OZNACZENIE ZAWARTOŚCI BIAŁKA W PRODUKTACH ŻYWNOŚCIOWYCH

Białko

jest podstawowym materiałem

budulcowym i należy do najważniejszych

ze składników pokarmowych. Posiada

ona złożoną strukturę chemiczna: składa

się aminokwasów, które z kolei

zbudowane są z atomów węgla, tlenu,

azotu, wodoru oraz siarki. Pod względem

chemicznym białka są związkami, które

zawierają 50 - 55% węgla, 19 - 24%

tlenu, 12 - 19% azotu, 6 - 7,3% wodoru i

do 4% siarki. Niektóre białka zawierają

jeszcze: P, Ca, Fe, Cu, I, Zn, Mg, Mn i Co.

Wszystkie aminokwasy połączone są

wiązaniami peptydowymi, podstawową ich

strukturę stanowi szkielet węglowy, który

związany jest atomem wodoru (H), grupą

aminową (NH2), grupa karboksylową

(COOH) oraz łańcuchem bocznym.

Łańcuch boczny może stanowić grupa

metylowa CH3 lub rodnik R - (alifatyczny

lub aromatyczny).

Zależnie od pochodzenia białek dzielimy je

ogólnie na roślinne i zwierzęce.

Ze względu na budowę chemiczną

białka dzielimy na:

proste (proteiny)

złożone z

aminokwasów

złożone (proteidy)

oprócz

aminokwasów zawierają części

niebiałkowe, tzw. grupy prostetyczne

(np. barwnik, węglowodany, kwas

fosforowy, kwas nukleinowe).

Białka proste to:

lbuminy,

globuliny, gluteliny, prolaminy,

skleroproteiny (histony,

protaminy).

Białka złożone to:

chromoproteidy,

glikoproteidy, fosfoproteidy,

lipoproteidy, metaloproteidy,

nukleoproteidy

Zawartość białka w produktach spożywczych jest

jednym czynników określających ich wartość

odżywczą. Ilość tego składnika w surowcach

stosowanych produkcji żywności decyduje także o

prawidłowym przebiegu procesu produkcyjnego

oraz o jakości produktu. jako że w większości

białek azot stanowi około 16% ich masy, na tej

podstawie wyliczona mnożnik 6,25 (100% białka

16% azotu = 6,25), który umożliwia przeliczenie

otrzymanego w badanej próbie ilości azotu na

zawartość białka. W przypadku białek

zawierających różną od 16% ilość azotu

(szczególnie pochodzenia roślinnego)

współczynnik należy wyznaczać doświadczalnie

lub posłużyć się istniejącymi tabelami

współczynników indywidualnych (tab.).

Tab.

Przykładowe współczynniki przeliczeniowe azotu na

białko

Produkty

Współczynnik przeliczeniowy

Kasza gryczana

6,31

Kasza jęczmienna

5,83

Kasza manna

5,70

Makaron jajeczny

5,70

Płatki owsiane

5,83

Ryż

5,95

Groch (całe ziarno)

6,25

Soja

5,71

Fasola

6,00

Warzywa,owoce

6,25

W analizie żywności najczęściej

używane są następujące określenia

białka:

1)białko strawne = (azot ogółem - azot

nierozpuszczalny po trawieniu pepsyny) x

mnożnik białkowy

2)białko surowe = azot ogółem x mnożnik

białkowy

3)białko czyste = azot białkowy x mnożnik

białkowy

Do oznaczenia zawartości białka w

produktach stosowane są dwie grupy

metod:

A) Bezpośrednie:

1)biuretowe

2)Lovry'ego

3)oparta na wbudowaniu barwników

4)immunoenzymatyczna (ELISA)

5)formolowa

6)spektrofotometrii z zakresie nadfioletu

7)oparta na zjawisku selektywnego pochłaniania

promieniowania w zakresie podczerwieni

B) Pośrednie:

1)Kjeldahla

2)Dumasa

A-1)

METODA BIURETOWA

- polega

na oznaczeniu białek i peptydów

(zawierających co najmniej dwa

wiązania peptydowe, które tworzą w

środowisku alkalicznym barwne

kompleksy z jonami Cu

). Natężenie

zabarwienia powstałego kompleksu

(fiołkowe) jest proporcjonalne do

stężenia białka. Pomiaru absorbancji

dokonuje się przy długości fali λ = 540

nm. Metoda ta pozwala na oznaczenie

zawartości białka do 4%.

A-2)

METODA LOVRY'EGO

- polega na

pomiarze absorbancji (przy długości fali

przekraczającej λ = 750 nm) barwnego

kompleksu, powstałego w wyniku dwóch

reakcji. Pierwszej biuretowej - polegającej na

połączeniu dwóch jonów miedzi (Cu

) do

wiązań peptydowych i drugiej - polegającej

na redukcji odczynnika fosforomolibdeno -

fosforowolframowego (odczynnik Folina -

Ciocialteu) przez tyrozynę i tryptofan, obecne

w białku. Metodę tę można stosować w

roztworach niezawierających fenoli. Ze

względu na dużą czułość metody stosuje się

ją w próbach zawierających znikome ilości

białka (0,5 - 1,0 mg%).

