7-8.indd

305

Nr 7–8

PRACE ORYGINALNE

ORIGINAL PAPERS

WIADOMOŚCI LEKARSKIE 2007, LX, 7–8

Małgorzata Barańska, Jadwiga Skrętkowicz

PERSPEKTYWY TERAPII GENOWEJ

Z Zakładu Farmakogenetyki Uniwersytetu Medycznego w Łodzi

W ciągu ostatnich lat obserwuje się znaczący rozwój strategii terapii genowej. Badania nad terapią genową prowadzone są dwukierunkowo

i polegają na: 1) zastąpieniu w komórkach somatycznych organizmu wadliwie działających genów ich sprawnymi kopiami oraz 2) blokowaniu

biosyntezy wadliwych produktów białkowych poprzez zmiany ekspresji genów. Terapeutyczne geny dostarczane są do komórek za pomocą

swoistych nośników, zwanych wektorami. Obecnie wykorzystuje się głównie wektory retrowirusowe i adenowirusowe, choć zastosowanie

znajduje również plazmidowy DNA. Liczba protokołów badań klinicznych terapii genowej wciąż rośnie. Dotyczą one przede wszystkim

chorób nowotworowych, wrodzonych defektów genetycznych oraz chorób układu sercowo-naczyniowego. Duże nadzieje wiąże się z zasto-

sowaniem terapii genowej w leczeniu chorób o podłożu autoimmunologicznym, głównie za pomocą blokowania ekspresji cytokin biorących

udział w procesach zapalnych lub neutralizowaniu ich receptorów. Odkryte ostatnio zjawisko interferencji RNA (RNA interference – RNAi)

zapoczątkowało badania nad hamowaniem ekspresji wybranych genów przez małe interferujące RNA (small interfering RNA – siRNA).

Mimo znaczącego postępu metodologicznego, zapewnienie pełnego bezpieczeństwa terapii genowej jest wciąż wyzwaniem wymagającym

dalszych intensywnych badań. [Wiad Lek 2007; 60(7–8): 305–311]

Słowa kluczowe: terapia genowa, nowotwory, choroby układu sercowo-naczyniowego, choroby autoimmunologiczne.

W każdej z komórek organizmu człowieka znajduje

się kilkadziesiąt tysięcy genów. Zapisana w nich infor-

macja odczytana przez komórkę decyduje o działaniu

całego organizmu. Produktem, który kodują geny, są

najczęściej białka odpowiadające za poprawną budowę

i funkcjonowanie komórek. Jeśli białko nie działa prawi-

dłowo, zwykle winny jest wadliwy gen, który przekazał

złą instrukcję jego wytwarzania. Dokonany w ostatnich

latach postęp techniczny w genetyce molekularnej umoż-

liwia izolację, klonowanie i sekwencjonowanie genów

pochodzących z organizmu człowieka. Umiejętność

mapowania ludzkich genów, zwłaszcza tych, które są

odpowiedzialne za zaburzenia dziedziczne, w przypad-

ku wielu chorób pozwala dokładnie i niedwuznacznie

identyﬁkować genetyczne przyczyny chorób. Nasuwa

się pytanie o możliwość i wykorzystanie metod gene-

tycznych do leczenia lub poprawienia jakości życia osób

ze zdiagnozowaną chorobą dziedziczną. Jedną z metod

dających takie możliwości jest przeprowadzenie terapii

genowej, czyli izolowania potrzebnego genu i wprowa-

dzenia go do komórek osób dotkniętych chorobą. Warto

zwrócić uwagę, że nie jest to leczenie samych tylko

objawów – terapia genowa usuwa bowiem źródło proble-

mu. Genoterapia polega na wprowadzeniu syntetycznie

otrzymanego genu, zwanego transgenem, do wnętrza

komórki w celu uzyskania jego ekspresji. Gen ten może

powodować zablokowanie nadmiernej ekspresji danego

genu, zwiększenie jego ekspresji lub modyﬁkację błędu

genetycznego poprzez zmianę ekspresji – uzupełnienie

brakującej lub wadliwej ekspresji.

Terapia genowa narodziła się na początku lat 90.

XX wieku. W 1990 r. w Stanach Zjednoczonych za-

twierdzono jako pierwszą terapię genową ex vivo, próbę

wyznakowania genetycznego limfocytów wydzielanych

z guza litego (tumor inﬁltrating lymphocytes – TIL).

Wprowadzony do limfocytów gen – marker, nadający

limfocytom oporność na neomycynę, pozwolił na śle-

dzenie losów komórek po powtórnym wstrzyknięciu

do organizmu chorego. W następnym etapie rozwoju tej

samej terapii, TIL wyizolowane od 30 pacjentów chorych

na czerniaka, transfekowano in vitro genami kodującymi

czynnik martwicy nowotworów (tumor necrosis factor

– TNF) i interleukinę 2. Uzyskano statystycznie istotne

zmniejszenie guzów. Historycznie drugą terapią genową

była próba leczenia dzieci chorych na ciężki złożony

zespół niedoboru odporności (severe combined immu-

nodeﬁciency – SCID) związany z brakiem deaminazy

adenozyny (adenosine deaminase – ADA) – enzymu

uczestniczącego w katabolizmie puryn. Do krwiobiegu

tych pacjentów wprowadzono limfocyty transfekowane

wektorem retrowirusowym z genem ADA. Uzyskano

odporność na antygeny, normalizację limfocytów i po-

jawienie się przeciwciał. Ze względu na ograniczoną

żywotność limfocytów T, skuteczność terapii jest więk-

sza, jeśli pacjenci poddawani są zabiegowi wszczepiania

modyﬁkowanych limfocytów co kilka miesięcy [1].

