OZNACZENIE ZAWARTOŚCI

OZNACZENIE ZAWARTOŚCI

BIAŁKA W PRODUKTACH

BIAŁKA W PRODUKTACH

ŻYWNOŚCIOWYCH

ŻYWNOŚCIOWYCH

Białko

Białko

-

-

jest podstawowym materiałem

jest podstawowym materiałem

budulcowym i należy do najważniejszych

budulcowym i należy do najważniejszych

ze składników pokarmowych. Posiada

ze składników pokarmowych. Posiada

ona złożoną strukturę chemiczna: składa

ona złożoną strukturę chemiczna: składa

się aminokwasów, które z kolei

się aminokwasów, które z kolei

zbudowane są z atomów węgla, tlenu,

zbudowane są z atomów węgla, tlenu,

azotu, wodoru oraz siarki. Pod względem

azotu, wodoru oraz siarki. Pod względem

chemicznym białka są związkami, które

chemicznym białka są związkami, które

zawierają 50 - 55% węgla, 19 - 24%

zawierają 50 - 55% węgla, 19 - 24%

tlenu, 12 - 19% azotu, 6 - 7,3% wodoru i

tlenu, 12 - 19% azotu, 6 - 7,3% wodoru i

do 4% siarki. Niektóre białka zawierają

do 4% siarki. Niektóre białka zawierają

jeszcze: P, Ca, Fe, Cu, I, Zn, Mg, Mn i Co.

jeszcze: P, Ca, Fe, Cu, I, Zn, Mg, Mn i Co.

Wszystkie aminokwasy połączone są

Wszystkie aminokwasy połączone są

wiązaniami peptydowymi, podstawową ich

wiązaniami peptydowymi, podstawową ich

strukturę stanowi szkielet węglowy, który

strukturę stanowi szkielet węglowy, który

związany jest atomem wodoru (H), grupą

związany jest atomem wodoru (H), grupą

aminową (NH2), grupa karboksylową

aminową (NH2), grupa karboksylową

(COOH) oraz łańcuchem bocznym.

(COOH) oraz łańcuchem bocznym.

Łańcuch boczny może stanowić grupa

Łańcuch boczny może stanowić grupa

metylowa CH3 lub rodnik R - (alifatyczny

metylowa CH3 lub rodnik R - (alifatyczny

lub aromatyczny).

lub aromatyczny).

Zależnie od pochodzenia białek dzielimy je

Zależnie od pochodzenia białek dzielimy je

ogólnie na roślinne i zwierzęce.

ogólnie na roślinne i zwierzęce.

Ze względu na budowę chemiczną

Ze względu na budowę chemiczną

białka dzielimy na:

białka dzielimy na:

1)

1)

proste (proteiny)

proste (proteiny)

,

,

złożone z

złożone z

aminokwasów

aminokwasów

2)

2)

złożone (proteidy)

złożone (proteidy)

,

,

oprócz

oprócz

aminokwasów zawierają części

aminokwasów zawierają części

niebiałkowe, tzw. grupy prostetyczne

niebiałkowe, tzw. grupy prostetyczne

(np. barwnik, węglowodany, kwas

(np. barwnik, węglowodany, kwas

fosforowy, kwas nukleinowe).

fosforowy, kwas nukleinowe).

Białka proste to:

Białka proste to:

a

a

lbuminy,

lbuminy,

globuliny, gluteliny, prolaminy,

globuliny, gluteliny, prolaminy,

skleroproteiny (histony,

skleroproteiny (histony,

protaminy).

protaminy).

Białka złożone to:

Białka złożone to:

chromoproteidy,

chromoproteidy,

glikoproteidy, fosfoproteidy,

glikoproteidy, fosfoproteidy,

lipoproteidy, metaloproteidy,

lipoproteidy, metaloproteidy,

nukleoproteidy

nukleoproteidy

.

.

