1
Fotometryczne oznaczanie zawarto
ś
ci białka
Zajęcia 3 godzinne – część A, zajęcia 4 godzinne – część A i B.
Cel
ć
wiczenia
Celem ćwiczenia jest poznanie zasad, na których oparte są najczęściej stosowane
metody oznaczania białka związane z cechami jego budowy. Celem równoległym jest
zapoznanie się, na przykładzie metody Lowry’ego i współpracowników oraz metody
spektrofotometrycznej z często wykonywaną fotometryczną analizą ilościową białka w
badaniach biochemicznych.
Wprowadzenie
Metody oznaczania zawartości białka oparte są na charakterystycznych cechach jego
budowy. Najczęściej wykorzystywane są następujące cechy białek:
1.
obecność reszt aminokwasów aromatycznych (fenyloalaniny, tyrozyny, tryptofanu) w
składzie aminokwasowym,
2.
występowanie wiązań peptydowych,
3.
występowanie reszt aminokwasów zasadowych (argininy, lizyny, histydyny)
Metody fotometryczne oznaczania białka
W
metodach
fotometrycznych
wykorzystuje
się
zjawisko
pochłaniania
promieniowania elektromagnetycznego przez różne substancje. Pomiar absorpcji światła przy
określonej częstotliwości drgań (długości fali) może być miarą ilości substancji
pochłaniającej promieniowanie i jest podstawą fotometrycznej analizy ilościowej.
Do oznaczeń wykorzystuje się widmo określonych związków lub barwnych
produktów powstałych w wyniku reakcji chemicznych, które można mierzyć metodami
spektrofotometrycznymi i kolorymetrycznymi. Zdolność pochłaniania promieniowania
elektromagnetycznego określonej częstotliwości przez daną substancję zależy od jej struktury,
a zwłaszcza od występowania i rozmieszczenia wiązań nienasyconych (głównie podwójnych).
Substancje barwne pochłaniają fale świetlne w zakresie widma widzialnego (340–800 nm) o
barwie dopełniającej do tej, która jest dostrzegana przez oko ludzkie, np. barwa czerwona jest
dopełniająca do niebieskiej, fioletowa do żółtej, a zielona do pomarańczowej.
Stopień pochłaniania światła (wygaszenie), którego miarą jest absorbancja jest
proporcjonalny do stężenia substancji pochłaniającej, a zależność ta jest tym bardziej ścisła,
im mniejsza jest rozpiętość długości fali w wiązce światła padającego (światło
monochromatyczne). Do uzyskania wiązki światła monochromatycznego używa się pryzmaty
kwarcowe lub siatki dyfrakcyjne. Ilościowe metody fotometryczne oparte są na prawie
Lamberta-Beera, zgodnie z którym absorbancja (A) zależy od logarytmu dziesiętnego ilorazu
natężenia światła spolaryzowanego, które pada na badany roztwór (I
o
) do natężenia światła
które po przejściu przez roztwór nie zostało pochłonięte (I). Wyrażając to w inny sposób
absorbancja zależy od stężenia molowego mierzonej substancji – (c), grubości warstwy
roztworu przez który przechodzi wiązka światła – (d) i od molowego współczynnika absorpcji
– (
εεεε
).
A = log (I
o
/I) =
εεεε
c d
Grubość warstwy roztworu (d) wynosi zazwyczaj 1 cm, a pomiary dokonywane są w
kuwetach z kwarcu, szkła lub tworzywa sztucznego. Kuwety różnią się przepuszczalnością
dla światła monochromatycznego o różnej długości fali, np. kuwety kwarcowe należy używać
2
w zakresie długości fali 190-320 nm. Molowy współczynnik absorpcji –
εεεε
jest
charakterystyczny dla mierzonej substancji, w sposób doświadczalny wyznaczany jest dla 1
molowego stężenia substancji, przy grubości warstwy roztworu d = 1cm. Współczynnik ten
zależy od budowy analizowanej substancji (obecność pierścieni aromatycznych, pierścieni
heterocyklicznych, wiązań podwójnych itp.), można go wykorzystywać do pomiaru stężeń
mierzonych substancji, gdy mamy do czynienia homogennymi roztworami analizowanej
substancji. Częściej zamiast stosowania molowego współczynnika absorpcji wygodniej jest
wykreślić tzw. krzywą wzorcową dla oznaczanej substancji. Sporządza się ją odkładając na
osi rzędnych wartość absorbancji kilku różnych znanych stężeń badanego związku, z kolei na
osi odciętych odpowiednie wartości stężeń mierzonej substancji. Ilości analizowanej
substancji powinny być tak dobrane, aby wykres zależności absorbancji od stężenia substancji
był linią prostą, dodatkowo wykres powinien przechodzić przez początek układu
współrzędnych (rys. 1).
