Kwas cytrynowy
Kwas cytrynowy (2-hydroksyl,2,3-propanotrikarboksylowy) o M
cz
=192 i temperaturze topnienia
153°C po raz pierwszy zostal wyizolowany z soku cytryn. Wystepuje w postaci bezwodnej lub
jedno wodnej. Jednowodna forma kwasu cytrynowego otrzymywana jest przez krystalizacje w
temperaturze ponizej 36,6°C, powyzej tej temperatury powstaje forma bezwodna. Kwas cytrynowy
jest mocnym kwasem organicznym, o czym decyduja stale dysocjacji wynoszace w 18°C
odpowiednio, K
1
=8,7x10
-4
, K
2
=1,77xl0
-5
,K
3
=1,0xl0
-7
. Rozpuszczalnosc w wodzie w temperaturze
20°C wynosi 73,3 g/100 cm
3
, w alkoholu w temperaturze 15°C 75,91 g/100 cm
3
. Kwas cytrynowy
otrzymywany jest wylacznie na drodze biologicznej z substratów naturalnych odtwarzalnych
(pochodzenia roslinnego), co miedzy innymi decyduje o oplacalnosci produkcji. Swiatowa
produkcja kwasu cytrynowego przekracza 300 000 ton rocznie, jej rozmiary podyktowane sa duzym
zapotrzebowaniem na ten kwas, glównie, bo az w 80%, przez przemysl spozywczy, lecz takze
farmaceutyczny, chemiczny i metalurgiczny. Szerokie wykorzystanie kwasu cytrynowego w
przemysle spozywczym wynika z jego dzialania konserwujacego na skutek obnizania wartosci pH
srodowiska. Jest jednoczesnie zwiazkiem nietoksycznym, o dobrych cechach smakowych i
zapachowych. Glównie z tych wzgledów kwas cytrynowy zostal dopuszczony przez FAO/WHO
bez ograniczen do produkcji zywnosci. Kwas ten stosowany jest w przemysle owocowo-
warzywnym jako inaktywator enzymów (oksydaz), które odpowiedzialne sa za utlenianie zwiazków
fenolowych, powodujacych ciemnienie owoców i warzyw. Wykorzystywany jest równiez do
produkcji napojów, slodyczy, owoców kandyzowanych, a takze w produkcji win, jako preparat
zakwaszajacy i stabilizujacy. Tworzenie przez kwas cytrynowy kompleksowych polaczen z jonami
metali (Fe,Cu, Zn) zadecydowalo o jego szerokim zastosowaniu jako stabilizatora (antyoksydanta)
olejów. Poprzez wiazanie metali katalizujacych proces jelczenia tluszczów, kwas cytrynowy
przerywa reakcje tworzenia nadtlenków i innych produktów powstalych w wyniku utleniania
nienasyconych kwasów tluszczowych w procesie autooksydacji olejów.
Wlasciwosci tworzenia kompleksów z metalami ciezkimi wyznaczylo szeroki obszar wykorzystania
kwasu cytrynowego do oczyszczania powierzchni metali przed spawaniem lub pokrywaniem
powlokami ochronnymi. W przemysle farmaceutycznym stosowany jest jako dodatek do tabletek,
powodujac musujacy efekt podczas ich rozpuszczania w wodzie. Ponadto cytrynian trisodowy i
tripotasowy uzywany jest w Stacjach Krwiodawstwa jako preparat zapobiegajacy krzepnieciu krwi.
W technologiach chemicznych kwas cytrynowy, a zwlaszcza jego sole (np.cytrynian trisodowy),
znalazly szerokie wykorzystanie w chemii gospodarczej wypierajac trudno biodegradowane
fosforany ze skladu detergentów. Estry kwasu cytrynowego i alkoholi alifatycznych, np. ester
trietylowy, tributylowy, znalazly zastosowanie jako nietoksyczne plastyfikatory w masach
plastycznych, z których wytwarza sie cienkie powloki (filmy) ochraniajace zywnosc. Wodne 24%
roztwory kwasu cytrynowego stosowane sa w mleczarstwie do usuwania z aparatury tzw. kamienia
mlecznego, tj. osadu utworzonego z bialka, tluszczu i soli mineralnych mleka. Producentami kwasu
cytrynowego sa wyselekcjonowane szczepy Aspergillus niger, Aspergillus wentii oraz liczne
drozdze z rodzaju Candida (Candida lipolytica, Candida tropicalis, Candida intermedia), które
syntetyzuja kwas cytrynowy w srodowiskach zawierajacych n-alkany. Wsród szczepów z gatunku
Candida lipolytica zostal wyselekcjonowany szczep, u którego stwierdzono cykl plciowy, co
odróznialo go od innych. W 1972 roku Yarrow na podstawie szczególowych badan wskazujacych
na wiele unikalnych cech dotyczacych morfologii askospor nadal mu nazwe Yarrowia lipolytica.
Gatunek ten wyróznia sie szczególna wlasciwoscia syntetyzowania kwasu cytrynowego z n-parafin,
co stawia go w szeregu cennych szczepów przemyslowych.