306

Nr 7–8

M. Barańska, J. Skrętkowicz

Obecnie badania nad terapią genową prowadzone są

dwukierunkowo i polegają na: 1) zastąpieniu w komór-

kach somatycznych organizmu wadliwie działających

genów ich sprawnymi kopiami; w ten sposób mogą być

leczone choroby genetyczne będące wynikiem mutacji

jednego genu, takie jak: mukowiscydoza, hemoﬁlie A

i B, dystroﬁa mięśniowa Duchenne’a, SCID, rodzinna hi-

percholesterolemia, fenyloketonuria, anemia sierpowata;

2) wprowadzaniu prawidłowych genów terapeutycznych

w chorobach powstałych w wyniku mutacji wielu genów,

takich jak miażdżyca, choroba Parkinsona, choroby

tkanki łącznej oraz choroby nowotworowe, które mogą

powstawać na skutek nagromadzenia się uszkodzeń

materiału genetycznego [2].

Transfer genów do komórki odbywa się w systemie in

vitro, in vivo i ex vivo za pomocą nośników wirusowych

i niewirusowych. Terapia in vivo polega na wprowadza-

niu genów bezpośrednio do organizmu pacjenta, terapia

ex vivo zaś na pobraniu komórek od pacjenta, dodaniu

do nich odpowiedniego genu w hodowli komórkowej

i wprowadzeniu do organizmu chorego. Terapeutyczne

geny dostarczane są do komórek za pomocą swoistych

nośników zwanych wektorami. Dobry wektor stosowa-

ny w terapii genowej powinien skutecznie przenosić

DNA do docelowych komórek i chronić leczniczy gen

przed zniszczeniem. Ważnym zagadnieniem związanym

z nośnikami genów jest celowana ekspresja genów

w wybranych tkankach docelowych. Wektor stosowany

w celowanej terapii powinien być trwały, nieimmu-

nogenny oraz posiadać zdolność pokonania bariery

krew–guz. Spośród wielu koncepcji przenoszenia

terapeutycznych genów do uszkodzonych komórek

najbardziej obiecująca jest metoda przenoszenia za

pomocą wektorów wirusowych. Wirusy wykorzysty-

wane jako wektory są zmodyﬁkowane, tak aby miały

zdolność infekowania komórek, ale pozbawione były

własności chorobotwórczych i możliwości replikacji.

Pozbawiane są także możliwie największej liczby włas-

nych genów kodujących białka wirusowe, które mogą

wywoływać odpowiedź immunologiczną organizmu

gospodarza. Najczęściej wykorzystywane są wirusy

z grupy adenowirusów, retrowirusów oraz wirusów

adenosatelitarnych (adeno-associated virus – AAV).

Z wektorów adenowirusowych usuwa się geny odpowie-

dzialne za ich właściwości chorobotwórcze, a następnie

przyłącza się geny terapeutyczne. Tak zmodyﬁkowany

wirus wnika do jądra komórki, nie wbudowując się

jednak w chromosomy gospodarza, więc skutki jego

działania nie utrzymują się po kolejnych podziałach

komórkowych. Proces przekształcania retrowirusów

polega na usunięciu genów niosących informację o jego

własnych białkach i enzymach oraz na wprowadzeniu na

to miejsce genu leczniczego. Po zintegrowaniu z DNA

komórki gospodarza wszczepiony gen replikuje wraz

z nim, co skutkuje wytwarzaniem prawidłowego produk-

tu genowego. Wektory konstruowane na bazie wirusów

związanych z adenowirusami są zdolne do przenoszenia

genów terapeutycznych zarówno do komórek somatycz-

nych dzielących się, jak i będących w fazie spoczynku.

Wirusy adenosatelitarne wbudowują się w określone

miejsce na chromosomie 19, nie wywołując objawów

niepożądanych. W celu przenoszenia leczniczych genów

wykorzystywane są również wirusy z rodziny Herpesvi-

ridae (opryszczki). Wirusy te przenoszą duże fragmenty

genów do nie dzielących się komórek, co znalazło za-

stosowanie w leczeniu chorób nowotworowych. W tym

celu próbuje się również wykorzystać wirusy krowianki,

polio czy lentiwirusy. Lentiwirusy to podrodzina retro-

wirusów o cylindrycznym kształcie; mają one zdolność

wnikania do jądra komórki i nie są onkogenne. Wirusy

HIV-1 oraz HIV-2 są najczęściej wykorzystywane jako

wektory lentiwirusowe [3].

Innym typem wektorów są wektory plazmidowe.

Plazmidy są kolistymi cząsteczkami DNA zdolnymi do

replikacji w komórkach gospodarza niezależnej od repli-

kacji chromosomów. Preparaty plazmidowe uzyskuje się

najczęściej metodą lizy zasadowej stransformowanych

bakterii Escherichia coli, a do oczyszczania wykorzy-

stuje się metody chromatograﬁczne. Pozwalają one na

otrzymanie dużych ilości mRNA kodującego białko

terapeutyczne [4]. Poza wymienionymi rodzajami wekto-

rów terapii genowej prowadzone są badania z wykorzy-

staniem transpozonów oraz sztucznych chromosomów.

Transpozony to ruchome elementy genetyczne zdolne

do zmiany miejsca położenia w genomie. Wykorzysty-

wane są do otrzymywania organizmów transgenicznych,

z których wycina się zbędne geny i na ich miejsce

wprowadza się geny terapeutyczne. Istnieje możliwość,

że tak zmodyﬁkowane transpozony będą zdolne do

przenoszenia terapeutycznych genów i ich integracji

z genomem uszkodzonej komórki, w której zajdzie eks-

presja leczniczego genu. Otrzymane niedawno sztuczne

chromosomy ze wstawionym leczniczym genem mogą

przenosić długie sekwencje nukleotydowe bez wytwa-

rzania bariery immunologicznej, zjawiska cechującego

wielokrotne podawanie wektorów wirusowych [3].

