2011-03-24
1
Praktyczna Nauka Zawodu
Biochemia
Metody
Kinetyczne
2010/2011
Rok III semestr letni
Mgr Sylwia Płaczkowska, Mgr Izabela Kokot
ZPNZA AM Wrocław
Rodzaj metody pomiarowej
•
Sygnał uzyskany w reakcji pomiarowej może być mierzony
dwoma sposobami:
•
- w metodach punktu końcowego tzw.: end-point mierzony
jest poziom sygnału pomiarowego wytwarzanego przez
produkt reakcji wskaźnikowej, który jest proporcjonalna do
ilości badanego związku.
•
- w metodach typu „test spektrofotometryczny, kinetyczny”
mierzona jest zmiana sygnału pomiarowego w czasie, a
różnica poziomu sygnału pomiędzy punktami pomiarowymi
jest proporcjonalna do stężenia lub aktywności badanego
związku.
Źródło: Podstawy diagnostyki laboratoryjnej. Akademia Medyczna im. Piastów Śląskich
Wrocław 2010r.
Rodzaj metody pomiarowej
Rodzaj metody pomiarowej
Zasada metod kinetycznych
•
W metodach kinetycznych śledzimy zmianę
absorbancji w czasie pomiaru, która
odzwierciedla ubytek lub przyrost substratu lub
produktu w czasie przebiegu reakcji.
•
Z różnicy absorbancji na początku i końcu reakcji
wyznaczamy stężenie badanego związku,
•
Na podstawie zmiany absorbancji na minutę
pomiaru wyznaczamy szybkość reakcji i pośrednio
aktywność oznaczanych enzymów.
Zasada metod kinetycznych
ODCZYNNIK
SUROWICA
WIELOKROTNY POMIAR
SYGNŁU
O
Ś
CZASU
INKUBACJA
FAZA
WST
Ę
PNA
FAZA ODCZYTU SYGNAŁU
2011-03-24
2
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0
20
40
60
80
100
120
czas pomiaru
a
b
s
o
rb
a
n
c
ja
Przebieg testu kinetycznego
Zasada metod kinetycznych
Przy maksymalnym wysyceniu enzymu
substratem w określonej jednostce czasu
przybywa tyle samo produktu. W efekcie daje
to przyrost absorbancji o stałą wartość w
określonej jednostce czasu.
Rodzaj krzywej kalibracyjnej
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0
10
20
30
40
50
60
70
Test kinetyczny/fix-time
Δ
A
(
a
b
so
rb
a
n
cj
i)
/m
in
.
Aktywność/Stężenie
Obliczanie faktora
- na podstawie krzywej wzorcowej,
która dla metod kinetycznych jest zależnością
szybkości reakcji (ΔA/min.) od aktywności
badanego enzymu.
W metodach rutynowych oznaczania aktywności
enzymów jest ona praktycznie nie stosowana ze
względu na nietrwałość i wysoki koszt wzorców.
Obliczanie faktora
- na podstawie molowego współczynnika absorpcji
dla produktu lub substratu reakcji wskaźnikowej
MOLOWY WSPÓŁCZYNNIK ABSORPCJI ε
to absorbancja roztworu zawierającego 1
mol/l barwnego związku zmierzona w
kuwecie o grubości 1 cm.
Molowy współczynnik absorbcji
W praktyce molowy współczynnik absorpcji
wyznacza się dla roztworów rozcieńczonych o
stężeniu rzędu mili- lub mikromoli na litr,
ponieważ pomiar absorbancji dla roztworu o
stężeniu rzędu moli na litr jest technicznie
niemożliwy.
2011-03-24
3
Obliczanie faktora
F =
Gdzie:
F - faktor
V
K
- objętość końcowa w ml
V
P
– objętość początkowa w ml
ε – współczynnik molowy dla mierzonego barwnego produktu
1000 – współczynnik dla przeliczenia objętości z ml na litry
1
1000
⋅
⋅
⋅
P
K
V
V
ε
Jednostka aktywności enzymów
Konieczność podawania zmiany absorbancji na
minutę, nawet
jeśli
pomiary absorbancji
prowadzone są
w
czasie dłuższym
oraz
wyliczenie
faktora,
który
odnosi
się
do
objętości litra badanego materiału wynika z
definicji
międzynarodowej
jednostki
aktywności IU.
Metodyka Fix-Time
(metody substratowe)
•
Metodyka tych pomiarów jest identyczna jak
dla metod kinetycznych, wartością oznaczaną
nie jest jednak szybkość reakcji, lecz zmiana
absorbancji.
•
Pomiary absorbancji wykonywane są
dwukrotnie; pierwszy raz na początku i drugi
raz na końcu read time
Metodyka Fix-Time
(metody substratowe)
Etapy testu kinetycznego
•
Każdy test kinetyczny składa się z dwóch faz:
•
- faza wstępna (
lag time
), w czasie której reakcja
pomiarowa osiąga V max; jest to czas od chwili
dodania do odczynników materiału badanego, aż
do momentu rozpoczęcia pomiarów
•
- faza pomiarowa (
read time
), w której w
określonych odstępach czasowych dokonywane
są pomiary absorbancji, na podstawie których
obliczana jest szybkość reakcji.
0
5
10
15
20
240
260
280
300
320
340
360
380
400
420
długo
ś ć
fali
a
b
s
o
rb
a
n
c
ja
NAD
NADH+H
TEST OPTYCZNY WARBURGA