W praktyce przemyslowej najwieksze znaczenie maja jednak szczepy Aspergillus niger. Proces
produkcyjny jest prowadzony metoda powierzchniowa LFS (ang. Liquid Surface Fermentation),
wglebna SmF (ang. Submerged Fermentation) oraz na pozywkach stalych, tzw. proces SSF (ang.
Solid State Fermentation). Ta ostatnia metoda najpowszechniej rozwinela sie w Japonii, gdzie 20%
ilosci kwasu cytrynowego wytwarzanego na drodze biologicznej pochodzi z procesu na podlozu
stalym. W metodzie tej surowcem moga byc otreby, wytloki z trzciny cukrowej (o wilgotnosci nie
mniejszej niz 40%), wadliwa melasa buraczana czy trzcinowa, która z uwagi na niewlasciwy sklad,
w tym obecnosc zwiazków toksycznych, nie mogla byc wykorzystana w pozostalych metodach. Ze
wzgledu na mozliwosc wykorzystania jako pozywek róznego rodzaju odpadowych surowców
roslinnych oraz mniejsze obciazenie sciekami, technologia ta spelnia warunki ekologiczne i w
ostatnich latach nabywa szczególnego znaczenia. Na podkreslenie zasluguje fakt, ze w tym procesie
nie potwierdza sie wiele mechanizmów wystepujacych w tradycyjnych sposobach otrzymywania
kwasu cytrynowego, np. wystepuje wyzsza tolerancja grzybni Aspergillus niger na stezenie w
podlozu jonów metali i mikroelementów. Inna metoda, z która zwiazana jest przyszlosc produkcji
kwasu cytrynowego, to hodowla ciagla i stosowanie immobilizowanych komórek grzybni
Aspergillus niger. Obecnie w swiatowej produkcji kwasu cytrynowego metoda wglebna jest
wiodaca i tylko okolo 30% kwasu otrzymywanego jest jeszcze metoda powierzchniowa.
Szczepy Aspergillus niger stosowane do produkcji kwasu cytrynowego
Szczepy Aspergillus niger stosowane w przemyslowej produkcji kwasu cytrynowego otrzymane
zostaly w wyniku mutagenizacji oraz skriningowych selekcji szczepów naturalnych. Techniki te,
mimo iz naleza do najstarszych, wciaz przynosza dobre rezultaty. W charakterze mutagenów
stosowane sa czynniki fizyczne, w tym glównie promieniowanie ultrafioletowe (o dlugosci fali
λ
=260 nm), chemiczne lub kombinacje obu tych grup. Selekcja szczepów po dzialaniach
mutagennych prowadzona jest wedlug kryterium przyszlego zastosowania. Praktyka wykazala
bowiem, ze szczepy zapewniajace wysoka wydajnosc kwasu cytrynowego w procesie wglebnym na
podlozu mineralnym nie sprawdzaja sie w procesie powierzchniowym na podlozu melasowym.
Przyczyna tego jest zbyt bogata zawartosc w melasie buraczanej skladników mineralnych i
stymulatorów wzrostu w postaci zwiazków azotowych i fosforowych, co powoduje nadmierny
rozwój biomasy grzybni przy jednoczesnie oslabionej biosyntezie kwasu cytrynowego. Ulepszanie
szczepów Aspergillus niger do produkcji kwasu cytrynowego mozliwe jest takze w oparciu o
metody rekombinacji genetycznej, w których podstawowe znaczenie ma istnienie u plesni cyklu
paraseksualnego, umozliwiajacego przeprowadzenie hybrydyzacji i selekcje rekombinantów.
Doskonalenie szczepów do produkcji kwasu cytrynowego prowadzone jest na drodze fuzji
protoplastów miedzy odmianami Aspergillus niger rózniacymi sie wydajnoscia kwasu
cytrynowego, szybkoscia fermentacji czy tolerancja na skladniki podloza, celem otrzymania
szczepów o korzystnych cechach technologicznych. Istnieje mozliwosc tworzenia
miedzyrodzajowych fuzantów, np. pomiedzy Aspergillus niger i Trichoderma viride, wykazujacych
opornosc na analog glukozy, 2-deoksy-D-glukoze (tworzacy sie w srodowisku hodowlanym i
dzialajacy jako inhibitor enzymów glikolitycznych), przy zachowaniu wysokiej wydajnosci kwasu
cytrynowego.
