Mikrobiologia przemysłowa ćw 12
BIOSYNTEZA KWASU CYTRYNOWEGO
Charakterystyka kw. cytrynowego:
-
trójkarboksylowy
-
M = 192 g
-
T topnienia = 150 st. C
-
Wyizolowany po raz pierwszy z cytryn (zawierają 7 – 9 % kwasu cytrynowego)
-
Produkowany w niewielkich ilościach przez wszystkie organizmy żywe (powstaje w
cyklu Krebsa = cyklu kwasu cytrynowego)
-
Posiada walory organoleptyczne – dobry smak, ładny zapach
-
80% produkcji kw. cytrynowego zużywana w przemyśle spożywczym
-
dobra rozpuszczalność w wodzie
-
mała toksyczność (może być dodawany do produktów spożywczych w
nielimitowanych ilościach)
-
produkcja głównie we Włoszech (z 40 kg cytryn – 1 kg kwasu)
-
jest to metabolit pierwotny!!!
Metody mikrobiologiczne – pierwszy raz zastosowane w Belgii, w latach 20 XX wieku
Metody chemiczne – są mało opłacalne finansowo. Zbyt złożony proces biosyntezy, mała
wydajność.
PRODUCENCI kw. cytrynowego (produkujący go w większej ilości niż zwyczajne
organizmy)
-
pewne gatunki pleśni, głównie z rodzaju Aspergillus (jako substrat : cukier)
o
Aspergillus niger
o
Aspergillus wenti
o
Penicillum luteum
o
Trichoderma viridae
-
Drożdże z rodzaju Candida
o
Candida tropicalis
o
Candida lipolytica
– badana potem przez Yarrowa – który odkrył szczep
zdplny do procesu płciowego i nazwał go Yarrowia lipolytica (jako substartu
wymaga n – alkanów lub n-parafin)
-
Bakterie z rodzaju Arthrobacter
Głównie wykorzystywany jest Asergillus niger. Dlaczego?
-
powszechny w przyrodzie, występuje w glebie, wodzie, na owocach
-
szczepy do produkcji łatwo pozyskać ze środowiska naturalnego
-
kwas cytrynowy – jest zw. pierwotnych, produkowanym w niewielkich ilościach
Pobieranie i przygotowanie:
-
izolacja
-
ulepszanie szczepu : dwie możliwości : (mutageneza lub rekombinacja)
o
aktywacja przez mutagenezę (metodami fizycznymi – UV, chemicznymi lub
kombinacja obu )
Mikrobiologia przemysłowa ćw 12
selekcja szczepu po działaniu czynnika mutagennego według
warunków, w jakich będziemy potem prowadzić hodowlę
mutanty głównie w poszczególnych enzymach z cyklu przemian,
otrzymamy szczep z zaburzonymi szlakami metabolicznymi
• 1. dehydrogenaza akonitynowa
• 2. dehydrogenaza izocytrynianowa
• 3. dehydrogenaza 2 –ketoglutaranowa
o
rekombinacja genetyczna (wykorzystanie cyklu paraseksualnego) na drodze
fuzjo protoplastów. Mogą być też fuzje między różnymi rodzinami (np. A.
Niger
z Trichoderma). Fuzjant otrzyma :
od Aspergillus – duża wydajność procesu produkcji kwasu
od Trichoderma : nie jest czuły na obecność glukozy (normalne
działanie : produkcja kw. cytrynowego – powstają analogi glukozy –
hamują produkcje kw. cytrynowego)
CECHY DOBREGO SZCZEPU PRZEMYSŁOWEGO
-
nie patogenny (ale Aspergillus jest /może być patogenny, powoduje tzw. aspergilozę –
ale przy zbyt częstym kontakcie przy jednocześnie obniżonej odporności organizmu)
-
niskie koszty (w sensie składu podłoża) – łatwo pozyskiwalne i łatwo dostępne
surowce
-
wysoka wydajność procesu syntezy przy niezbyt obfitym wytwarzaniu grzybni
-
duża stabilność genetyczna szczepu
o
odpowiednie przechowywanie (stosowania liofilizacja)
o
przechowywanie konidiów w jałowych pojemn. z cytrynianem wapnia
o
otrzymywanie konidiów w odpowiedni sposób (pożywki sporulacyjne)
-
nie wytwarzać / wytwarzanie w niewielkich ilościach inne kwasy organiczne (np.
szczawiooctan – obniżają one wydajność produkcji)
BIOSYNTEZA
Działają dwa szlaki –
-
EMP (glikoliza) (głównie gdy grzybnia jest w fazie stacjonarnej)
-
Lub / i pentozofosforanowy (dominuje przy intensywnym rozwoju grzybni)
Szybkość biotransformacji reguluje fosfofruktokinaza (jednocześnie reguluje glikolizę i
biotransformację kwasu cytrynowego), hamowana jest przez cytrynian i ATP (więc jest
korzystne ich „obejście” w mutagenezie) czyli poprzez skład podłoża (parametr) możemy
manipulować aby zahamować / wzmocnić działalność enzymów.