Zawartość białka w produktach spożywczych jest

Zawartość białka w produktach spożywczych jest

jednym czynników określających ich wartość

jednym czynników określających ich wartość

odżywczą. Ilość tego składnika w surowcach

odżywczą. Ilość tego składnika w surowcach

stosowanych produkcji żywności decyduje także o

stosowanych produkcji żywności decyduje także o

prawidłowym przebiegu procesu produkcyjnego

prawidłowym przebiegu procesu produkcyjnego

oraz o jakości produktu. jako że w większości

oraz o jakości produktu. jako że w większości

białek azot stanowi około 16% ich masy, na tej

białek azot stanowi około 16% ich masy, na tej

podstawie wyliczona mnożnik 6,25 (100% białka

podstawie wyliczona mnożnik 6,25 (100% białka

16% azotu = 6,25), który umożliwia przeliczenie

16% azotu = 6,25), który umożliwia przeliczenie

otrzymanego w badanej próbie ilości azotu na

otrzymanego w badanej próbie ilości azotu na

zawartość białka. W przypadku białek

zawartość białka. W przypadku białek

zawierających różną od 16% ilość azotu

zawierających różną od 16% ilość azotu

(szczególnie pochodzenia roślinnego)

(szczególnie pochodzenia roślinnego)

współczynnik należy wyznaczać doświadczalnie

współczynnik należy wyznaczać doświadczalnie

lub posłużyć się istniejącymi tabelami

lub posłużyć się istniejącymi tabelami

współczynników indywidualnych (tab.).

współczynników indywidualnych (tab.).

Tab.

Tab.

Przykładowe współczynniki przeliczeniowe azotu na

Przykładowe współczynniki przeliczeniowe azotu na

białko

białko

Produkty

Produkty

Współczynnik przeliczeniowy

Współczynnik przeliczeniowy

Kasza gryczana

Kasza gryczana

6,31

6,31

Kasza jęczmienna

Kasza jęczmienna

5,83

5,83

Kasza manna

Kasza manna

5,70

5,70

Makaron jajeczny

Makaron jajeczny

5,70

5,70

Płatki owsiane

Płatki owsiane

5,83

5,83

Ryż

Ryż

5,95

5,95

Groch (całe ziarno)

Groch (całe ziarno)

6,25

6,25

Soja

Soja

5,71

5,71

Fasola

Fasola

6,00

6,00

Warzywa,owoce

Warzywa,owoce

6,25

6,25

W analizie żywności najczęściej

W analizie żywności najczęściej

używane są następujące określenia

używane są następujące określenia

białka:

białka:

1)białko strawne = (azot ogółem - azot

1)białko strawne = (azot ogółem - azot

nierozpuszczalny po trawieniu pepsyny) x

nierozpuszczalny po trawieniu pepsyny) x

mnożnik białkowy

mnożnik białkowy

2)białko surowe = azot ogółem x mnożnik

2)białko surowe = azot ogółem x mnożnik

białkowy

białkowy

3)białko czyste = azot białkowy x mnożnik

3)białko czyste = azot białkowy x mnożnik

białkowy

białkowy

Do oznaczenia zawartości białka w

Do oznaczenia zawartości białka w

produktach stosowane są dwie grupy

produktach stosowane są dwie grupy

metod:

metod:

A) Bezpośrednie:

A) Bezpośrednie:

1)biuretowe

1)biuretowe

2)Lovry'ego

2)Lovry'ego

3)oparta na wbudowaniu barwników

3)oparta na wbudowaniu barwników

4)immunoenzymatyczna (ELISA)

4)immunoenzymatyczna (ELISA)

5)formolowa

5)formolowa

6)spektrofotometrii z zakresie nadfioletu

6)spektrofotometrii z zakresie nadfioletu

7)oparta na zjawisku selektywnego pochłaniania

7)oparta na zjawisku selektywnego pochłaniania

promieniowania w zakresie podczerwieni

promieniowania w zakresie podczerwieni

B) Pośrednie:

B) Pośrednie:

1)Kjeldahla

1)Kjeldahla

2)Dumasa

2)Dumasa

A-1)

A-1)