W pracach ze szczepami przemyslowymi niezwykle waznym, a zarazem trudnym etapem, jest
zastosowanie wlasciwej metody przechowywania zapewniajacej stabilnosc cech materialu
biologicznego. Do przyjetych w praktyce metod nalezy liofilizacja, przechowywanie konidiów w
mieszaninie z jalowym piaskiem, weglem aktywnym lub cytrynianem wapnia. Istotna sprawa jest
równiez otrzymanie odpowiedniej ilosci i jakosci biochemicznej materialu szczepiennego, jakim sa
konidia szczepu przemyslowego. Stosowane pozywki sporulacyjne (pobudzajace wytwarzanie
konidiów) powinny indukowac w konidiach enzymy odpowiedzialne za synteze kwasu
cytrynowego. Najczesciej stosowane sa pozywki, które w swoim skladzie zawieraja niski poziom
wegla i azotu, natomiast wzbogacone sa w posredniki cyklu Krebsa. Praktyka wykazala, ze szczepy
przeznaczone do procesu wglebnego z uzyciem podloza mineralnego, aktywowane na podlozu
sporulacyjnym (ziemniaczano-glukozowo-agarowym o pH 6,0-7,0) zapewniaja wysoka wydajnosc
kwasu cytrynowego. Szczepy wykorzystywane w procesie powierzchniowym, w którym surowcem
jest melasa buraczana, wymagaja podloza sporulacyjnego zestalonego agarem, w którym obok
brzeczki slodowej w niewielkich ilosciach dodana jest melasa buraczana. Szczepy Aspergillus niger
stosowane w przemyslowej produkcji kwasu cytrynowego, na skutek pewnych zmian srodowiska
hodowlanego oraz sposobu przechowywania, moga swój dotychczasowy metabolizm,
ukierunkowany na synteze kwasu cytrynowego, zmienic na oksydacyjny, wynikiem czego jest
glównie produkcja biomasy. To czesto wystepujace zjawisko stwarza koniecznosc ciaglej selekcji
odmian o pozadanych cechach. Najczesciej przyjeta metoda skriningowa jest ocena wlasciwosci
kwaszacych poszczególnych osobników danej populacji i izolowanie najbardziej aktywnych. Testy
te przeprowadza sie na pozywkach stalych z dodatkiem wskaznika wartosci pH. Dalsza selekcja
szczepów odbywa sie na podstawie laboratoryjnych testów biologicznych w pozywkach
stosowanych w produkcji kwasu cytrynowego.
Biochemiczne uwarunkowania nadprodukcji kwasu cytrynowego u Aspergillus
niger
Nadprodukcja kwasu cytrynowego u niektórych odmian Aspergillus niger jest wynikiem zaklócen
w cyklu Krebsa wywolanych brakiem lub niska aktywnoscia enzymów odpowiedzialnych za jego
dalsza konwersje. Ten defekt biochemiczny jest uwarunkowany genotypowo, wiadomo jednak, ze
poprzez odpowiednie warunki hodowli aktywnosc szczepów w procesie biosyntezy moze byc
zintensyfikowana, zapewniajac wysoka wydajnosc kwasu cytrynowego.
Korzystnymi warunkami procesu sa: wysokie stezenie cukru (ok. 10% w hodowli wglebnej i 16%
w hodowli powierzchniowej), niedobór jonów metali: Mn
+2
, Zn
+2
, Fe
+2
(<0,1 mg/100 cm
3
),
ograniczona ilosc zwiazków azotu i fosforu (limitacja wzrostu grzybni), niska wartosc pH, ok. 2,4-
2,6, dobre natlenienie srodowiska. Dwa ostatnie warunki odnosza sie glównie do procesu
wglebnego w pozywkach syntetycznych.
Kwas cytrynowy powstaje w poczatkowych przemianach cyklu Krebsa, w wyniku kondensacji
acetylo-CoA i szczawiooctanu, katalizowanej przez syntaze cytrynianowa (rys. 1). W procesie
rozwoju grzybni (trofofaza), a nastepnie produkcji kwasu cytrynowego (idiofaza) heksozy
asymilowane sa w dwóch szlakach metabolicznych EMP (glikoliza) i pentozofosforanowym
(HMP). Ten ostatni szlak uaktywnia sie w fazie intensywnego rozwoju grzybni, po czym ustepuje
glikolizie w fazie produkcji kwasu cytrynowego. Zatem glównym regulatorem szybkosci glikolizy
jest fosfofruktokinaza, która staje sie jednoczesnie regulatorem biosyntezy kwasu cytrynowego.
Enzym ten jest wrazliwy na obecnosc cytrynianu w srodowisku, ale u szczepów Aspergillus niger w
procesie produkcji kwasu cytrynowego represja ta jest znoszona nadmiarem jonów NH
4+
w
komórkach, w wyniku zaklóconych przemian bialkowych spowodowanych niedoborem w podlozu
jonów Mn
2+
. Mechanizmem regulujacym biosynteze kwasu cytrynowego jest takze ograniczenie
syntezy ATP, który jest inhibitorem fosfofruktokinazy. Dowodzi to istnienia w grzybni
alternatywnej tlenowej drogi oddechowej, jalowej energetycznie, a wiec nie blokujacej glikolizy.
Ten typ oddychania tlenowego, czesto wystepujacy u roslin, nie zostal jeszcze dokladnie zbadany u
szczepów Aspergillus niger. Wykazano natomiast jego istnienie w grzybni Neurospora crasa oraz u
drozdzy z rodzajów Candida i Rhodotorula, najczesciej podczas przejscia z fazy logarytmicznego
wzrostu do fazy stacjonarnej. Alternatywna droga oddechowa ujawnia sie w momencie oslabienia
oddychania z udzialem oksydazy cytochromowej, wtedy indukowana jest synteza oksydazy
alternatywnej, ukladu enzymatycznego katalizujacego przenoszenie elektronów na tlen. Indukcje tej
oksydazy w komórkach grzybni moze wywolac:
- nagromadzenie sie NADH,
- zmniejszenie zapotrzebowania na ATP,
- niedobór ADP w mitochondriach,
- niedobór jonów Cu
+2
niezbednych do funkcjonowania oksydazy cytochromowej.