Obecnie prowadzone są liczne badania nad możli-

wością wykorzystania zastępczej terapii genowej do

leczenia chorób uwarunkowanych genetycznie. Proto-

koły terapii genowej komórek somatycznych obejmują

m.in.:

– ciężki złożony zespół niedoboru odporności (SCID)

– do limfocytów krążących oraz komórek pnia szpiku

kostnego wszczepiany jest gen deaminazy [5];

– hemoﬁlia B – do limfocytów i ﬁbroblastów skórnych

wszczepiany jest gen czynnika IX [6];

– rodzinna hipercholesterolemia – do hepatocytów

wszczepiany jest gen receptora LDL [7];

– mukowiscydoza – do komórek nabłonka dróg odde-

chowych wszczepiany jest gen kodujący błonowe

307

Nr 7–8

Terapia genowa

białko – regulator przezbłonowego przewodzenia

(cystic ﬁbrosis transmembrane conductance regulator

– CFTR) [8];

– dystroﬁa mięśniowa Duchenne’a – do mioblastów

wszczepiany jest gen kodujący dystroﬁnę [9].

Drugi rodzaj terapii genowej, na którym skupiona jest

obecnie uwaga wielu grup badawczych, to terapia pole-

gająca na blokowaniu biosyntezy wadliwych produktów

białkowych. Hamowanie ekspresji zmutowanych genów

możliwe jest dzięki zastosowaniu technik wykorzystują-

cych antysensowne oligonukleotydy, struktury tripleks,

Z-DNA czy aktywność rybozymów. Terapia antysensu

polega na zablokowaniu ekspresji zmutowanego genu

za pomocą krótkich, syntetycznych odcinków komple-

mentarnych oligonukleotydów. Wprowadzony odcinek

antysensownego (komplementarnego) oligo-DNA lub

oligo-RNA ma zdolność łączenia się z cząsteczkami

zmutowanego mRNA będącego produktem transkrypcji

uszkodzonych genów. Skutkiem tych procesów jest blo-

kowanie translacji białek, a co za tym idzie hamowanie

ekspresji zmutowanego genu. Czynniki antysensowne

dostarczane są do komórek albo poprzez wprowadzenie

krótkiego odcinka oligo-DNA lub oligo-RNA komple-

mentarnego do sekwencji, której ekspresja ma zostać

zablokowana, albo za pomocą wektora zawierającego

sekwencję antysensowną, która w wyniku ekspresji

produkuje odpowiednie krótkie odcinki antysensownego

RNA. Terapia genowa z wykorzystaniem struktur tri-

pleksu polega na hamowaniu aktywności genomowego

DNA, na którym zlokalizowane są zmutowane geny,

poprzez łączenie się wprowadzonych oligonukleotydów

z tym dwuniciowym DNA w struktury tripleksowe. Ry-

bozymy to krótkie odcinki RNA o specyﬁcznej sekwencji

zasad, mające zdolność do samotrawienia i enzyma-

tycznego cięcia innych cząsteczek mRNA. Proces ten

zachodzi podczas dojrzewania mRNA i polega na wyci-

naniu z pierwotnego traskryptu intronów. Ta aktywność

skierowana przeciw odpowiednim cząsteczkom RNA

może być stosowana w terapii genowej. Specyﬁczne

cięcie mRNA przez te cząsteczki osłabia lub zapobiega

translacji odpowiednich białek. Rybozymy przenoszone

są do komórek za pomocą wektorów chemicznych (li-

posomów) lub adenowirusowych [2]. Innym rodzajem

struktury wykorzystywanej w blokującej terapii genowej

jest lewoskrętna struktura Z-DNA o nietypowej zygzako-

watej budowie, powstająca podczas transkrypcji RNA.

W USA opracowano przeciwnowotworowy lek, który

łącząc się ze strukturą Z-DNA w rejonie genów kodu-

jących kinazy białkowe hamuje ich aktywność, co ma

wpływ na procesy nowotworowe. Najnowszą techniką

blokującej terapii genowej jest interferencja RNA (RNA

interference – RNAi), nazywana potranskrypcyjnym

wyłączaniem genów. Jest to zjawisko, w którym mała

dwuniciowa cząsteczka RNA (small interfering RNA

– siRNA) indukuje degradację mRNA, co powoduje

blokowanie procesu translacji i ekspresji określonego

genu. Interferencja RNA wykorzystywana jest w komór-

kach jako naturalny mechanizm obrony przed wirusami

wykorzystującymi komórkowe rybosomy do produkcji

własnych białek. W odróżnieniu od leków opartych na

cząsteczkach antysensownego RNA, działanie siRNA

polega na degradacji wielu cząsteczek mRNA, ma

znacznie efektywniejsze i bardziej selektywne działanie

wobec mRNA [10]. Zjawisko to zostało odkryte u roślin,

a dokładnie zbadane i opisane u nicieni. Wyniki badań

okazały się przełomowe w poznaniu regulacji ekspresji

genów, a naukowcy, Fire i Mello, którzy dokonali tych

odkryć, zostali w 2006 r. uhonorowani Nagrodą Nobla

w dziedzinie ﬁzjologii i medycyny. Dzięki temu odkryciu

możliwe jest selektywne wyłączanie genów kodujących

białka biorące udział w procesach doprowadzających

do różnego rodzaju patologii i powstawania komórek

nowotworowych.

Z wykorzystaniem nowoczesnych strategii w terapii

genowej przeprowadzono już wiele badań przedklinicz-

nych oraz prób klinicznych w chorobach zakaźnych,

nowotworowych, neurologicznych, a także w chorobach

układu krążenia i autoimmunologicznych. Techniki

antysensu stosowane są m.in.:

– w leczeniu chorób wątroby – w ten sposób hamowana

jest replikacja wirusa żółtaczki typu B, a zastosowanie

antysensownego czynnika wobec mRNA dla czynni-

ka wzrostowego transformującego β (transforming

growth factor β – TGF-β) powoduje hamowanie

rozwoju raka wątroby [11];

– blokowanie techniką antysensu mRNA produkcji

cząsteczek międzykomórkowej adhezji komórkowej

(intracellular adhesion molecule 1 – ICAM-1) oraz

nabłonkowego czynnika wzrostu naczyń (vascular

endothelial growth factor – VEGF) może zahamować

procesy odrzucania przeszczepu [12];

– w leczeniu raka trzustki – powodują spadek aktyw-

ności lipooksygenazy i cyklooksygenazy, co hamuje

proliferację komórek nowotworowych [13];

– w terapii raka piersi – antysens mRNA dla katepsyny

powoduje spadek poziomu katepsyny D, co hamuje

procesy nowotworowe [14].

