,0

0,043

0,187

-0,727

5,0

0,057

0,246

-0,610

10,0

0,047

0,205

-0,689

5,0

0,063

0,272

-0,566

138

Aneks

Tabela 10.26. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w roztworze

buforowym

20 mM Bis-Tris z dodatkiem 200 mg/cm

laktitolu w temperaturach 62-68°C

Temperatura 62,0°C

Temperatura 68,0°C

Czas (min)

log (

)

Czas (min)

log (

)

0,0

0,216

1,000

0,000

0,0

0,235

1,000

0,000

10,0

0,146

0,676

-0,170

1,0

0,095

0,405

-0,392

10,0

0,132

0,611

-0,214

1,0

0,115

0,490

-0,309

20,0

0,087

0,403

-0,395

2,0

0,046

0,196

-0,707

20,0

0,090

0,417

-0,380

2,0

0,052

0,222

-0,654

30,0

0,055

0,255

-0,594

2,5

0,041

0,175

-0,757

30,0

0,062

0,287

-0,542

2,5

0,041

0,175

-0,757

40,0

0,043

0,199

-0,701

5,0

0,015

0,064

-1,194

40,0

0,047

0,218

-0,662

5,0

0,011

0,047

-1,329

Temperatura 64,0°C

Temperatura 66,0°C

Czas (min)

log (

)

Czas (min)

log (

)

0,0

0,229

1,000

0,000

0,0

0,229

1,000

0,000

20,0

0,027

0,118

-0,928

8,0

0,044

0,192

-0,716

20,0

0,029

0,127

-0,897

8,0

0,047

0,205

-0,688

20,0

0,033

0,144

-0,841

8,0

0,049

0,214

-0,670

20,0

0,035

0,153

-0,816

8,0

0,053

0,231

-0,636

139

Aneks

Tabela 10.27. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w roztworze

buforowym

20 mM Bis-Tris z dodatkiem czterech różnych stężeń sorbitolu w
temperaturze 68°C

100 mg/cm

200 mg/cm

Czas (min)

log (

)

Czas (min)

log (

)

0,0

0,165

1,000

0,000

0,0

0,222

1,000

0,000

1,0

0,075

0,456

-0,341

1,0

0,112

0,506

-0,296

1,0

0,087

0,529

-0,277

1,0

0,116

0,524

-0,281

2,0

0,042

0,255

-0,593

2,5

0,050

0,226

-0,646

3,0

0,025

0,152

-0,818

2,5

0,053

0,239

-0,621

3,0

0,022

0,134

-0,874

4,0

0,026

0,117

-0,930

4,0

0,015

0,091

-1,040

4,0

0,030

0,135

-0,868

5,0

0,015

0,068

-1,169

300 mg/cm

500 mg/cm

Czas (min)

log (

)

Czas (min)

log (

)

0,0

0,198

0,000

0,0

0,229

0,000

1,0

0,134

0,677

-0,170

7,5

0,049

0,214

-0,670

2,5

0,093

0,470

-0,328

7,5

0,049

0,214

-0,670

2,5

0,080

0,404

-0,394

15,0

0,014

0,061

-1,214

5,0

0,051

0,258

-0,589

3,0

0,116

0,507

-0,295

5,0

0,039

0,197

-0,706

3,0

0,130

0,568

-0,246

7,5

0,021

0,106

-0,974

15,0

0,018

0,079

-1,105

7,5

0,021

0,106

-0,974

140

Aneks

Tabela 10.28. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w roztworze

buforowym 20 mM Bis-Tris z dodatkiem pięciu różnych stężeń glicerolu w

temperaturze 68°C

8,3 % v/v

13,0 % v/v

Czas

(min)

log (

)

Czas (min)

log (

)