Wymienione czynniki sprawiaja, ze cytoplazmatyczny koenzym NADH powstajacy w procesie
glikolizy jest utleniany z udzialem oksydazy alternatywnej szlakiem, w którym energia nie
wydziela sie w postaci ATP, lecz energii cieplnej. Mechanizm ten uruchamia sie przy rozkojarzeniu
fosforylacji oksydatywnej. Oksydaza alternatywnego oddychania cechuje sie, w odróznieniu od
oksydazy cytochromowej, niskim powinowactwem do tlenu. Oznacza to, ze dzialalnosc tego
enzymu wymaga znacznie wyzszego stezenia tlenu w srodowisku niz droga cytochromowa.
Badania wykazaly, ze dopiero stezenie tlenu powyzej 21% powoduje wzrost aktywnosci
oddychania alternatywnego. We wglebnym procesie otrzymywania kwasu cytrynowego, w fazie
produkcji przy intensywnym napowietrzaniu, moze byc wiec wzbudzana ta droga oddechowa.
Zaklócenie procesu wynikajace z braku doplywu tlenu moze spowodowac utrate tej aktywnosci i
przywrócenie oddychania z udzialem oksydazy cytochromowej. Efektem tych zmian jest
zahamowanie syntezy kwasu cytrynowego na korzysc produkcji biomasy. Takie zjawisko
obserwuje sie podczas awarii systemu natleniania w przemyslowej produkcji kwasu cytrynowego
metoda wglebna.
Rys. 1. Szlaki metaboliczne przemiany glukozy do kwasu cytrynowego u Aspergillus niger: l - syntaza
cytrynianowa, 2,3- hydrataza akonitanowa, 4 - dehydrogenaza izocytrynianowa, 5 - dehydrogenaza 2-
ketoglutaranowa, 6 - liaza izocytrynianowa; pogrubione linie oznaczaja miejsca oslabionej aktywnosci
enzymatycznej
Do poznanych innych mechanizmów regulujacych synteze kwasu cytrynowego nalezy oslabienie
przemian enzymatycznych w cyklu Krebsa na etapach:
- hydratazy akonitanowej (hamowanej deficytem jonów Mn
2+
i Fe
2+
),
- mitochondrialnej dehydrogenazy izocytrynianowej (hamowanej cytrynianem),
- dehydrogenazy 2-ketoglutaranowej (hamowanej wysokim stezeniem cukru i jonami NH
4+
).
Biosynteza kwasu cytrynowego u Aspergillus niger zwiazana jest takze z cyklem kwasów
dikarboksylowych - glioksalowym (rys. 1). Cykl ten przez reakcje anaplerotyczne (uzupelniajace)
dostarcza kwasu szczawiowego, który jest prekursorem kwasu cytrynowego.
Produkcja kwasu cytrynowego metoda powierzchniowa
Powszechne uzywanie okreslenia metoda powierzchniowa i metoda wglebna otrzymywania kwasu
cytrynowego wynika z odmiennych warunków hodowli, powodujacych rózna morfologie grzybni.
W metodzie powierzchniowej w warunkach statycznych grzybnia Aspergillus niger rozwija sie na
powierzchni pozywki, tworzac zwarta pleche zlozona z mocno rozgalezionych strzepek. W
metodzie wglebnej grzybnia rosnie w calej objetosci pozywki, tworzac w wyniku ciaglego jej ruchu
dosc zwarte fragmenty w formie grudek (pellets). Wspólna cecha obydwu metod otrzymywania
kwasu cytrynowego jest ich dwufazowosc. W pierwszej zachodzi intensywny rozwój grzybni, trwa
ona przewaznie do 72 godziny hodowli, po czym nastepuje druga faza, w której intensywnie
wytwarzany jest kwas cytrynowy przy ograniczonym wzroscie grzybni. W hodowli
powierzchniowej obydwie fazy przebiegaja w systemie jednostopniowym. W procesie wglebnym
pierwsza faza odbywa sie w podlozu inokulacyjnym, o skladzie rózniacym sie od fermentacyjnego,
glównie ze wzgledu na zmniejszona ilosc zródla wegla. Wegetatywny rozwój grzybni w obydwu
metodach rozpoczyna sie uaktywnianiem i kielkowaniem konidiów, wytwarzaniem kielka, a
nastepnie strzepki rostowej, która wydluzajac sie i rozgaleziajac, tworzy grzybnie o morfologii
odpowiadajacej warunkom hodowli. W metodzie powierzchniowego procesu otrzymywania kwasu
cytrynowego najczesciej stosowanym surowcem jest melasa buraczana. Melasa buraczana
zakwalifikowana jako surowiec jest rozcienczona do zawartosci sacharozy ok. 16%, a nastepnie
uzupelniona solami mineralnymi (KH
2
PO
4
– 0,008%, ZnSO
4
x 7H
2
0 – 0,0008% oraz K
4