Rybozymy wykorzystywane są w genoterapii cho-

rób wirusowych; blokuje się w ten sposób namnażanie

wirusa brodawczaka ludzkiego (human papilloma virus

– HPV), czynnika prowadzącego do transformacji nowo-

tworowej, w wyniku której dochodzi do powstania raka

skóry, sromu i ust [15]. Obecnie trwają badania kliniczne

I oraz II fazy nad wykorzystaniem metody wyciszania

genów [10]: w okulistyce w leczeniu starczego zwyrod-

nienia plamki żółtej (age-related macular degeneration

– AMD), w leczeniu wirusowych infekcji górnych dróg

oddechowych, w chorobach nowotworowych i meta-

bolicznych oraz w przezwyciężeniu oporności wielo-

lekowej poprzez zahamowanie ekspresji białka MDR1

308

Nr 7–8

(multidrug resistance) lub wyciszenie genu kodującego

surwiwinę.

Wiele badań nad blokującą terapią genową dotyczy

zespołu nabytego upośledzenia odporności (acquired

immune deﬁciency syndrome – AIDS). Wykazano, że

hamowanie replikacji wirusa HIV-1 atakującego lim-

focyty CD4+ polega na inaktywacji RNA kodującego

białka wirusa, jak też ważnych dla cyklu życiowego

wirusa białek komórki. Stosuje się w tym celu strategie

antysensu, rybozymów i wyciszania przez interferen-

cyjny RNA [16].

Ponad 60% prób klinicznych terapii genowej dotyczy

leczenia chorób nowotworowych. Opierają się one na

ingerencji w proces rozwoju nowotworu, polegający

na aktywacji onkogenów i inaktywacji genów przeciw-

nowotworowych. Docelowymi komórkami w terapii

genowej nowotworów mogą być: komórki nowotworo-

we, limfocyty (dla wywołania cytotoksyczności w sto-

sunku do komórek guza), ﬁbroblasty (indukcja produkcji

czynników toksycznych dla komórek guza oraz dla

wywołania cytotoksyczności) oraz komórki śródbłonka

naczyniowego (terapia antyangiogenna).

Niszczenie bezpośrednie komórek nowotworo-

wych polega na zastosowaniu genów samobójczych

kodujących enzymy umożliwiające przekształcenie

nieaktywnego związku chemicznego w substancję ak-

tywną, powodującą śmierć komórki lub prowadzącą do

uwrażliwienia komórki na chemioterapię lub radioterapię

[17]. Zastosowanie genów immunomodulujących polega

na wprowadzeniu genów kodujących cytokiny mobili-

zujące układ immunologiczny do swoistego niszczenia

komórek nowotworowych. Prowadzone są badania nad

wprowadzeniem lokalnie do komórek rakowych lub

do limfocytów naciekających guz genów kodujących

interleukinę 2 (IL-2), IL-12, IL-4 oraz czynnik mart-

wicy nowotworu α (tumor necrosis factor α – TNF-α).

Cytokiny te działają przeciwnowotworowo poprzez

aktywację cytotoksycznych limfocytów i makrofagów

[12]. Za pomocą inhibicji ekspresji genu dla TGF-β udało

się zahamować rozwój raka wątroby [11]. Trzeci rodzaj

genów stosowanych w próbach terapii nowotworów

to geny hamujące powstawanie naczyń krwionośnych

w guzach pierwotnych i przerzutach, co prowadzi do

zahamowania ich wzrostu. Przyjmuje się, że guzy lite bez

sieci powstających naczyń krwionośnych nie są w stanie

przekroczyć kilku milimetrów sześciennych. Proces an-

giogenezy jest wieloetapowy i składa się na niego wiele

czynników pobudzających oraz hamujących unaczynie-

nie. W antyangiogennej terapii genowej stosuje się: geny

wpływające na zahamowanie ekspresji genu VEGF (ko-

dujące białko p53, antysens mRNA), geny powodujące

wiązanie VEGF (kodujące zmodyﬁkowane receptory

czynników wzrostu) oraz geny powodujące hamowanie

proliferacji komórek śródbłonkowych (kodujące czynnik

płytkowy 4, angiostatynę, endostatynę).

Zaletą antyangiogennej terapii genowej jest jej uni-

wersalność, polegająca na możliwości zastosowania tych

samych genów terapeutycznych dla różnych guzów, brak

efektów ubocznych i objawów klasycznej oporności na

cytostatyki [17,18]. Prowadzone są również badania

nad genami proapoptotycznymi. Strategia ta polega na

niszczeniu komórek nowotworowych poprzez induko-

wanie w nich śmierci mającej cechy apoptozy. Apoptoza

– programowana śmierć komórki, jest podstawowym

procesem eliminowania uszkodzonych komórek, nie-

zdolnych do naprawienia różnego rodzaju defektów.

Komórki nowotworowe są oporne na większość sygna-

łów indukujących apoptozę i nie wchodzą w nią pomimo

uszkodzeń DNA i sygnałów otrzymywanych od innych

komórek. Przyczyną tego zjawiska mogą być mutacje ge-

nów kodujących białka biorące udział w regulacji apop-

tozy. Zmniejszeniu ekspresji genów proapoptotycznych

towarzyszy zazwyczaj nadekspresja genów kodujących

inhibitory apoptozy. Najczęściej stosowanymi genami

proapoptotycznymi są geny kodujące białka indukują-

ce apoptozę: bax, Blc-Xs, Bim, Bak. Strategia genów

i białek proapoptotycznych umożliwia zastosowanie

terapii skojarzonej z radioterapią lub chemioterapią, co

może polepszyć efekty terapeutyczne tych metod [19].