0,0

0,221

1,000

0,000

0,0

0,159

1,000

0,000

2,0

0,053

0,240

-0,619

1,5

0,096

0,604

-0,219

2,0

0,064

0,290

-0,537

1,5

0,093

0,585

-0,233

3,0

0,044

0,200

-0,700

3,0

0,071

0,447

-0,350

3,0

0,050

0,227

-0,644

3,0

0,052

0,327

-0,485

4,0

0,024

0,109

-0,963

4,5

0,032

0,201

-0,696

4,0

0,029

0,132

-0,881

4,5

0,039

0,245

-0,610

5,0

0,023

0,104

-0,982

6,0

0,020

0,126

-0,900

5,0

0,022

0,100

-1,001

6,0

0,023

0,145

-0,840

24,8 % v/v

30,0 % v/v

Czas

(min)

log (

)

Czas (min)

log (

)

0,0

0,194

1,000

0,000

0,0

0,213

1,000

0,000

6,0

0,066

0,340

-0,468

2,5

0,127

0,596

-0,225

6,0

0,068

0,351

-0,455

2,5

0,124

0,582

-0,235

4,0

0,075

0,387

-0,413

5,0

0,076

0,357

-0,448

4,0

0,077

0,397

-0,401

5,0

0,078

0,366

-0,436

9,0

0,027

0,139

-0,856

7,5

0,052

0,244

-0,612

9,0

0,032

0,165

-0,783

7,5

0,057

0,268

-0,573

10,0

0,035

0,164

-0,784

10,0

0,049

0,230

-0,638

41,0 % v/v

Czas

(min)

log (

)

0,0

0,163

1,000

0,000

10,0

0,063

0,387

-0,413

10,0

0,065

0,399

-0,399

20,0

0,032

0,196

-0,707

20,0

0,032

0,196

-0,707

30,0

0,017

0,104

-0,982

40,0

0,010

0,061

-1,212

141

Aneks

Tabela 10.29. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w roztworze

buforowym 20 mM Bis-Tris z dodatkiem czterech różnych stężeń trehalozy w

temperaturze 68°C

140 mg/cm

200 mg/cm

Czas (min)

log (

)

Czas (min)

log (

)

0,0

0,218

1,000

0,000

0,0

0,226

1,000

0,000

1,5

0,092

0,414

-0,383

1,5

0,118

0,522

-0,282

2,0

0,075

0,338

-0,471

3,0

0,067

0,296

-0,528

2,0

0,089

0,401

-0,397

3,0

0,077

0,341

-0,468

3,0

0,038

0,171

-0,767

4,5

0,048

0,212

-0,673

3,0

0,049

0,221

-0,656

6,0

0,032

0,142

-0,849

4,0

0,039

0,176

-0,755

6,0

0,034

0,150

-0,823

4,0

0,044

0,198

-0,703

420 mg/cm

705 mg/cm

Czas (min)

log (

)

Czas (min)

log (

)

0,0

0,215

1,000

0,000

0,0

0,220

1,000

0,000

4,0

0,104

0,484

-0,315

10,0

0,114

0,504

-0,297

8,0

0,053

0,247

-0,608

20,0

0,066

0,292

-0,535

8,0

0,055

0,256

-0,592

30,0

0,037

0,164

-0,786

10,1

0,040

0,186

-0,730

30,0

0,040

0,177

-0,752

10,1

0,045

0,209

-0,679

45,0

0,028

0,124

-0,907

12,0

0,036

0,167

-0,776

45,0

0,021

0,093

-1,032

12,0

0,035

0,163

-0,788

142

Aneks

Tabela 10.30. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w roztworze

buforowym 20 mM Bis-Tris z dodatkiem trzech różnych stężeń sacharozy w

temperaturze 68°C

140 mg/cm

200 mg/cm

Czas (min)

log (

)

Czas (min)

log (

)