A.
Kolorymetryczne metody oznaczania zawartości białka.
Metoda Lowry’ego i współpracowników. Bardzo popularnym sposobem oznaczania
ilości białka jest metoda Lowry'ego i współpracowników (1951), która stanowi temat
ć
wiczenia. W metodzie tej wykorzystuje się dwie cechy budowy białek: obecność wiązań
peptydowych oraz obecność aminokwasów aromatycznych. Metoda ta składa się z 2 etapów,
w pierwszym zachodzi reakcja biuretowa (tworzenie barwnych kompleksów przez wiązania
peptydowe i Cu
2+
oraz redukcja jonów miedzi Cu
2+
do Cu
+
w środowisku zasadowym). W
drugim etapie metody jony miedzi Cu
+
katalizują reakcję utlenienia przebiegającą głównie z
udziałem tyrozyny i tryptofanu redukując odczynnik Folina-Ciocalteu, czyli kwasy:
fosforomolibdenowy i fosforowolframowy do odpowiednich niebieskich tlenków. Stężenie
barwnego kompleksu można mierzyć przy długości fali w zakresie od 500 do 750 nm.
Podobnie jak w innych metodach kolorymetrycznych stężenie białka odczytuje się najczęściej
z krzywej wzorcowej. Przy tym dla uzyskania właściwych wyników niezmiernie ważny jest
dobór białka wzorcowego do sporządzania tej krzywej. Powinno ono zawierać w cząsteczce
zbliżone ilości tyrozyny i tryptofanu w stosunku do badanego białka. Zaletą metody jest jej
znaczna czułość. Można stosować ją bowiem do oznaczenia ilość białka już od 10 µg w
próbie, a zależność proporcjonalną między intensywnością zabarwienia roztworu, a stężeniem
białka obserwuje się nawet przy większych stężeniach – do 1000 µg. Wadą metody jest błąd
oznaczenia wynikający z trudności doboru odpowiedniego białka wzorcowego w odniesieniu
do białka oznaczanego (np. trypsyna daje 3 razy większe natężenie barwy niż żelatyna, przy
tych samych stężeniach wagowych). Inną wadą metody Lowry’ego jest zawyżanie wyników
oznaczania w wyciągach niedializowanych z powodu redukcji odczynnika Folina-Ciocalteu
przez wolne aminokwasy, niewielkie peptydy, fenole, nitrofenole, w mniejszym stopniu przez
puryny i pirymidyny, kwas moczowy, związki zawierające mostki disiarczkowe oraz niektóre
detergenty. Z kolei związki takie jak: Zn
2+
, Mg
2+
, (NH
4
)
2
SO
4
, CCl
3
COOH, HClO
4
, aceton,
etanol, węglowodany, zależnie od stężenia obniżają intensywność barwy kompleksu.
Odczynniki.
1. Odczynnik miedziowy: a) 2-proc. roztwór węglanu sodowego w 0,1-molowym
wodorotlenku sodowym, b) 2-proc. wodny roztwór winianu sodowo-potasowego, c) 1-proc.
wodny roztwór CuSO
4
⋅
5 H
2
O; przed użyciem w cylindrze miarowym na 100 ml zmieszać 98
ml roztworu a) z 1 ml roztworu b) i 1 ml roztworu c).
2. Odczynnik Folina, powszechnie dostępny w handlu, należy 2 razy rozcieńczyć
przed użyciem
3
3. Wzorcowe roztwory albuminy wołowej (BSA) o stężeniach 20, 40, 80, 140 i 200
µ
g/ml.