Ostatnie doniesienia mówią o wykorzystaniu genów

w leczeniu czerniaka złośliwego. Zespół naukowców

z USA opracował metodę modyﬁkacji receptorów rozpo-

znających komórki nowotworowe, znajdujących się na

powierzchni limfocytów T. Od chorych z zaawansowaną

postacią czerniaka izolowano limfocyty T, następnie

transfekowano je za pomocą nośnika retrowirusowego

genem wzbudzającym ekspresję białka receptorowego

MART-1 (melanoma antigen recognized by T cells) na

ich powierzchni. Dzięki temu receptorowi limfocyty T

są zdolne do rozpoznania komórek rakowych i ich zabi-

cia. Po tej modyﬁkacji limfocyty podawano chorym. Po

kilku miesiącach u 2 chorych zaobserwowano regresję

nowotworu i osoby te uznano za zdrowe. U 15 chorych

regresja nie nastąpiła, 10% komórek nowotworowych

z nieznanych przyczyn nie zostało zniszczonych przez

zmodyﬁkowane limfocyty T [20]. Zespół naukowców

pracujących nad tym rodzajem terapii genowej ma jed-

nak nadzieję, że uda się opracować podobną modyﬁkację

limfocytów T zdolną do niszczenia innych rodzajów

nowotworów. W Polsce najbardziej zaawansowane

prace nad terapią genową nowotworów również doty-

czą czerniaka. W Zakładzie Immunologii Nowotworów

w Poznaniu od kilku lat prowadzi się badania kliniczne

II fazy, polegające na podawaniu chorym na czerniaka

złośliwego z przerzutami modyﬁkowanych genetycznie,

allogenicznych komórek czerniaka. U około 20% chorych

obserwuje się obiektywną odpowiedź kliniczną, u dodat-

kowych 30% zahamowanie rozwoju choroby [21].

Terapia genowa znalazła szerokie zastosowanie w le-

czeniu chorób układu sercowo-naczyniowego. Najwięcej

M. Barańska, J. Skrętkowicz

309

Nr 7–8

badań klinicznych dotyczy terapeutycznej angiogenezy

wykorzystującej geny kodujące białka o charakterze

proangiogennym. Genami, które wprowadza się jako

dodatkowe do komórek niedokrwionego mięśnia ser-

cowego w celu pobudzenia tworzenia nowych naczyń,

są geny kodujące naczyniowy śródbłonkowy czynnik

wzrostu (VEGF) oraz ﬁbroblastyczny czynnik wzrostu

(ﬁbroblast growth factor – FGF). Geny te wprowadza się

głównie za pomocą wektorów plazmidowych lub wiru-

sowych AAV do serca poprzez naczynia wieńcowe lub

bezpośrednimi wstrzyknięciami do mięśnia sercowego.

Zakłada się, że powstające naczynia krwionośne wezmą

udział w tworzeniu krążenia obocznego w niedokrwionej

tkance. W chorobie niedokrwiennej serca genoterapię

stosuje się również w zapobieganiu restenozie poprzez

wprowadzenie genu kodującego śródbłonkową syntazę

tlenku azotu (endothelial nitric oxide synthase – eNOS)

[22], w zapobieganiu niewydolności aortalno-wieńcowej

za pomocą genu kodującego tkankowy inhibitor metelo-

proteaz (tissue inhibitor of metalloproteinase – TIMP)

[23] oraz w stabilizacji blaszki miażdżycowej poprzez

wprowadzenie genu kodującego rozpuszczalną cząstecz-

kę adhezyjną komórek naczyniowych (soluble vascular

cell adhesion molecule – sVCAM) [24].

Na eksperymentalnych modelach niewydolności

serca prowadzone są badania nad modyﬁkacją ekspre-

sji genów kodujących białka regulujące gospodarkę

wapniową w mięśniu sercowym oraz genów, których

funkcjonowanie jest istotne dla przekaźnictwa adrener-

gicznego w niewydolnym mięśniu sercowym [25,26].

Duże nadzieje wiąże się z zastosowaniem terapii

genowej w leczeniu chorób autoimmunologicznych,

głównie za pomocą blokowania ekspresji cytokin biorą-

cych udział w procesach zapalnych lub neutralizowaniu

ich receptorów. W piśmiennictwie spotyka się już prace

dotyczące eksperymentów w tym zakresie. Wszystkie

badania prowadzone są na eksperymentalnych modelach

zwierzęcych tych chorób. Otrzymane wyniki mogą być

przenoszone na patoﬁzjologię ludzką, z pewną ostroż-

nością po uwzględnieniu różnic międzygatunkowych.

Dopiero po długotrwałym i pracochłonnym procesie

potwierdzającym skuteczność terapii modyﬁkującej

ekspresję danego genu możliwe jest podjęcie prób

klinicznych.

Jednym ze schorzeń autoimmunologicznych jest

toczeń rumieniowaty układowy (systemic lupus ery

thematosus – SLE) – układowa choroba tkanki łącznej,

która charakteryzuje się wytwarzaniem autoprzeciwciał,

aktywacją dopełniacza oraz odkładaniem się komplek-

sów immunologicznych w narządach. Wiadomo już, że

za występowanie SLE odpowiedzialna jest kombinacja

różnych genów. W patogenezie tocznia mogą odgrywać

rolę geny mające związek z głównym układem zgod-

ności tkankowej (human leukocyte antigen – HLA),

geny kodujące składowe dopełniacza oraz receptory

wiążące fragment Fc immunoglobuliny G – Fcγ. Wy-

kazano również, że jedną z przyczyn immunologicznej

dysregulacji w przebiegu SLE jest nieprawidłowa eks-

presja genów dla niektórych cytokin: IL-1, IL-6, IL-10,

TNF-α i receptora wiążącego TNF-α oraz interferonu γ

(IFN-γ) [27]. W przypadku SLE przeprowadzenie terapii

genowej jest szczególnie trudne ze względu na różno-

rodność czynników środowiskowych i genetycznych,

biorących udział w patogenezie choroby. Za pomocą

wektorów wirusowych oraz plazmidowych wprowadza

się do organizmu transgeny, które modyﬁkują ekspresję

następujących genów:

– IFN-γ, blokowanie ekspresji, poprawa funkcji nerek

oraz wydłużenie czasu przeżycia;

– TNF-β, zwiększenie ekspresji, złagodzenie procesów

zapalnych zachodzących w nerkach w przebiegu

tocznia oraz wydłużenie czasu przeżycia;

– IL-2, zwiększenie ekspresji, złagodzenie przebiegu

zapalenia nerek oraz zahamowanie procesu prolife-

racji limfocytów;

– IL-12, zwiększenie ekspresji, poprawa funkcji nerek

oraz wydłużenie czasu przeżycia;

– CTLA-4Ig – rekombinowane białko blokujące

kostymulację limfocytów T (CTLA-4 – cytotoxic

T-lymphocyte-associated antigen – antygen 4 związany

z limfocytem cytotoksycznym), zwiększenie ekspre-

sji, zahamowanie procesów zapalnych zachodzących

w nerkach;

– potrójna terapia genowa modyﬁkująca ekspresję

CTLA-4Ig, TCR-α (T-cell receptor α) i TCR-β

– zahamowanie procesów zapalnych zachodzących

w nerkach [28,29].

W dostępnej literaturze brak danych dotyczących

badań nad zastosowaniem terapii genowej w leczeniu

SLE u ludzi. Wymaga to udoskonalenia metod integracji

genów kodujących pożądane białka z genomem ludzkich

komórek.

Kolejnym złożonym schorzeniem, w którego lecze-

niu podejmowane są próby zastosowania genów, jest

reumatoidalne zapalenie stawów (rheumatoid arthritis

– RA) – choroba autoimmunologiczna, o niewyjaśnionej

do końca etiologii oraz patogenezie. Przypuszcza się,

że istotną rolę w patogenezie RA odgrywają czynniki

genetyczne oraz środowiskowe. Doświadczenia mające

na celu zastosowanie terapii genowej prowadzone są na

modelu zwierzęcym RA. Stwierdzono, że indukcja lokal-

nej ekspresji genu dla antagonisty receptora interleuki-

ny 1 (IL-1Ra) powoduje zahamowanie lokalnego pro-

cesu zapalnego zachodzącego w stawie [28,30].

Twardzina układowa (skleroderma) należy do ukła-

dowych chorób tkanki łącznej, które cechuje przewlek-

ły proces zapalny o podłożu autoimmunologicznym.

Charakteryzuje się ona uogólnionym zwłóknieniem

skóry oraz narządów wewnętrznych, co jest efektem

m.in. nadmiernej syntezy i dojrzewania kolagenu [31].

Wyodrębniono 2 postacie twardziny – ograniczoną

Terapia genowa

310

Nr 7–8

oraz układową. W przebiegu twardziny układowej

stwierdza się różnego rodzaju zaburzenia odpowiedzi

immunologicznej, zarówno typu komórkowego, jak

i humoralnego. Ich przejawem jest m.in. obecność prze-

ciwciał przeciwjądrowych (antinuclear antibody – ANA)

w surowicy krwi i płynach ustrojowych. Chociaż mecha-

nizmy indukcji ANA nie są w pełni poznane, zjawisko

autoimmunizacji uważane jest za czynnik biorący istotny

udział w etiologii i patogenezie twardziny układowej.

Wynika to z faktu, że ANA nieomal zawsze (w ponad

95%) stwierdza się u chorych na twardzinę układową

oraz że obserwuje się swoiste dla choroby autoprzeciw-

ciała, których nie stwierdza się w zdrowej populacji.

W przeciwieństwie do tocznia układowego oraz innych

układowych chorób tkanki łącznej, ANA skierowane są

przeciwko jednemu antygenowi. W przebiegu twardziny

dochodzi do masywnego zwłóknienia narządów wewnętrz-

nych oraz zapalenia naczyń. W ostatnich latach podejmo-

wane są próby leczenia sklerodermy za pomocą genów.

Badania prowadzone są na modelu mysim. Po wprowa-

dzeniu genu kodującego HGF (hepatocyte growth factor

– czynnik wzrostu hepatocytów) do mięśni szkieletowych

obserwowano zmniejszenie ekspresji mRNA dla TGF-β1

oraz złagodzenie objawów skórnych twardziny [32].

Najbardziej zaawansowane prace nad terapią genową

w chorobach autoimmunologicznych dotyczą cukrzycy

typu I. Badania polegają na wprowadzaniu do komórek

genów lub ich fragmentów w celu blokowania rozwoju

autoagresji, ochronie komórek β przed apoptozą, wczes-

nej indukcji ekspresji autoantygenów oraz indukcji

mechanizmów zabezpieczających komórki β przed

stresem oksydacyjnym. Próby te prowadzone są na

modelu zwierzęcym autoimmunologicznej cukrzycy.

Wykazano, że blokowanie autoagresji może odbywać

się przez wpływ na funkcję komórek immunokompe-

tentnych za pomocą modyﬁkacji prezentacji antygenu.

Lokalna ekspresja w wyspach trzustkowych IL-4, IL-

-10 oraz podjednostek IL-12 chroni przed naciekaniem

zapalnym wysp, zmniejsza zachorowalność na cukrzycę

i opóźnia ujawnianie się choroby u zwierząt z cukrzycą

doświadczalną. Udowodniono, że hamowanie apoptozy

ludzkich komórek wysp trzustkowych in vitro może być

osiągnięte dzięki wprowadzeniu genu antyapoptotyczne-

go bcl-2 lub genu antagonisty receptora IL-1β. Wczesna

indukcja ekspresji proinsuliny, fragmentów łańcucha β

insuliny oraz niektórych antygenów II klasy HLA w gra-

sicy powoduje eliminację limfocytów autoreaktywnych.