0,0

0,197

1,000

0,000

0,0

0,210

1,000

0,000

2,5

0,093

0,472

-0,326

1,0

0,167

0,795

-0,100

2,5

0,105

0,533

-0,273

1,0

0,166

0,790

-0,102

5,0

0,052

0,264

-0,578

2,5

0,122

0,581

-0,236

5,0

0,058

0,294

-0,531

2,5

0,126

0,600

-0,222

7,5

0,030

0,152

-0,817

7,5

0,054

0,257

-0,590

7,5

0,035

0,178

-0,750

7,5

0,056

0,267

-0,574

10,0

0,018

0,091

-1,039

11,0

0,033

0,157

-0,804

10,0

0,021

0,107

-0,972

11,0

0,035

0,167

-0,778

420 mg/cm

Czas (min)

log (

)

0,0

0,181

1,000

0,000

10,0

0,127

0,702

-0,154

10,0

0,130

0,718

-0,144

15,0

0,109

0,602

-0,220

15,0

0,111

0,613

-0,212

30,5

0,067

0,370

-0,432

30,5

0,071

0,392

-0,406

70,0

0,024

0,133

-0,877

70,0

0,024

0,133

-0,877

143

Aneks

Tabela 10.31. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w roztworze

buforowym

20 mM Bis-Tris z dodatkiem 300 mg/cm

sorbitolu w temperaturach 62-

68°C

Temperatura 62,0°C

Temperatura 64,0°C

Czas (min)

log (

)

Czas (min)

log (

)

0,0

0,218

1,000

0,000

0,0

0,214

1,000

0,000

20,0

0,092

0,422

-0,375

10,0

0,086

0,409

-0,389

20,0

0,114

0,523

-0,282

10,0

0,088

0,418

-0,379

40,0

0,058

0,266

-0,575

25,0

0,029

0,138

-0,861

40,0

0,059

0,271

-0,568

25,0

0,031

0,147

-0,832

60,3

0,037

0,170

-0,770

18,0

0,045

0,214

-0,670

80,0

0,022

0,101

-0,996

32,0

0,018

0,086

-1,068

80,0

0,022

0,101

-0,996

Temperatura 66,0°C

Temperatura 68,0°C

Czas (min)

log (

)

Czas (min)

log (

)

0,0

0,211

1,000

0,000

0,0

0,198

1,000

0,000

7,5

0,059

0,280

-0,552

1,0

0,134

0,677

-0,170

7,5

0,070

0,333

-0,478

2,5

0,093

0,470

-0,328

15,0

0,023

0,109

-0,962

2,5

0,080

0,404

-0,394

15,0

0,024

0,114

-0,943

5,0

0,051

0,258

-0,589

3,0

0,132

0,627

-0,203

5,0

0,039

0,197

-0,706

11,0

0,037

0,176

-0,755

7,5

0,021

0,106

-0,974

7,5

0,021

0,106

-0,974

144

Aneks

Tabela 10.32. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w roztworze

buforowym

20 mM Bis-Tris z dodatkiem 30 %(v/v) glicerolu w temperaturach 62-68°C

Temperatura 62,0°C

Temperatura 64,0°C

Czas (min)

log (

)

Czas (min)

log (

)

0,0

0,225

1,000

0,000

0,0

0,218

1,000

0,000

40,0

0,111

0,493

-0,307

30,0

0,070

0,322

-0,492

40,0

0,112

0,498

-0,303

60,0

0,033

0,152

-0,819

80,0

0,061

0,271

-0,567

60,0

0,029

0,133

-0,875

80,0

0,047

0,209

-0,680

48,5

0,040

0,184

-0,735

122,0

0,023

0,102

-0,990

48,5

0,045

0,207

-0,684

122,0

0,029

0,129

-0,890

15,0

0,123

0,566

-0,248

160,0

0,021

0,093

-1,030

15,0

0,121

0,556

-0,255

160,0

0,021

0,093

-1,030

Temperatura 66,0°C

Temperatura 68,0°C

Czas (min)

log (

)

Czas (min)

log (

)