4. Rozcieńczony roztwór albuminy wołowej (BSA) jako zadanie kontrolne.
Wykonanie.
Sporządzanie krzywej wzorcowej do oznaczenia zawartości białka metodą Lowry’ego i wsp.
Do probówek odmierzyć w 2 powtórzeniach po 0,5 ml z 5 kolejnych roztworów wzorcowych
białka (3), a do próby kontrolnej zamiast białka odmierzyć 0,5 ml wody. Do wszystkich
probówek dodać po 2,5 ml odczynnika miedziowego (1), wymieszać i po 10 min dodać po
0,25 ml odczynnika Folina (2) i całość natychmiast wymieszać używając mikrowytrząsarki
do probówek. Po 30 min (jednak nie dłużej niż po 60 minutach) zmierzyć intensywność
zabarwienia w fotometrze (przy 750 nm) nastawiając przyrząd na zero wobec próby
kontrolnej. Na podstawie uzyskanych wartości absorbancji (A) wykreślić krzywą zależności
absorbancji od stężenia białka w próbie.
Rys. 1 Przykładowa krzywa wzorcowa opisująca zależność absorbancji od
stężenia białka.
Oznaczanie zawartości białka w badanym roztworze metodą Lowry’ego i wsp.
Roztwór białka otrzymany w kolbce miarowej na 10 ml należy dopełnić do kreski wodą
destylowaną i dokładnie wymieszać. Do 2 probówek odmierzyć po 0,5 ml roztworu z kolbki,
do 1 próbówki odmierzyć 0,5 ml H
2
O destylowanej (próba kontrolna) i dalej postępować jak
przy sporządzaniu krzywej wzorcowej.
Przykładowe obliczenia.
Absorbancja
1
Absorbancja
2
Ś
rednia
absorbancja
Ilość białka w
µ
g odczytana z krzywej
wzorcowej dla średniej absorbancji
0,216
0,224
0,220
126
Ś
rednia absorbancja 0,220
W 0,5 ml próby znajduje się 126
µ
g białka
W 10 ml , (w kolbce) – 2520
µ
g białka (126
µ
g x 20)
Do kolbki, przed dopełnieniem jej wodą do objętości 10 ml wlano np. 3 ml analizowanego
roztworu albuminy technicznej (wartość tą poda prowadzący ćwiczenie, po zanotowaniu
absorbancji średniej dla wydanego zadania kontrolnego).
A
b
s
o
rb
a
n
c
ja
St
ęż
enie białka [
µ
g/ml]
4
w 3 ml roztworu albuminy technicznej było 2520
µµµµ
g białka, zatem w 1000 ml:
2520
µµµµ
g białka x 1000/3 =840000
µµµµ
g białka, czyli 840,0 mg albuminy, co odpowiada
obliczonej zawartości białka w roztworze albuminy technicznej.
W 1000 ml rozpuszczono 850 mg albuminy technicznej, zatem
850 mg – 100%
840 mg – x%
Obliczony procent czystości albuminy, w jej preparacie handlowym wynosi 98,8% czystego
białka.
Inne kolorymetryczne metody oznaczania zawartości białka.
Metoda z zastosowaniem kwasu bicynchoninowego (BCA). Podobnie jak i w metodzie
Lowry’ego i wsp., również i w tym przypadku jony Cu
2+
ulegają redukcji w środowisku
zasadowym do jonów Cu
+
. Odpowiadają za to wiązania peptydowe w białku, reszty cysteiny,
cystyny, tryptofanu oraz tyrozyny, następnie powstałe jony Cu
+
reagują z BCA, tworząc
barwny kompleks (Smith i współautorzy, 1985). Czułość tej metody jest podobna do metody
Lowry’ego i wsp.. Zaletą jest to, że przebiega jednoetapowo, a produkt reakcji przyjmuje
intensywne czerwone zabarwienie, które można mierzyć prze długości fali 562 nm. Istotne
dla tej metody jest przeprowadzenie reakcji w temperaturze 37ºC lub 60ºC, co powoduje
zwiększenie czułości metody w porównaniu do reakcji prowadzonej w temperaturze
pokojowej. Metodę tę można z powodzeniem stosować w obecności detergentów, mocznika,
chlorku guanidyny, które „przeszkadzają” w metodzie Lowry’ego i wsp.. Wadą tej metody
jest to, że duże stężenie cukrów redukujących utrudnia prawidłowe oznaczenie stężenia
białka.