Aktywacja ekspresji dysmutazy ponadtlenkowej i perok-

sydazy glutationu w trzustce znosi toksyczne działanie

rodnika ponadtlenkowego i nadtlenku wodoru na wyspy

trzustkowe, wprowadzenie zaś genu kodującego katalazę

zapobiega uszkodzeniu komórek β [33].

Mimo prowadzonych intensywnie badań nad terapią

genową, wprowadzenie tej metody do leczenia wymaga

jeszcze wielu wysiłków. Stosowane obecnie wektory

nie są doskonałe: niektóre z nich przenoszą geny nie

tylko do komórek docelowych, inne niezbyt wydajnie

transportują DNA, jeszcze inne pobudzają niepożądaną

odpowiedź układu odpornościowego. Idealny wektor

wirusowy powinien mieć wystarczająco dużą zdolność

infekowania komórek, a jego materiał genetyczny

powinien integrować się z DNA gospodarza w ściśle

określonym miejscu, co zapobiegałoby procesom no-

wotworzenia. Działanie transgenów nie jest długotrwałe

i wymaga częstego powtarzania. Do tej pory około 1000

pacjentów objęto próbami z wykorzystaniem terapii ge-

nowej [34]. Oceniana jest toksyczność i bezpieczeństwo

stosowanych metod oraz wyniki kliniczne w postaci

oceny obiektywnych odpowiedzi klinicznych w małych

grupach chorych. Większość stanowią przypadki doty-

czące schorzeń nowotworowych lub chorób wywołanych

mutacją pojedynczego genu. Niewątpliwie sukcesem

jest zastosowanie genów w leczeniu hemoﬁlii B [34],

w której udało się osiągnąć 10% normalnej aktywności

czynnika IX, czy zastosowanie angiogennej terapii

genowej w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych

[22,24]. Oczekuje się, że terapie oparte na metodzie

wyciszania genów (RNAi) okażą się skuteczniejsze

i bezpieczniejsze od terapii bazujących na wprowadzaniu

nowych genów.

Genoterapia może być przeprowadzana u ludzi

jedynie w celach terapeutycznych. Badania mogą być

wykonywane tylko na komórkach somatycznych i wy-

magają ścisłego przestrzegania zasad bezpieczeństwa

obowiązujących dla protokołów dotyczących manipula-

cji genetycznych. W większości krajów zostały powołane

zespoły naukowców kontrolujące tego typu eksperymen-

ty. W Polsce terapią genową zajmuje się Komisja Ety-

ki Polskiej Akademii Umiejętności oraz Komitet Etyki

w Nauce Polskiej Akademii Nauk.

Potencjał badań nad terapią genową jest znaczny

i obecne postępy wskazują wyraźnie, że istnieje moż-

liwość opracowania skutecznego sposobu leczenia nie-

których chorób. Badania te dostarczają również wielu

nowych informacji o istotnym znaczeniu biologicznym.

Zaawansowane prace prowadzone przez ﬁrmy farma-

ceutyczne, zwłaszcza nad techniką wyłączania genów,

pozwolą prawdopodobnie na opracowanie skutecznego

leku stosowanego w terapii wielu chorób. Terapia geno-

wa będzie, być może, w nadchodzących latach szeroko

dostępna, bezpieczna i skuteczna, stanowiąc uzupeł-

nienie w leczeniu chirurgicznym, radiologicznym oraz

preparatami konwencjonalnymi.

M. Barańska, J. Skrętkowicz

311

Nr 7–8

Piśmiennictwo

[1] Fikus M. Nowy wspaniały świat biotechnologii. W: Genetyka molekularna. Red. Węgleński P. Wydawnictwo Naukowe PWN. Warszawa 2002, 438–474.

[2] Kazula A. Wykorzystywanie nowoczesnej strategii w terapii genowej. Farm Pol 2004; 60: 736–756. [3] Kazula A. Wektory terapii genowej. Część 2. Farm

Pol 2003; 59: 297–309. [4] Małecki M. Preparaty plazmidowe w terapii genowej. Współcz Onkol 2004; 8: 321–327. [5] Cavazzana-Calvo M, Hacein-Bey S,

Yates F, de Villartay JP, Le Deist F, Fischer A. Gene therapy of severe combined immunodeﬁciencies. J Gene Med 2001; 3: 201–206. [6] VandenDriessche T,

Collen D, Chuah MK. Gene therapy for the hemophilias. J Thromb Haemost 2003; 1: 1550–1558. [7] Cheng SH, Smith AE. Gene therapy progress and prospects:

gene therapy of lysosomal storage disorders. Gene Ther 2003; 10: 1275–1281. [8] Moss RB, Rodman D, Spencer LT, Aitken M, Zeitlin PL, Waltz D, Milla C,

Brody AS, Clancy JP, Ramsey B i wsp. Repeated adeno-associated virus serotype 2 aerosol-mediated cystic ﬁbrosis transmembrane regulator gene transfer to the

lungs of patients with cystic ﬁbrosis: a multicenter double-blind, placebo-controlled trial. Chest 2004; 125: 509–521. [9] van Deutekom JC, van Ommen GJB.

Advances in Duchenne muscular dystrophy gene therapy. Nat Rev Genet 2003; 4: 774–783. [10] Majorek M, Guzenda P, Lamparska-Przybysz M, Wieczorek M.

Krótkie interferujące RNA w onkologii. Współcz Onkol 2006; 10: 367–372.

[11] Prosser CC, Yen RD, Wu J. Molecular therapy for hepatic injury and ﬁbrosis: where are we? World J Gastroenterol 2006; 12: 509–515. [12] Wojda U. Terapia

genowa komórek układu krwiotwórczego: rozwój strategii i wektorów. Post Biol Kom 2004; 31: 245–258.