Fe(CN)
6
-
ok. 0,08%); pH pozywki jest regulowane do wartosci 6,4-6,8. Dokladna ilosc K
4
Fe(CN)
6
musi byc
eksperymentalnie okreslona dla kazdej odmiany melasy buraczanej, poniewaz zelazocyjanek potasu
wytraca ze srodowiska metale ciezkie - Fe, Zn, Pb, których pewne ilosci sa niezbedne dla procesu
biosyntezy kwasu cytrynowego. Sterylna pozywke melasowa w objetosci 500-600 dm
3
rozlewa sie
za pomoca odpowiednich urzadzen do tac, o wymiarach 2 m dlugosci, 2,5 m szerokosci i 0,16 m
glebokosci. Tace sa sporzadzone ze stali kwasoodpornej i sa zamontowane na specjalnych
stelazach, umieszczanych w komorach z regulacja temperatury i napowietrzania. Kiedy temperatura
pozywki obnizy sie do wartosci 40°C, szczepi sie ja konidiami plesni zmieszanymi z weglem
aktywnym jako nosnikiem. Po 24 godzinnej inkubacji pojawia sie widoczna cienka grzybnia, której
intensywny wzrost trwa do 48-72 godzin, po czym slabnie na korzysc produkcji kwasu
cytrynowego. Dojrzala grzybnia osiaga grubosc 2-3 cm, jej warstwa dolna stykajaca sie z podlozem
jest odpowiedzialna za synteze kwasu cytrynowego. Czas trwania procesu wynosi 168-216 godz. w
temp. 30°C, zapewniajac wydajnosc kwasu cytrynowego na poziomie 70-80% w stosunku do
poczatkowej ilosci cukru w pozywce. W tym procesie obok kwasu cytrynowego, stanowiacego
okolo 80% zawartosci wszystkich kwasów, do podloza wydzielany jest kwas szczawiowy i kwas
glukonowy oraz w sladowych ilosciach kwasy z cyklu Krebsa.
Zanieczyszczenia mikrobiologiczne
Zródlem zanieczyszczen mikrobiologicznych w powierzchniowej metodzie otrzymywania kwasu
cytrynowego jest przede wszystkim melasa buraczana. W surowcu tym wystepuja glównie bakterie
z rodzaju Bacillus, Pseudomonas, a takze Escherichia coli i Enterobacter aerogenes. Zródlem tych
ostatnich bakterii oprócz melasy moze byc takze woda stosowana w procesie technologicznym, jesli
nie spelnia wymagan okreslonych norma. Wszystkie drobnoustroje wystepujace jako
zanieczyszczenia sa zdolne do redukcji azotanów (V) do azotanów (III), które dzialaja hamujaco na
rozwój grzybni. Badania wykazaly, ze w podlozu melasowym, po niewlasciwie przeprowadzonej
sterylizacji, moga pozostac zywe bakterie z rodzaju Lactobacillus i Leuconostoc, wywierajace
antagonistyczny wplyw na rozwój grzybni Aspergillus niger. Sposród plesni najczestszym
zanieczyszczeniem jest Penicillium purpurogenum i Penicillium rubrum. W procesie
technologicznym konidia tych plesni dostaja sie z powietrzem stosowanym do przewietrzania
komór, a takze wraz ze szczepionka konidiów Aspergillus niger podczas jej rozpylania na
powierzchnie pozywki. Plesnie te sa bogate w enzymy hydrolityczne, dzieki którym rozwijaja sie
na grzybni Aspergillus niger, powodujac jej lize. Aby uniknac skutków zanieczyszczen
mikrobiologicznych, nalezy stosowac aktywna szczepionke grzybni Asperillus niger, szybko
opanowujaca srodowisko i obnizajaca wartosc pH do poziomu hamujacego rozwój mikroflory
bakteryjnej. Podobnie jak w kazdym procesie biotechnologicznym musi byc zapewniona wysoka
czystosc aparatury i komór fermentacyjnych oraz powietrza do ich przewietrzania, poniewaz w
przeciwnym razie te srodowiska stac sie moga zródlem zanieczyszczenia rózna mikroflora,
zaklócajaca proces produkcji kwasu cytrynowego.
Wydzielanie kwasu cytrynowego z podloza hodowlanego
Wydzielanie kwasu cytrynowego odbywa sie tzw. metoda cytrynianowa. Polega ona na wytracaniu
na goraco cytrynianu wapnia, traktujac roztwór pofermentacyjny wodorotlenkiem wapnia.
Wytworzony osad cytrynianu wapnia [Ca
3
(C
6
H
5
O
7
)
2
] po oddzieleniu od masy reakcyjnej zadaje sie
roztworem H
2
SO
4
, w celu otrzymania kwasu cytrynowego w postaci wolnej. Wytracony gips
oddziela sie przez filtracje, roztwór zas zageszcza i wydziela czysty produkt przez krystalizacje.