METODA BIURETOWA

METODA BIURETOWA

- polega

- polega

na oznaczeniu białek i peptydów

na oznaczeniu białek i peptydów

(zawierających co najmniej dwa

(zawierających co najmniej dwa

wiązania peptydowe, które tworzą w

wiązania peptydowe, które tworzą w

środowisku alkalicznym barwne

środowisku alkalicznym barwne

kompleksy z jonami Cu

kompleksy z jonami Cu

+2

+2

). Natężenie

). Natężenie

zabarwienia powstałego kompleksu

zabarwienia powstałego kompleksu

(fiołkowe) jest proporcjonalne do

(fiołkowe) jest proporcjonalne do

stężenia białka. Pomiaru absorbancji

stężenia białka. Pomiaru absorbancji

dokonuje się przy długości fali λ = 540

dokonuje się przy długości fali λ = 540

nm. Metoda ta pozwala na oznaczenie

nm. Metoda ta pozwala na oznaczenie

zawartości białka do 4%.

zawartości białka do 4%.

A-2)

A-2)

METODA LOVRY'EGO

METODA LOVRY'EGO

- polega na

- polega na

pomiarze absorbancji (przy długości fali

pomiarze absorbancji (przy długości fali

przekraczającej λ = 750 nm) barwnego

przekraczającej λ = 750 nm) barwnego

kompleksu, powstałego w wyniku dwóch

kompleksu, powstałego w wyniku dwóch

reakcji. Pierwszej biuretowej - polegającej na

reakcji. Pierwszej biuretowej - polegającej na

połączeniu dwóch jonów miedzi (Cu

połączeniu dwóch jonów miedzi (Cu

+2

+2

) do

) do

wiązań peptydowych i drugiej - polegającej

wiązań peptydowych i drugiej - polegającej

na redukcji odczynnika fosforomolibdeno -

na redukcji odczynnika fosforomolibdeno -

fosforowolframowego (odczynnik Folina -

fosforowolframowego (odczynnik Folina -

Ciocialteu) przez tyrozynę i tryptofan, obecne

Ciocialteu) przez tyrozynę i tryptofan, obecne

w białku. Metodę tę można stosować w

w białku. Metodę tę można stosować w

roztworach niezawierających fenoli. Ze

roztworach niezawierających fenoli. Ze

względu na dużą czułość metody stosuje się

względu na dużą czułość metody stosuje się

ją w próbach zawierających znikome ilości

ją w próbach zawierających znikome ilości

białka (0,5 - 1,0 mg%).

białka (0,5 - 1,0 mg%).

A-3)

A-3)

METODA OPARTA NA WBUDOWYWANIU

METODA OPARTA NA WBUDOWYWANIU

BARWNIKÓW

BARWNIKÓW

- polega na ilościowych

- polega na ilościowych

wbudowywaniu do białek barwników organicznych

wbudowywaniu do białek barwników organicznych

dodanych w nadmiarze ( oranż G, czerń amidowa

dodanych w nadmiarze ( oranż G, czerń amidowa

10B, Comomassie Blue B-250). Białko i barwnik w

10B, Comomassie Blue B-250). Białko i barwnik w

warunkach poniżej punktu izoelektrycznego białka

warunkach poniżej punktu izoelektrycznego białka

tworzą nierozpuszczalne kompleksy, które można

tworzą nierozpuszczalne kompleksy, które można

wydzielić przez odwirowanie lub sączenie.

wydzielić przez odwirowanie lub sączenie.

Następnie wykonywany jest pomiar natężenia

Następnie wykonywany jest pomiar natężenia

barwy roztworu, która uzależniona jest od ilości

barwy roztworu, która uzależniona jest od ilości

barwnika niezwiązanego białkiem (zależność

barwnika niezwiązanego białkiem (zależność

odwrotnie proporcjonalna do ilości białka w

odwrotnie proporcjonalna do ilości białka w

próbie).

próbie).

A-4)

A-4)

METODA

METODA

IMMUNOENZYMATYCZNA (ELISA

IMMUNOENZYMATYCZNA (ELISA

)

)

-

-

polega na tworzeniu połączeń

polega na tworzeniu połączeń

pomiędzy specyficznym przeciwciałem,

pomiędzy specyficznym przeciwciałem,

białkiem i odpowiedni enzymem, co

białkiem i odpowiedni enzymem, co

powoduje powstawanie barwnego

powoduje powstawanie barwnego

kompleksu. Natężenie barwy oznacza

kompleksu. Natężenie barwy oznacza

się spektrofotometrycznie przez

się spektrofotometrycznie przez

porównanie z roztworem wzorcowym.

porównanie z roztworem wzorcowym.

oznaczenie to umożliwia określenie

oznaczenie to umożliwia określenie

zawartości białka i stopnia ich

zawartości białka i stopnia ich

denaturacji.

denaturacji.