0,0

0,221

1,000

0,000

0,0

0,213

1,000

0,000

15,0

0,069

0,312

-0,506

2,5

0,127

0,596

-0,225

15,0

0,072

0,326

-0,487

2,5

0,124

0,582

-0,235

31,0

0,029

0,131

-0,882

5,0

0,076

0,357

-0,448

7,5

0,114

0,516

-0,287

5,0

0,078

0,366

-0,436

38,0

0,020

0,090

-1,043

7,5

0,052

0,244

-0,612

38,0

0,021

0,095

-1,022

7,5

0,057

0,268

-0,573

10,0

0,035

0,164

-0,784

10,0

0,049

0,230

-0,638

145

Aneks

Tabela 10.33. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w roztworze

buforowym

20 mM Bis-Tris z dodatkiem 200 mg/cm

trehalozy w temperaturach 62-

68°C

Temperatura 62,0°C

Temperatura 64,0°C

Czas (min)

log (

)

Czas (min)

log (

)

0,0

0,215

1,000

0,000

0,0

0,249

1,000

0,000

7,5

0,126

0,586

-0,232

4,0

0,126

0,506

-0,296

7,5

0,139

0,647

-0,189

10,0

0,052

0,209

-0,680

15,0

0,068

0,316

-0,500

10,0

0,060

0,241

-0,618

15,0

0,068

0,316

-0,500

16,0

0,032

0,129

-0,891

22,5

0,055

0,256

-0,592

16,0

0,032

0,129

-0,891

22,5

0,053

0,247

-0,608

22,0

0,024

0,096

-1,016

30,0

0,042

0,195

-0,709

30,0

0,042

0,195

-0,709

Temperatura 66,0°C

Temperatura 68,0°C

Czas (min)

log (

)

Czas (min)

log (

)

0,0

0,249

1,000

0,000

0,0

0,226

1,000

0,000

2,0

0,144

0,578

-0,238

1,5

0,118

0,522

-0,282

4,0

0,089

0,357

-0,447

3,0

0,067

0,296

-0,528

4,0

0,100

0,402

-0,396

3,0

0,077

0,341

-0,468

8,0

0,038

0,153

-0,816

4,5

0,048

0,212

-0,673

8,0

0,040

0,161

-0,794

6,0

0,032

0,142

-0,849

12,0

0,027

0,108

-0,965

6,0

0,034

0,150

-0,823

146

Aneks

Tabela 10.34. Kinetyka inaktywacji cieplnej

-amylazy w roztworze

buforowym

20 mM Bis-Tris z dodatkiem 200 mg/cm

sacharozy w temperaturach 62-

68°C

Temperatura 62,0°C

Temperatura 64,0°C

Czas (min)

log (

)

Czas (min)

log (

)

0,0

0,198

1,000

0,000

0,0

0,222

1,000

0,000

30,0

0,118

0,596

-0,225

15,0

0,102

0,460

-0,337

30,0

0,123

0,621

-0,207

34,0

0,046

0,208

-0,683

60,0

0,075

0,379

-0,422

34,0

0,046

0,208

-0,683

60,0

0,080

0,404

-0,394

45,0

0,029

0,131

-0,883

90,0

0,054

0,273

-0,564

25,0

0,063

0,284

-0,546

90,0

0,057

0,288

-0,541

25,0

0,063

0,284

-0,546

120,0

0,036

0,182

-0,740

120,0

0,036

0,182

-0,740

Temperatura 66,0°C

Temperatura 68,0°C

Czas (min)

log (

)

Czas (min)

log (

)

0,0

0,222

1,000

0,000

0,0

0,210

1,000

0,000

10,0

0,077

0,348

-0,459

1,0

0,167

0,795

-0,100

10,0

0,085

0,384

-0,416

1,0

0,166

0,790

-0,102

20,0

0,032

0,144

-0,840

2,5

0,122

0,581

-0,236

20,0

0,035

0,158

-0,801

2,5

0,126

0,600

-0,222

25,0

0,023

0,104

-0,984

7,5

0,054

0,257

-0,590

5,0

0,124

0,560

-0,252

7,5

0,056

0,267

-0,574

11,0

0,033

0,157

-0,804

11,0

0,035

0,167

-0,778

147

Document Outline