Handlowy kwas cytrynowy wyodrebniony ta metoda jest zwiazany z jedna czasteczka wody
(C
6
H
5
O
7
xH
2
O). Metoda cytrynianowa jest bardzo uciazliwa dla przemyslowej produkcji kwasu
cytrynowego, z uwagi na duze zuzycie kwasu siarkowego, wodorotlenku wapnia, a takze
wytwarzanie w tym procesie nadmiernych ilosci gipsu. W Instytucie Technologii Przemyslu
Chemicznego i Spozywczego Akademii Ekonomicznej we Wroclawiu zostala opracowana metoda
wydzielania i oczyszczania kwasu cytrynowego tzw. metoda bezcytrynianowa. Moze byc ona
wykorzystana tylko w tych przypadkach, w których do biosyntezy kwasu cytrynowego stosowane
sa substraty o wysokiej czystosci, tj.: glukoza, skrobia, maczki cukrowe, a wiec glównie we
wglebnej hodowli Aspergillus niger. Metoda bezcytrynianowa polega na:
- dezaktywacji grzybni w temp. 70°C i oddzieleniu od roztworu hodowlanego,
- oczyszczeniu filtratu garbnikami i ziemia okrzemkowa,
- odbarwieniu na kolumnie weglowej,
- zatezeniu w wyparce prózniowej do 72% zawartosci kwasu cytrynowego,
- krystalizacji kwasu cytrynowego w temp. 7°C.
Wydajnosc krystalizacji kwasu cytrynowego wynosi okolo 50%. Odciek miedzykrystaliczny po
odbarwieniu weglem aktywnym oczyszcza sie na jonitach (kationit i anionit). Proces oczyszczania
jest tak prowadzony, aby oczyszczony odciek odpowiadal wymaganiom stawianym przez norme na
spozywczy kwas cytrynowy w plynie.
Powierzchniowa biosynteza kwasu cytrynowego z wykorzystaniem melasy jako surowca dostarcza
duzych ilosci scieków o wysokim wskazniku BZT
5
Filtrat, po oddzieleniu cytrynianu wapnia,
mozna po zageszczeniu stosowac jako dodatek do pasz lub poddawac beztlenowej fermentacji
metanowej w oczyszczalniach scieków. Istnieje takze koncepcja wykorzystania filtratu do produkcji
drozdzy paszowych. Powaznym problemem ekologicznym jest gips wytwarzany w procesie
oczyszczania kwasu cytrynowego. Zagospodarowanie gipsu jako materialu budowlanego jest
mozliwe dopiero po odpowiednim oczyszczeniu. Roztwór hodowlany po oddzieleniu grzybni
zawiera obok glównego metabolitu, jakim jest kwas cytrynowy, wiele cennych enzymów, glównie
enzymy pektynolityczne, proteolityczne, a takze glukanazy, co stwarza mozliwosc ich
przemyslowego pozyskiwania. Ponadto zródlem wielu enzymów (proteinazy, amylazy, pektynazy,
oksydaza glukozowa), które moga byc wydzielane dla celów handlowych, jest grzybnia Aspergillus
niger. Wytwarzana w duzych ilosciach w procesach biosyntezy kwasu cytrynowego moze byc takze
wykorzystana na cele paszowe, poniewaz zawiera ponad 40% bialka w suchej masie, z czego
polowa to bialko dobrze przyswajalne. Ponadto zawiera liczne mikroelementy. Dodatek suszu
grzybowego w ilosci 10-15% do pasz dla zwierzat hodowlanych, dorównuje wartosci odzywczej
preparatom drozdzy paszowych.
Melasa buraczana jako surowiec do produkcji kwasu cytrynowego
Melasa buraczana jest ubocznym produktem przemyslu cukrowniczego. Jej sklad chemiczny
podano na rys. 4.