A-3)

METODA OPARTA NA WBUDOWYWANIU

BARWNIKÓW

- polega na ilościowych

wbudowywaniu do białek barwników organicznych

dodanych w nadmiarze ( oranż G, czerń amidowa

10B, Comomassie Blue B-250). Białko i barwnik w

warunkach poniżej punktu izoelektrycznego białka

tworzą nierozpuszczalne kompleksy, które można

wydzielić przez odwirowanie lub sączenie.

Następnie wykonywany jest pomiar natężenia

barwy roztworu, która uzależniona jest od ilości

barwnika niezwiązanego białkiem (zależność

odwrotnie proporcjonalna do ilości białka w

próbie).

A-4)

METODA

IMMUNOENZYMATYCZNA (ELISA

)

polega na tworzeniu połączeń

pomiędzy specyficznym przeciwciałem,

białkiem i odpowiedni enzymem, co

powoduje powstawanie barwnego

kompleksu. Natężenie barwy oznacza

się spektrofotometrycznie przez

porównanie z roztworem wzorcowym.

oznaczenie to umożliwia określenie

zawartości białka i stopnia ich

denaturacji.

A-5)

METODA SORENSENA

(MIARECZKOWANIA FORMYLOWEGO)

polega na zablokowaniu aldehydów

mrówkowych grup aminowych aminokwasów,

w wyniku czego tracą one swoje właściwości.

kolejno następuje odblokowanie grup

karboksylowych, które miareczkuje się

mianowanym roztworem wodorotlenku sodu.

liczba uwolnionych grup karboksylowych jest

równoważna liczbie związanych

formaldehydem grup aminowych.

A-6)

METODA

SPEKTROFOTOMETRII W

ZAKRESIE NADFIOLETU

polega na pomiarze absorbancji,

jaką wykazują aminokwasy

aromatyczne: fenyloalanina,

tryptofan, tyrozyna.

A-7)

METODA OPARTA NA

ZJAWISKU SELEKTYWNEGO

POCHŁANIANIA

PROMIENIOWANIA W

ZAKRESIE PODCZERWIENI

polega na wykorzystaniu

selektywnego pochłaniania

promieniowania w tym zakresie.

B-1)

METODA KJEDAHLA

- metoda

odwoławcza oznaczania azotu ogólnego.

Substancje organiczne zawierające azot

podczas gotowania ze stężonym H2SO4 są

utlenione (azot wydzielony w postaci amoniaku,

tworzy w środowisku kwasu siarczan (VI)

amonu). Amoniak wiązany jest w nadmiarze

kwasu borowego, a następnie jest on

miareczkowany mianowanym roztworem kwasu

solnego (przy zastosowaniu kwasu borowego)

lub wodorotlenku sodu (przy zastosowaniu

kwasu solnego lub kwasu siarkowego (VI).

Reakcja ta przebiega w III etapach:

a) mineralizacji próbki

b) destylacji amoniaku (NH3) z para

wodną

c) miareczkowania

MINERALIACJA:

1.Rozkład kwasu siarkowego (VI) uwolnieniem

tlenu:

2H2SO4

(temp.)

2SO2 + O2 + 2H2O

2.Następuje utlenienie substancji organicznych (z

uwolnieniem dwutlenku węgla, wody i amoniaku):

COOH

R-CH + O2 = x CO2↑ + y H2O + z NH3↑

NH2

3.Przechodzenie amoniaku w siarczan (VI) amonu:

2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4

DESTYLACJA AMONIAKU:

1.Alkalizacja środowiska z wydzielaniem

amoniaku:

(NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O

2.Destylacja amoniaku i jego związanie w

roztworze kwasu borowego:

NH3 + H3BO3 → NH4H2BO3

MIARECZKOWANIE

–

przy użyciu mianowanego HCl lub

H2SO4:

2NH4H2BO3 + H2SO4 →

(NH4)2SO4 + 2H3BO3 lub NH4H2BO3 +

HCl → NH4Cl + H3BO3

Reakcja pomiędzy amoniakiem i

kwasem siarkowym(VI) lub kwasem

solnym:

2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4

NH3 + HCl → NH3Cl

Z równania tego wynika, że:

1mol H2SO4 + 2mole N + 28g azotu

1mol HCl + 1mol N + 14g azotu

określenie miana roztworu HCl wglądem azotu:

1cm3 H2SO4 (o stężeniu 0,1mol × dm-3) =

0,0028g N

1cm3 HCl (o stężeniu 0,1mol × dm-3) = 0,0014g

Z ilości cm

roztworu HCL użytego do

miareczkowania wyliczana jest ilość azotu

w próbie. Metodą Kjeldahla oznaczyć

można: jony amonowe oraz związki

zawierające grupy amidowe, aminowe lub

iminowe (nie oznacza się azotanów(III) i

(V).

Zawartość azotu w analizowanej próbie =

około 0,02g (→ co odpowiada naważce od

0,5 do 1,5 g badanego produktu).

B-2)

DUMASA

- polega na suchej

pirolizie substancji w strumieniu

ditlenku węgla lub jego

mieszaniny z tlenem.

Document Outline