LABORATORIUM 5 
 

Temat: WPŁYW INHIBITORÓW I CZYNNIKÓW FIZYCZNYCH NA 

PRZEBIEG REAKCJI ENZYMATYCZNYCH 

 

Inwertaza,  sacharaza,  ß-D-fruktofuranozydaza,  enzym  z  klasy  hydrolaz  i  podklasy 
glikozydaz,  rozkładający  cukier  sacharozę  na  glukozę  i  fruktozę.  Występuje  głównie  w 
komórkach roślinnych, gdzie związany jest ze ścianą komórkową. Najłatwiej uzyskuje się ten 
enzym z komórek drożdży.  

Sacharoza disacharyd, złożony z fruktozy i glukozy, będący zasadniczym składnikiem cukru 
trzcinowego  i  cukru  buraczanego.  W  temperaturze  pokojowej  sacharoza  jest  bezbarwnym, 
krystaliczny ciałem stałym. Jest nietoksyczna, ma słodki smak i bardzo dobrze rozpuszcza się 
w  wodzie.  Należy  do  cukrów  nieredukujących.  W  kwaśnych  warunkach  hydrolizuje  do 
fruktozy i glukozy wg schematu: 

 

 
 
Zadanie 1. Wpływ pH na aktywność inwertazy z drożdży 
 
Szybkość reakcji katalizowanej przez enzym jest maksymalna przy określonej wartości pH, a 
maleje  w  miarę  oddalania  się  od  niej  (zbyt  kwasowe  lub  zasadowe  środowisko  może 
powodować  denaturację  białek).  Zmiany  aktywności  enzymatycznej  przy  różnym  pH  są 
wywołane  zmianami  w  stopniu  zjonizowania  składników  układu:  enzymu,  substratu  i 
kompleksu enzym- substrat.   
Inwertaza  jest  enzymem  aktywnym  w  szerokim  kwasowym  zakresie  pH  od  4  do  6. 
Optymalne pH ma wartość 4,7. Przy pH 2 i 9 jest już praktycznie nieaktywna. 
 
Wykonanie: 
 
Przygotować 7 probówek. Do 6 probówek wprowadzić po 1  ml odpowiedniego buforu o pH 
3;  4,7;  5;  7;  9  i  11.  Następnie  do  każdej  probówki  dodać  1  ml  0,3M  sacharozy  oraz  1  ml 
inwertazy  o  optymalnym  stężeniu.  Przygotować  także  próbę  kontrolną  w  7-mej  probówce 
zawierającą  1ml  buforu  o  pH  4,7;  1ml  0,3M  sacharozy  i  1  ml  wody  zamiast  enzymu.  Po 
wymieszaniu  wszystkich  składników  mieszaniny  inkubacyjne zostawić  na 30  minut.  Po tym 
czasie  zalkalizować  próby  paroma  kroplami  1M  roztworu  NaOH  (sprawdzić  pH  !),  a 
następnie  we  wszystkich  mieszaninach  wykonać  próbę  Benedicta.  W  tym  celu  do  siedmiu 
czystych  probówek  dodać  po  1  ml  odczynnika  Benedicta  i  do  każdej  z  nich  dodać  0,2  ml 
mieszaniny  reakcyjnej.  Probówki  umieścić  na  ok.  1-2  minuty  we  wrzącej  łaźni  wodnej. 
Zanotować wyniki i zinterpretować je.    
 
Zadanie 2. Wpływ temperatury na aktywność inwertazy z drożdży 
 
Ze  wzrostem  temperatury  zwiększa  się  szybkość  reakcji  enzymatycznej.  Po  osiągnięciu 
pewnego  optimum  w  danych  warunkach  szybkość  reakcji  zaczyna  maleć  w  następstwie 
denaturacji  cieplnej  enzymu.  Większość  enzymów  traci  nieodwracalnie  aktywność  po 
przekroczeniu  temperatury  65 

0

C  i  tylko  nieliczne  wytrzymują  krótkie  gotowanie 

(rybonukleaza, żelatyna czy pepsyna w pH 1). W zakresie temperatur, w których denaturacja 
enzymu  jest  praktycznie  nieistotna,  a  więc  ok.  37

0

 

C,  podniesienie  temperatury  o  10 

0

C 

zwiększa szybkość reakcji mniej więcej 2- krotnie.  
 
Wykonanie: 
 
Przygotować  6  probówek,  a  następnie  do  wszystkich  dodać  po  0,5  ml  sacharozy  w  buforze 
octanowym  o  pH  4,7  oraz  do  pięciu  z  nich  0,5  ml  inwertazy  drożdżowej  o  optymalnym 
stężeniu.  Do  szóstej  probówki  zamiast  inwertazy  dodać  0,5  ml  wody.  Próby  umieścić  na 30 
minut  w  temperaturze:  4,  20,  37,  60,  100 

0

C,  a  próbę  kontrolną  w  temperaturze  20

0

C.  Po 

zakończeniu  inkubacji  zalkalizować próby paroma kroplami 1M roztworu NaOH (sprawdzić 
pH  !),  a  następnie  we  wszystkich  mieszaninach  wykonać  próbę  Benedicta.  W  tym  celu  do 
sześciu czystych probówek dodać po 1 ml odczynnika Benedicta i do każdej z nich dodać 0,2 
ml  mieszaniny  reakcyjnej.  Probówki  umieścić  na  ok.  1-2  minuty  we  wrzącej  łaźni  wodnej. 
Zanotować wyniki i zinterpretować je.    
 
Zadanie 3. Wpływ promieniowana UV na aktywność inwertazy z drożdży 
 
Aminokwasy  aromatyczne  występujące  w  białkach  mają  zdolność  do  absorbowania 
promieniowania ultrafioletowego, co powoduje wzrost energii  w obrębie cząsteczki  białka, a 
tym samym zaburzenia w jego strukturze.  
 
Wykonanie: 
 
Na szkiełko zegarkowe wlać 6 ml inwertazy z drożdży i poddać ją naświetlaniu promieniami 
ultrafioletowymi.  Po  czasie  naświetlania:  0  sek.,  10  sek.,  20  sek.,  30  sek.,  1  min.,  2  min.,  3 
min., 4 min. pobierać do kolejnych probówek po 0,5 ml roztworu inwertazy  i do wszystkich 
ośmiu  prób  dodać  0,5  ml  roztworu  sacharozy  w  buforze  octanowym  o  pH  4,7.  Próby 
wymieszać  i  umieścić  na  30  minut  w  temperaturze  pokojowej.  Po  tym  czasie  zalkalizować 
próby  paroma  kroplami  1M  roztworu  NaOH.  Następnie  we  wszystkich  mieszaninach 
wykonać  próbę  Benedicta.  W  tym  celu  do  ośmiu  czystych  probówek  dodać  po  1  ml 
odczynnika  Benedicta  i  do  każdej  z  nich  dodać  0,2  ml  mieszaniny  reakcyjnej.  Probówki 
umieścić na ok. 1-2 minuty we wrzącej łaźni wodnej. Zanotować wyniki i zinterpretować je.