A-5)

A-5)

METODA SORENSENA

METODA SORENSENA

(MIARECZKOWANIA FORMYLOWEGO)

(MIARECZKOWANIA FORMYLOWEGO)

-

-

polega na zablokowaniu aldehydów

polega na zablokowaniu aldehydów

mrówkowych grup aminowych aminokwasów,

mrówkowych grup aminowych aminokwasów,

w wyniku czego tracą one swoje właściwości.

w wyniku czego tracą one swoje właściwości.

kolejno następuje odblokowanie grup

kolejno następuje odblokowanie grup

karboksylowych, które miareczkuje się

karboksylowych, które miareczkuje się

mianowanym roztworem wodorotlenku sodu.

mianowanym roztworem wodorotlenku sodu.

liczba uwolnionych grup karboksylowych jest

liczba uwolnionych grup karboksylowych jest

równoważna liczbie związanych

równoważna liczbie związanych

formaldehydem grup aminowych.

formaldehydem grup aminowych.

A-6)

A-6)

METODA

METODA

SPEKTROFOTOMETRII W

SPEKTROFOTOMETRII W

ZAKRESIE NADFIOLETU

ZAKRESIE NADFIOLETU

-

-

polega na pomiarze absorbancji,

polega na pomiarze absorbancji,

jaką wykazują aminokwasy

jaką wykazują aminokwasy

aromatyczne: fenyloalanina,

aromatyczne: fenyloalanina,

tryptofan, tyrozyna.

tryptofan, tyrozyna.

A-7)

A-7)

METODA OPARTA NA

METODA OPARTA NA

ZJAWISKU SELEKTYWNEGO

ZJAWISKU SELEKTYWNEGO

POCHŁANIANIA

POCHŁANIANIA

PROMIENIOWANIA W

PROMIENIOWANIA W

ZAKRESIE PODCZERWIENI

ZAKRESIE PODCZERWIENI

-

-

polega na wykorzystaniu

polega na wykorzystaniu

selektywnego pochłaniania

selektywnego pochłaniania

promieniowania w tym zakresie.

promieniowania w tym zakresie.

B-1)

B-1)

METODA KJEDAHLA

METODA KJEDAHLA

- metoda

- metoda

odwoławcza oznaczania azotu ogólnego.

odwoławcza oznaczania azotu ogólnego.

Substancje organiczne zawierające azot

Substancje organiczne zawierające azot

podczas gotowania ze stężonym H2SO4 są

podczas gotowania ze stężonym H2SO4 są

utlenione (azot wydzielony w postaci amoniaku,

utlenione (azot wydzielony w postaci amoniaku,

tworzy w środowisku kwasu siarczan (VI)

tworzy w środowisku kwasu siarczan (VI)

amonu). Amoniak wiązany jest w nadmiarze

amonu). Amoniak wiązany jest w nadmiarze

kwasu borowego, a następnie jest on

kwasu borowego, a następnie jest on

miareczkowany mianowanym roztworem kwasu

miareczkowany mianowanym roztworem kwasu

solnego (przy zastosowaniu kwasu borowego)

solnego (przy zastosowaniu kwasu borowego)

lub wodorotlenku sodu (przy zastosowaniu

lub wodorotlenku sodu (przy zastosowaniu

kwasu solnego lub kwasu siarkowego (VI).

kwasu solnego lub kwasu siarkowego (VI).

Reakcja ta przebiega w III etapach:

Reakcja ta przebiega w III etapach:

a) mineralizacji próbki

a) mineralizacji próbki

b) destylacji amoniaku (NH3) z para

b) destylacji amoniaku (NH3) z para

wodną

wodną

c) miareczkowania

c) miareczkowania

MINERALIACJA:

MINERALIACJA:

1.Rozkład kwasu siarkowego (VI) uwolnieniem

1.Rozkład kwasu siarkowego (VI) uwolnieniem

tlenu:

tlenu:

2H2SO4

2H2SO4

(temp.)