Rys. 4. Sklad chemiczny melasy buraczanej
W grupie niecukrów melasy (zwiazków rozpuszczalnych, nie bedacych sacharoza), stanowiacych
okolo 30% zawartosci suchej masy, znajduja sie zwiazki, które sprzyjaja rozwojowi
drobnoustrojów, w tym takze szczepów produkcyjnych oraz takie, których dzialanie jest dla
mikroorganizmów szkodliwe. Do pierwszej grupy naleza aminokwasy, biotyna, kwas pantotenowy,
mezoinozytol. W drugiej grupie znajduja sie zwiazki o charakterze nieorganicznym (aniony,
kationy) oraz zwiazki organiczne, tj. kwasy organiczne, zwiazki bialkowe, zwiazki barwne oraz
inne, o róznej strukturze chemicznej. Suma wszystkich zwiazków melasy wykorzystywanych przez
drobnoustroje stanowi 51-58% suchej masy. Szkodliwe dla drobnoustrojów przemyslowych
zwiazki melasy maja rózne pochodzenie. Niektóre z nich powstaja podczas gnicia buraków w
czasie ich przechowywania w kopcach badz pochodza ze srodków chemicznych, które stosuje sie
dla zahamowania szerzenia sie „kopcowej zgnilizny". Inne zródlo zwiazków szkodliwych, to
preparaty uzywane w zabiegach agrotechnicznych (nawozy mineralne, preparaty chwasto- i
owadobójcze). Nie bez znaczenia dla jakosci surowcowej melasy sa zwiazki powstale podczas
przerobu buraków, tj. kwasy lotne, azotany (V), zwiazki barwne, które tworza sie juz w
ekstraktorze i w dalszych etapach oczyszczania soku. Niezwykle wazna role w tworzeniu
niekorzystnej frakcji melasy spelniaja pomocnicze srodki chemiczne stosowane w procesie
otrzymywania cukru. Do powszechnie uzywanych preparatów w przemysle cukrowniczym naleza:
flokulanty, emulgatory, dezynfektanty oraz srodki do gaszenia piany. W polskim cukrownictwie
jako preparaty przeciwpianowe stosuje sie lój barani, Spumole BJ, K-3, Rokamix oraz inne,
pochodzenia zagranicznego. Przecietnie na 100 ton buraków zuzycie srodka do gaszenia piany
wynosi od 0,6 do 24 kg. Ten bardzo szeroki przedzial uzytej ilosci preparatów przeciwpianowych
zalezy przede wszystkim od jakosci przerabianego surowca. Buraki niedojrzale, zbyt dlugo
skladowane, zmarzniete powoduja, ze wychodzacy z ekstraktora sok bardzo sie pieni, co zmusza
technologów do wiekszego zuzycia srodka przeciwpianowego Kumulowanie sie w melasie tego
rodzaju preparatów o wlasciwosciach powierzchniowo-czynnych nie wplywa korzystnie na jej
wartosc surowcowa. W procesie powierzchniowej fermentacji cytrynowej, w której melasa jest
podstawowym surowcem, nadmiar preparatów przeciwpianowych, np. typu Spumol K-3, zaklóca
proces rozwoju grzybni juz w stadium kielkowania konidiów, a utworzona grzybnia jest
nieprawidlowa i latwo ulega zatopieniu.
W grupie szczepów Aspergillus niger, cechujacych sie wysoka aktywnoscia biosyntezy kwasu
cytrynowego, istnieja odmiany wykazujace zróznicowana wrazliwosc na obecne w melasie zwiazki
zaklócajace rozwój grzybni i produkcje kwasu cytrynowego, z tego tez wzgledu przy selekcji
szczepów przemyslowych uwzgledniana jest ich tolerancja na zmienny sklad melasy i zawarte w
niej inhibitory wzrostu. Jednakze dobór materialu biologicznego i jego selekcja pod tym wzgledem
jest utrudniona ze wzgledu na zlozonosc skladu chemicznego melasy i obecnosc róznych
zwiazków, które moga byc odpowiedzialne za wadliwosc tego surowca. Klasyfikacja melas do
fermentacji cytrynowej oparta jest na danych z analizy chemicznej objetych norma PN 76/R-64772
(Tab. 1). Jednakze zakres stosowanych analiz chemicznych nie obejmuje kontroli wszystkich
skladników melas buraczanych, a zwlaszcza tych, które maja szkodliwy wplyw na rozwój grzybni
Aspergillus niger. Z tego wzgledu niezbednym testem do oceny przydatnosci surowca melasowego
jest wynik laboratoryjnych prób hodowli Aspergillus niger. Uzdatnianie melas do celów produkcji
kwasu cytrynowego (a takze itakonowego) odbywa sie poprzez dodatek do podloza zelazocyjanku
potasu w celu usuniecia nadmiaru jonów metali ciezkich, glównie zelaza. Inna metoda zalecana dla
procesu wglebnego jest odsalanie melasy na wymieniaczach jonowych.
Tab. 1. Klasyfikacja melas buraczanych wg PN-76/R-64772
Melasy buraczane
Parametr
I klasa
II klasa
°Bx
75,0
75,0-73,0
pH
7,0-8,5
7,0-9,0
Zawartosc sacharozy [%]
=47,0
=44,0
Czystosc (Cz.)* [%]
61,0-66,0
60,0-58,0
Cukier inwert. [%]
<1,0
nie norm.
Azot ogólny [%]
<1,7
2,3
Kwasy lotne (CH
3
COOH)
<1,4
nie norm.