Metoda Bradford, z zastosowaniem błękitu Coomassie. Jest to prostsza, czulsza (od 1 µg
białka w próbie) i szybsza metoda niż metoda Lowry’ego i wsp.. Polega na reakcji reszt
aminokwasowych argininy, lizyny oraz w mniejszym stopniu histydyny i aminokwasów
aromatycznych (tryptofan, tyrozyna, fenyloalanina) w białkach z formą anionową błękitu
Coomassie G-250 (Bradford 1976). Intensywność zabarwienia kompleksu białko – barwnik
mierzy się przy długości fali 595 nm bezpośrednio po wykonaniu reakcji. W warunkach
standardowych w tej metodzie barwnik nie wiąże się z wolnymi aminokwasami (argininą i
lizyną) oraz z peptydami o masie cząsteczkowej niższej niż 3000 Da. Wadą tej metody jest
duża zmienność absorbancji (A
595
) dla różnych rodzajów białek, przy identycznych stężeniach
wagowych tych białek. Wynika to ze niejednakowego składu aminokwasowego białek, co ma
wpływ na intensywność barwnego kompleksu powstającego w tej reakcji. Inną wadą jest
zawyżanie wyników przez detergenty, polifenole, amfolity, oraz zasady obecne w środowisku
reakcji. Z kolei związki takie jak chlorowodorek guanidyny, askorbinian sodu, konkurując z
barwnikiem o białko obniżają intensywność barwy kompleksu.
B.
Spektrofotometryczna metoda oznaczania białka.
W tej metodzie wykorzystuje się spektrofotometryczny pomiar absorpcji promieni UV
o długości 280 nm oraz 260 nm przechodzących przez badany roztwór białka (Layne 1957).
Do pomiarów należy używać odpowiednich kuwet (kwarcowych lub z tworzywa sztucznego
przepuszczającego promieniowanie UV). Większość związków aromatycznych ma zdolność
pochłaniania światła nadfioletowego o długości fali 280 nm. W składzie aminokwasowym
białek występują 3 aminokwasy aromatyczne: tyrozyna i tryptofan, które pochłaniają światło
głównie przy długości fali 280 nm, oraz fenyloalanina, która najsilniej absorbuje światło przy
260 nm. Wadą tej metody jest duża zmienność absorbancji dla różnych rodzajów białek,
wynikająca z niejednakowej procentowej zawartości aminokwasów. Inną wadą metody
5
spektrofotometrycznej jest możliwość zawyżenia odczytu przez kwasy nukleinowe obecne w
próbie, w szczególności w homogenatach po dezintegracji komórek. Stosując tę metodę
można oznaczyć zawartość białka od 10 µg. Zaletą metody jest jej prostota i szybkość
pomiaru, co ma szczególne znaczenie w preparatyce enzymatycznej, często wykonuje się
pomiar tylko przy jednej długości fali. Do wyliczenia przybliżonego stężenia białka w
analizowanej próbie można użyć prostego równania:
Białko (mg/ml) = 1,55 x A
280
– 0,76 x A
260
W pomiarach bardziej dokładnych oraz do oznaczeń stężeń białka w homogenatach
należy stosować metody kolorymetryczne opisane powyżej w zależności od rodzaju materiału
biologicznego i dostępności białka wzorcowego, a nie metodę spektrofotometryczną, która
jest wprawdzie metodą szybką, ale i obarczoną dużym błędem pomiaru.
Odczynniki.
Rozcieńczony roztwór albuminy wołowej (BSA) jako zadanie kontrolne.
Wykonanie.