(temp.)

2SO2 + O2 + 2H2O

2SO2 + O2 + 2H2O

2.Następuje utlenienie substancji organicznych (z

2.Następuje utlenienie substancji organicznych (z

uwolnieniem dwutlenku węgla, wody i amoniaku):

uwolnieniem dwutlenku węgla, wody i amoniaku):

COOH

COOH

R-CH + O2 = x CO2↑ + y H2O + z NH3↑

R-CH + O2 = x CO2↑ + y H2O + z NH3↑

NH2

NH2

3.Przechodzenie amoniaku w siarczan (VI) amonu:

3.Przechodzenie amoniaku w siarczan (VI) amonu:

2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4

2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4

DESTYLACJA AMONIAKU:

DESTYLACJA AMONIAKU:

1.Alkalizacja środowiska z wydzielaniem

1.Alkalizacja środowiska z wydzielaniem

amoniaku:

amoniaku:

(NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O

(NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O

2.Destylacja amoniaku i jego związanie w

2.Destylacja amoniaku i jego związanie w

roztworze kwasu borowego:

roztworze kwasu borowego:

NH3 + H3BO3 → NH4H2BO3

NH3 + H3BO3 → NH4H2BO3

MIARECZKOWANIE

MIARECZKOWANIE

–

–

przy użyciu mianowanego HCl lub

przy użyciu mianowanego HCl lub

H2SO4:

H2SO4:

2NH4H2BO3 + H2SO4 →

2NH4H2BO3 + H2SO4 →

(NH4)2SO4 + 2H3BO3 lub NH4H2BO3 +

(NH4)2SO4 + 2H3BO3 lub NH4H2BO3 +

HCl → NH4Cl + H3BO3

HCl → NH4Cl + H3BO3

Reakcja pomiędzy amoniakiem i

Reakcja pomiędzy amoniakiem i

kwasem siarkowym(VI) lub kwasem

kwasem siarkowym(VI) lub kwasem

solnym:

solnym:

2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4

2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4

NH3 + HCl → NH3Cl

NH3 + HCl → NH3Cl

Z równania tego wynika, że:

Z równania tego wynika, że:

1mol H2SO4 + 2mole N + 28g azotu

1mol H2SO4 + 2mole N + 28g azotu

1mol HCl + 1mol N + 14g azotu

1mol HCl + 1mol N + 14g azotu

określenie miana roztworu HCl wglądem azotu:

określenie miana roztworu HCl wglądem azotu:

1cm3 H2SO4 (o stężeniu 0,1mol × dm-3) =

1cm3 H2SO4 (o stężeniu 0,1mol × dm-3) =

0,0028g N

0,0028g N

1cm3 HCl (o stężeniu 0,1mol × dm-3) = 0,0014g

1cm3 HCl (o stężeniu 0,1mol × dm-3) = 0,0014g

N

N

Z ilości cm

Z ilości cm

3

3

roztworu HCL użytego do

roztworu HCL użytego do

miareczkowania wyliczana jest ilość azotu

miareczkowania wyliczana jest ilość azotu

w próbie. Metodą Kjeldahla oznaczyć

w próbie. Metodą Kjeldahla oznaczyć

można: jony amonowe oraz związki

można: jony amonowe oraz związki

zawierające grupy amidowe, aminowe lub

zawierające grupy amidowe, aminowe lub

iminowe (nie oznacza się azotanów(III) i

iminowe (nie oznacza się azotanów(III) i

(V).

(V).

Zawartość azotu w analizowanej próbie =

Zawartość azotu w analizowanej próbie =

około 0,02g (→ co odpowiada naważce od

około 0,02g (→ co odpowiada naważce od

0,5 do 1,5 g badanego produktu).

0,5 do 1,5 g badanego produktu).

B-2)

B-2)

DUMASA

DUMASA

- polega na suchej

- polega na suchej

pirolizie substancji w strumieniu

pirolizie substancji w strumieniu

ditlenku węgla lub jego

ditlenku węgla lub jego

mieszaniny z tlenem.

mieszaniny z tlenem.