[13] Ding XZ, Tong WG, Adrian TE. Cyclooxygenases

and lipoxygenases as potential tergets for treatment of pancreatic cancer. Pancreatology 2001; 1: 291–299. [14] Glondu M, Liaudet-Coopman E, Derocq D,

Platet N, Rochefort H, Garcia M. Down-regulation of cathepsin-D expression by antisense gene transfer inhibits tumor growth and experimental lung metastasis

of human breast cancer cells. Oncogene 2002; 21: 5127–5134. [15] Alvarez-Salas LM, Cullinan AE, Siwkowski A, Hampel A, DiPaolo JA. Inhibition of HPV-16

E6/E7 immortalization of normal keratinocytes by hairpin ribozymes. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 1189–1194. [16] Fanning G, Amado R, Symonds G.

Gene therapy for HIV/AIDS: the potential for a new therapeutic regimen. J Gene Med 2003; 5: 645–653. [17] Wilczyńska U, Szary J, Szala S. Antyangiogenna

terapia genowa. Współcz Onkol 1999; 4: 139–142. [18] Małecki M, Gromek K, Przybyszewska M, Janik P. Plazmidowy wektor ekspresyjny kodujący receptor

sFLT-1 (psFLT-1) ogranicza angiogenezę i wzrost guzów L1. Współcz Onkol 2006; 10: 145–151. [19] Mitrus I, Missol-Kolka E, Szala S. Geny proapoptotyczne

w terapii genowej nowotworów. Współcz Onkol 2001; 5: 242–249. [20] Kaiser J. Building a Better Tumor Killer. Science Now 2006; 283: p3-3.

[21] Nawrocki S, Mackiewicz A. Terapia genowa nowotworów wyzwaniem XXI wieku. Współcz Onkol 2000; 4: 190–194. [22] Dulak J, Zagórska A, Wegiel B,

Loboda A, Józkowicz A. New strategies for cardiovascular gene therapy: regulatable pre-emptive expression of pro-angiogenic and antioxidant genes. Cell Biochem

Biophys 2006; 44: 31–42. [23] Dzida G, Hanzlik J. O najbliższych perspektywach terapii genowej chorób układu krążenia. Kardiol Pol 2002; 56: 470–472. [24]

Kołust P, Małecki M, Żelazny P, Teresińska A, Firek B, Janik P, Religa Z. Terapia genowa choroby wieńcowej plazmidem phVEGF165. Wyniki wczesne. Kardiol

Pol 2003; 59: 378–383.

[25] Leszek P. Terapia genowa w niewydolności serca – modyﬁkacja obiegu wapnia. Pol Przegl Kardiol 2004; 6: 319–328. [26] Leszek P.

Terapia genowa w niewydolności serca. Modyﬁkacja aktywacji adrenergicznej – rzeczywistość czy mit? Pol Przegl Kardiol 2004; 6: 15–22. [27] Skrętkowicz J,

Skrętkowicz-Szarmach K, Rychlik-Sych M. Genetyczne uwarunkowania w patogenezie tocznia rumieniowatego układowego. Reumatologia 2004; 42: 567–572.

[28] Piccirillo CA, Prud’homme GJ. Immune modulation by plasmid DNA-mediated cytokine gene transfer. Curr Pharm Des 2003; 9: 83–94. [29] Fujio K,

Okamoto A, Tahara H, Abe M, Jiang Y, Kitamura T, Hirose S, Yamamoto K. Nukleosome-speciﬁc regulatory T cells engineered by triple gene transfer supress

a systemic autoimmune disease. J Immunol 2004; 173: 2118–2125. [30] Abramson SB, Amin A. Blocking the effects of IL-1 in rheumatoid arthitis protects bone

and cartilage. Rheumatology 2002; 41: 927–980.

[31] Puszczewicz M. Przeciwciała przeciwjądrowe w twardzinie układowej – charakterystyka antygenowa i znaczenie kliniczne. Reumatologia 2006; 44:

169–175. [32] Wu MH, Yokozeki H, Takagwa S, Yamamoto T, Satoh T, Kaneda Y, Katayama I, Nishioka K. Hepatocyte growth factor both prevents and ameliorates

the symptoms of dermal sclerosis in a mouse model of scleroderma. Gene Ther 2004; 11: 170–180. [33] Krętowski A. Perspektywy leczenia przyczynowego

cukrzycy typu 1. Diabetol Klin Dośw 2003; 3: 475–480. [34] Ponder KP. Gene therapy for hemophilia. Curr Opin Hematol 2006; 13: 301–307.

Adres autorów: Małgorzata Barańska, Zakład Farmakogenetyki UM, ul. Muszyńskiego 1, 90-151 Łódź

M. Barańska, J. Skrętkowicz

PROSPECTS OF GENE THERAPY

Summary

In recent years extensive development of gene therapy strategies has been observed. The studies on gene therapy focus on two different

research methods. The ﬁrst one concerns replacement of damaged genes in somatic cells of the organism by correcting genes. Application of

modern methods of gene therapy permits to treat a disease already at the molecular level. Therefore, the second method deals with modiﬁ-

cation of gene expression or obstruction of pathogenic biosynthesis of proteins. Correct genes are introduced to cells by special vectors. The

retroviral and adenoviral vectors are most frequently used clinically but very often the plasmid DNA is also useful. The number of clinical

trials has been rapidly increasing. Cancer, monogenic diseases and cardiovascular diseases are the main targets of clinical gene therapy. Many

hopes are linked with the gene therapy of autoimmune diseases in particular by blocking expression of inﬂammatory cytokines or neutralising

cytokine’s receptors. Recently discovered phenomenon of interference of RNA (RNAi) has initiated research on inhibition of selected gene

expression by using small interfering RNA (siRNA). Despite the signiﬁcant methodological progress, allowing safe gene therapy still represents

a challenge and requires further intensive research.

Key words: gene therapy, cancer, cardiovascular diseases, autoimmune diseases.

Terapia genowa