Sole Ca i Mg (CaO) [%]
<1,2
<2.0
SO
2
[%]
=0
-
Ogólna liczba
drobnoustrojów
105
106
*Cz. - procentowa zawartosc sacharozy w suchej masie
Produkcja kwasu cytrynowego metoda wglebna
Wglebna metoda biosyntezy kwasu cytrynowego w skali przemyslowej prowadzona jest w
bioreaktorach o pojemnosci od 50 do 100 m
3
z uzyciem surowców o wyzszym stopniu czystosci niz
w metodzie powierzchniowej, tj. cukru handlowego (sacharoza), soków cukrowniczych, maczek
cukrowych, hydrolizatów skrobiowych. Rzadziej do tego celu wykorzystywana jest melasa
buraczana, poniewaz proces wglebny z jej uzyciem nie zapewnia odpowiedniej wydajnosci kwasu
cytrynowego. W przypadku stosowania pozywki mineralnej, w której zródlem wegla jest handlowa
sacharoza, wydajnosc biosyntezy kwasu cytrynowego wynosi ponad 80%. Obok zródla wegla w
ilosci 100-150 g/dm
3
, pozywka zawiera w swoim skladzie niezbedne sole mineralne, tj. (NH
4
)
2
SO
4
- 2g/dm
3
, MgSO
4
x7H
2
O – 0,2g/dm
3
, KH
2
PO
4
- 0,2 g/dm
3
, a pH regulowane jest do wartosci 2,5-
3,0. W zaleznosci od specyfiki szczepu Aspergillus niger pozywke w bioreaktorze szczepi sie
zawiesina konidiów w ilosci 105/cm
3
, po ich wczesniejszej 6-8 godzinnej inkubacji lub zawiesina
grzybni inokulacyjnej otrzymanej po 24-36 godzinach hodowli, stosujac 10% w stosunku do
objetosci pozywki w bioreaktorze. W metodzie hodowli wglebnej, w wyniku ciaglego mieszania,
grzybnia rozwija sie w calej objetosci podloza. Po 48 godzinach rozpoczyna sie faza produkcji
kwasu cytrynowego. Czas trwania procesu biosyntezy, do momentu wyczerpania zródla wegla,
wynosi od 120 do 168 godzin w temperaturze 30-32°C i przy napowietrzaniu jalowym powietrzem
w ilosci 0,1-0,4 vvm (objetosc powietrza dostarczana do bioreaktora w stosunku do objetosci
podloza, wciagu minuty). Zaleta tej metody w porównaniu z metoda powierzchniowa z uzyciem
melasy, jest krótszy czas trwania procesu, mniejsze zagrozenie rozwojem obcej mikroflory z uwagi
na niska wartosc pH i zamkniete bioreaktory oraz mozliwosc wydzielania kwasu cytrynowego z
pozywki na drodze krystalizacji, a takze na mniejsze obciazenie sciekami. Otrzymywanie kwasu
cytrynowego metoda hodowli wglebnej stwarza jednak wiele trudnosci natury bioinzynieryjnej,
które wynikaja ze specyficznej morfologii grzybni w tych warunkach. Ciagly ruch cieczy
wywolany mieszaniem i napowietrzaniem powoduje, ze grzybnia w bioreaktorze wystepuje w
postaci klebków (pellets) o srednicy 0,2-3,0 mm badz strzepek grzybni o róznym stopniu
rozgalezienia lub tez jako mieszanina obu form morfologicznych. Taki wzrost grzybni, a takze
gestosc zawiesiny wynoszaca do 50 kg s.m./m
3
powoduja, ze srodowisko hodowlane osiaga wysoka
lepkosc. W tak niekorzystnych reologicznie warunkach utrudniona staje sie wymiana masy, a takze
dyfuzja tlenu do podloza oraz do komórek grzybni. Znajomosc fizjologii i morfologii grzybów
strzepkowych oraz parametrów reologicznych (lepkosc, gestosc) zmieniajacych sie wraz z
rozwojem grzybni jest niezbedna do wlasciwego zaprojektowania bioreaktora z odpowiednim
systemem doprowadzenia powietrza do srodowiska, mieszaniem masy reakcyjnej zapewniajacym
dobre warunki wymiany masy i wymiany gazowej (CO
2
, O
2
). Znane podstawowe zasady wymiany
masy i ciepla w biorektorach, dotyczace plynów newtonowskich, w przypadku hodowli grzybów
strzepkowych sa nieprzydatne, poniewaz organizmy te tworza zawiesiny o wlasciwosciach
nienewtonowskich. Stad tez bioreaktory stosowane do biosyntezy kwasu cytrynowego musza byc
specjalnie konstruowane. Najczesciej stosuje sie bioreaktory z mieszadlem turbinowo-tarczowym,
którego ruch powoduje silna dyspersje powietrza w cieczy. Najbardziej efektywna wymiane masy i
dyfuzje powietrza zapewniaja bioreaktory bezmieszadlowe z naturalna cyrkulacja cieczy typu air-
lift, w których powietrze do wnetrza aparatu wprowadzane jest przez odpowiednie urzadzenia
napowietrzajace. Bioreaktory wykonane sa ze stali kwasoodpornej i sa wyposazone w
oprzyrzadowanie pomiarowe, tj. elektrode tlenowa, elektrode redox (do pomiaru potencjalu
oksydoredukcyjnego), termometr polaczony z regulatorem temperatury, rotametr, pehametr,
regulator obrotów walu mieszadla i odpieniacz mechaniczny. W procesach prowadzonych w
bioreaktorach zjawisko pienienia sie nie zawsze skutecznie moze byc likwidowane mechanicznie,
czesto istnieje koniecznosc stosowania srodków przeciwpianowych, ale w sposób kontrolowany,
poniewaz nadmiar tego rodzaju preparatów o wlasciwosciach powierzchniowo-czynnych zaklóca
rozwój grzybni i zmniejsza wydajnosc biosyntezy kwasu cytrynowego.