Hodowla na odpowiedniej pożywce wyłączającej dehydrogenazy :
-
dla dh. Akonitowej : deficyt jonów manganu i żelaza
-
dla dh. Izocytrynianowej : wysokie stężenie cytrynianu
-
dla dh. 2 – ketoglutaranowej : wysokie stężenie cukrów i jonów amonu
Cykl glioksolowy – reakcje pomocnicze, wzmacniające (prowadzi do powstania m.in.
szczawiooctanu – metabolit bezpośredni cytrynianu)
Mikrobiologia przemysłowa ćw 12
METODY PRODUKCJI
1. powierzchowna LSF (liquid surface fermentation)
Stosowane płytkie tace jako kadzie (taca o odpowiednio napowietrzonej, jałowej
komorze), inokulum to konidia, wzrost 2-3 dni, potem synteza w odp. Warstwie grzybni
stykajacej się z pożywką. Fermentacja trwa 8 –9 dni, Aspergillus rośnie jako zwarta grupa
komórek, w postaci kożucha (na powierzchni zarodnikuje – czarne konidia).
Wady : duze prawdopodobieństwo zanieczyszczenia hodowli (mimo jałowosci powietrza
np. zakażenie gatunkiem Penicilium – które hydrolizują grzybnię, możliwa obecność
bakterii Bacillus, E. Coli w melasie )
2. wgłębna SmF (submerged fermentation)
Efektywniejsza. Stosowane duże fermentory wypełnione pożywką. Grzybnia jest rozbita –
występuje w postaci grudek / strzępek (dzięki ciągłemu mieszaniu przez turbiny, lub
systemowi napowietrzania air lift), tak, że są zawieszone w obrębie pożywki. Bioreaktory
są zautomatyzowane, jako substrat stosowana Sacharoza. Aspergillus rośnie w całej
pożywce równomiernie.
Problemem jest dość trudne oddzielenie kwasu cytrynowego od biomasy.
Spływ pofermentacyjny : najpierw oddzieleni grzybni (w małych ilościach – np. u nas na
ć
wiczeniach przesączenie) proces wieloetapowego strącania (dodanie Ca(OH)2 –
otrzymujemy strącony cytrynian wapnia. Dodajemy to do kwasu siarkowego
(przeprowadza kwas cytrynowy z osadu do roztworu), przeprowadzamy filtrację ). Przy
okazji powstaje nam gips – CaSO4, ale niestety nie jest na tyle czysty, by mógł być użyty
– wymaga oczyszczenia.
Mikrobiologia przemysłowa ćw 12
3. na stałych pożywkach SSF (solid state fermentation)
w ten sposób produkuje się 20 % kwasu cytrynowego w Japonii (500 ton). Ekologiczna –
jako substrat stosowane odpady głównie z przemysłu spożywczego, cukrowni (np.
otręby). Wymaga 70 % wilgotności, proces fermentacji trwa 90 h, niska wydajność, kwas
oddziela się od podłoża przez ekstrakcję z ciepłą wodą.
PROWADZENIE HODOWLI
-
ź
ródło węgla i energii to cukry (stężenie 10 –22 % w zależności od szczepu
Aspergillusa
i wybranej metody)
o
przy metodzie powierzchniowej – melasa buraczana (produkt odpadowy,).
Wady : melasa może być zanieczyszczona bakteriami które mogą hamować
proces stymulując enzymy (co w met. Powierzchownej nie przeszkadza)
o
Metoda wgłębna – sacharoza ( melasa hamuje wydajność)
-
kwasowość pożywki (2, 3 pH), powyżej 3 wydajność spada, produkowane są inne
kwasy
-
eliminacja jonów metali, głównie Fe, Zn, Mn (np. dodając żelazocjanek potasowy
stymulujemy syntezę kwasu cytrynowego i wzrost grzybni)
-
niskie stężenie soli fosforanowych i amonowych
-
intensywne napowietrzanie podłoża
ZASTOSOWANIE KWASU CYTRYNOWEGO
-
przemysł spożywczy (jako E330)
o
regulator kwasowości (produkcja cukierków, różnych słodyczy, owoców
kandyzowanych, napojów)
o
antyutleniacz
(inaktywator
oksydaz
–
hamuje
utlenianie
kwasów
tłuszczowych, zapobiega psuciu się żywności)
o
dżemy, marmolady, galaretki, miód sztuczny
o
stabilizacja barwy, smaku i zapachu produktów przechowywanych w chłodni
(ryby, owoce morza, warzywa)
o
wino
-
przemysł farmaceutyczny
o
w preparatach krwi, aby zapobiec krzepnięciu, wytwarza cytrynian trójsodowy
i trójpotasowy
o
zapewnia musujący charakter tabletek
-
przemysł kosmetyczny
-
wyrób błon fotograficznych, papierów światłoczułych
-
chemia gospodarcza (dodawany do proszków do prania aby ograniczyć ilość
fosforanów,), łatwo degraduje
-
oczyszczanie kadzi mlekowych (w których powstaje kamień mleczanu – oczyszcza z
niego)
-
ś
rodki czyszczące przewody z rdzy
-
estry kwasu cytrynowego stosowane jako plastyfikatory w masach plastycznych
-
folie do pokrywania żywności