Oznaczanie zawartości białka w badanym roztworze. Do odpowiedniej kuwety (kwarcowej
lub z tworzywa sztucznego przepuszczającej promieniowanie UV) odmierzyć najpierw wody
destylowanej, wyzerować spektrofotometr przy długości fali 280 nm, następnie zmierzyć
absorbancję dla otrzymanego roztworu białka. Pomiar powtórzyć po wyzerowaniu
spektrofotometru przy długości fali 260 nm. Zmierzone absorbancje nie powinny przekroczyć
wartości 1,000. W przeciwnym wypadku konieczne jest odpowiednie rozcieńczenie
mierzonego roztworu białka wodą. Otrzymany wynik wstawić do odpowiedniego równania,
wyliczyć stężenie białka w mg/ml, a uwzględniając schemat rozcieńczeń obliczyć zawartość
białka w otrzymanym do analizy roztworze.
Przykładowe obliczenia.
Absorbancja 280 nm
Absorbancja 260 nm
0,316
0,324
Białko (mg/ml) = 1,55 x 0,316 – 0,76 x 0,324= 0,490 – 0,246= 0,244
W 1 ml próby znajduje się 244
µ
g białka
W 10 ml , (w kolbce) – 2440
µ
g białka
Do kolbki, przed dopełnieniem jej wodą do objętości 10 ml wlano np. 3 ml analizowanego
roztworu albuminy technicznej (wartość tą poda prowadzący ćwiczenie, po zanotowaniu
absorbancji średniej dla zadania kontrolnego).
w 3 ml roztworu albuminy technicznej było 2440
µµµµ
g białka, zatem w 1000 ml:
2440
µµµµ
g białka x 1000/3 =813333
µµµµ
g białka, czyli 813,3 mg albuminy, co odpowiada
obliczonej zawartości białka w roztworze albuminy technicznej.
W 1000 ml rozpuszczono 850 mg albuminy technicznej, zatem
850 mg – 100%
813,3 mg – x%
Obliczony procent czystości albuminy, w jej preparacie handlowym wynosi 95,7% czystego
białka.
6
Opracowanie wyników.
Studenci wykonują krzywą wzorcową na papierze milimetrowym lub korzystając z
programu komputerowego, nanosząc na wykres średnią z 2 pomiarów dla każdego stężenia
białka. Niezależnie w sprawozdaniu należy podać odczyty absorbancji obu powtórzeń dla
badanego roztworu białka oraz wyliczoną wartość średnią. Przy oznaczaniu zawartości białka
należy z wartości absorbancji odczytać na krzywej wzorcowej stężenie białka, a następnie na
podstawie proporcji w całej próbie obliczyć procentową zawartość białka w badanym
materiale. Sposób przygotowania roztworu z tego materiału podany będzie przez
prowadzącego ćwiczenia.
Po wykonaniu ćwiczenia 1 i 2 należy porównać uzyskane wyniki pomiarów metodami
Lowry’ego i wsp. oraz spektrofotometryczną, a jeśli wystąpiły różnice, uzasadnić ich
przyczynę.
Pytania:
1.
Wymienić cechy budowy białek, które są wykorzystywane przy ich ilościowym
oznaczaniu.
2.
Scharakteryzować zasady, na których opierają się poszczególne metody oznaczania
zawartości białka.
3.
Określić przydatność poszczególnych metod w ilościowym oznaczaniu białek.
4.
Dlaczego przy oznaczaniu białka metodą spektrofotometryczną lub kolorymetryczną
konieczne jest podanie rodzaju białka użytego do wyznaczania współczynników
przeliczeniowych lub sporządzenia krzywej wzorcowej?
5.
Obliczyć, jakiemu stężeniu związku odpowiada wartość absorbancji (A) = 0,1, jeżeli
molowy współczynnik absorbancji wynosi 7
⋅
10
6
.
6.
Dlaczego w metodach fotometrycznych dokładność oznaczenia zależy między innymi
od czystości padającej wiązki światła, jak się tę czystość osiąga?
7.
Omów zasadę poznanej na ćwiczeniach metody ilościowego oznaczania zawartości
białka. Jaką zależność przedstawiała sporządzona na ćwiczeniach krzywa wzorcowa?
Literatura:
1.
Bradford, M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of
protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.
2.
Layne, E. (1957). Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. Methods in
Enzymology 3: 447-455.
3.
Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., and Randall, R. J. (1951). Protein measurement with
the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275.
4.
Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D.,
Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J., and Klenk, D.C. (1985). Measurement of protein using
bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150:76-85.