Replikacja DNA.  

Amplifikacja DNA in vitro. 

CYKL KOMÓRKOWY: 

 
 
G0 – faza spoczynkowa, w której komórka nie ulega podziałom 
G1 – faza przerwy, przygotowanie do replikacji 
S – 

synteza DNA 

G2 - przerwa 
M - mitoza 

Inicjacja replikacji 

 
Replikon – każdy odcinek DNA, który replikuje się jako pojedyncza jednostka, 
komórka ssaka – 50 000 – 100 000 replikonów  
Prokariota – koliste DNA stanowi 1 replikon  
 
 
 

Synteza DNA w kierunku  5’       3’ 
 
Polimeraza nie rozpoczyna syntezy od pierwszego nukleotydu tylko wydłuża nić już 
istniejącą 
 
Konieczność syntezy krótkich sekwencji tzw. startery, które później są usunięte 
 

Helikaza – rozplata helisę, białka SSB zapobiegają jej odtworzeniu 
 
Polimeraza DNA: 
Prokariota – 2 polimerazy DNA 
Eukariota – 5 polimeraz DNA 
 
 
Nić wiodąca – syntetyzowana w sposób ciągły 
 
 
Nić opóźniona – rozpoczyna się z opóźnieniem, tworzą się fragmenty Okazaki  
 
 
 

Replikacja telomerów – końce liniowych chromosomów nie mogą być w pełni zreplikowane 
 
Telomery: (TTAGGG)n 
 
Enzym telomeraza – zawiera krótką cząsteczkę RNA, która działa jako matryca do syntezy 
powtórzeń na wystającym końcu 3’ 
 
W komórkach somatycznych aktywność telomerazy jest hamowana – skracanie 
chromosomów, w komórkach rakowych może ulec reaktywacji 

1 błąd na 10

6

 – 10

8

 nukleotydów 

 
Aktywność egzonukleazy 3’ -> 5’ 

Wierność replikacji 

• Jedna z najważniejszych metod badawczych w 

biologii molekularnej 

• Metoda ta pozwala amplifikować fragmenty DNA  
• Opracowana w 1987 r – autor K. Mullis otrzymał 

w 1993 r nagrodę Nobla w dziedzinie chemii 

PCR (Polymerase Chain Reaction) 

PCR (Łańcuchowa Reakcja Polimerazy) 

Naśladuje zachodzącą in vivo replikację DNA  

i wymaga następujących składników reakcji: 

• matrycy DNA 
• starterów komplementarnych do końców 

wybranej sekwencji DNA 

• czterech trójfosforanów deoksynukleotydów 

(dNTP) 

• termostabilnej polimerazy DNA 
• jonów Mg

2+ 

Cykl reakcji PCR obejmuje następujące po 

sobie 3 etapy: 

• denaturacja dupleksu DNA w temp. 92

o

C – 96

o

C 

 
• hybrydyzacja starterów do komplementarnych miejsc na matrycy w 

temp. 37

o

C – 65

o

C 

 
• wydłużanie startera przez dosyntetyzowanie dNTP przy udziale 

polimerazy DNA w temp. 72

o

C 

 

     

W wyniku PCR liczba cząsteczek DNA rośnie w postępie geometrycznym (po 
każdym cyklu ich liczba ulega podwojeniu). Po zakończeniu około 30 cykli liczba 
kopii DNA przekracza 

kilka milionów

. 

Reakcję  PCR  przeprowadza  się  w  bloku  grzejnym  zwanym 
termocyklerem,  gdzie  ustawia  się  temperaturę  i  czas 
poszczególnych  cykli.  Wśród  prób  do  reakcji  PCR 
przygotowuje się także kontrolę dodatnią i ujemną w celu 
sprawdzenia prawidłowości przebiegającej reakcji.  

 

Czynniki wpływające na PCR 

• Matryca zdegradowana lub zanieczyszczona 

• Niedobór lub nadmiar polimerazy 

• Stężenie i sekwencja starterów 

• Temperatura przechowywania odczynników 

Modyfikacje metody PCR 

• Nested PCR (wewnętrzny) 
• RT-PCR  
• PCR-RFLP (polimorfizm długości fragmentów 

restrykcyjnych) 

• Real-time PCR (w czasie rzeczywistym) 
• Multiplex PCR 
• Qantititative PCR (ilościowy) 
• Competitive PCR (konkurujący) 
• Touch-down PCR (hamowany) 
• RAPD-PCR (losowa amplifikacja polimorficznego DNA) 
• Booster PCR (regulowany) 
• Race PCR 

Nested - PCR (wewnętrzny) 

•

Dwie pary starterów: 



 Pierwsza para zewnętrzna 



 Druga para wewnętrzna 

•

Amplifikacja DNA jest dwuetapowa 

•

Dzięki użyciu dwóch par starterów zwiększona specyficzność i czułość metody 

PCR ilościowy w czasie rzeczywistym (Real-Time PCR) 

Detektory niespecyficzne - cząsteczki fluorochromu emitujące światło o określonej długości 
po związaniu z dsDNA (np bromek etydyny, SYBR Green). Najprostsza i najmniej kosztowna 
metoda, ale podatna na błędy. Specyficzne - startery lub sonda wyznakowana 
fluorescencyjnie np  TaqMan  

RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) 

SSCP PCR 

(single stranded conformation polymorphism) 

Do wstępnej identyfikacji mutacji punktowych. 
 
1. Amplifikacja danego fragmentu 
2. Denaturacja 
3. Elektroforeza  

 

• Zmiana właściwości fizyko-chemicznych DNA spowodowana 
różnicami składu nukleotydowego 
• Wykorzystanie różnic mobilności cząsteczek w żelu 
• Nawet pojedyncza mutacja może powodować zmiany konformacji, 
co skutkuje zmianą mobilności DNA 

RAPD PCR 

(random amplified polymorphic DNA) 

• Losowe namnażanie sekwencji, stosowany jeden krótki starter,  większa liczba cyki 
 
• Starter wiąże się z genomowym DNA w wielu miejscach, po amplifikacji na żelu 
charakterystyczny układ prążków („odcisk palca”) 

PGD Diagnostyka preimplantacyjna 

 

Pozwala na genetyczną analizę komórek jajowych przed zapłodnieniem bądź też zarodków 
przed implantacją metodą wspomaganego rozrodu.  

Zastosowanie techniki PCR 

DIAGNOSTYKA MIKROORGANIZMÓW (JAKOŚCIOWA I ILOŚCIOWA): 

 

 

zakażenia bakterią:  Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Mycobacterium 

tuberculosis, Borrelia burgdorferii 

 

 

 

 

pierwotniakiem Toxoplasma gondii 
 

 

wirusem HIV, CMV (cytomegalia), Herpes simplex, zapalenia wątroby typu B (HBV),  

typu C (HCV) 
 

DIAGNOSTYKA CHORÓB NOWOTWOROWYCH: 

 

 

mutacja w genach BRCA1 i BRCA2  
 

 

ryzyko nowotworowe - mutacje genów kodujących białka naprawcze, odpowiedzialne za 

nadwrażliwość na estrogeny  
 

 

zagrożenia nowotworem szyjki macicy – wykrywanie wirusa HPV (wirus brodawczaka 

ludzkiego) 
 

DIAGNOSTYKA CHORÓB GENETYCZNYCH 

 

•

mukowiscydoza  

•

DMD, BMD 

•

choroba Alzheimera, Parkinsona  

•

dziedziczna skłonność miażdżycowa 
 

 
DIAGNOSTYKA NIEPŁODNOŚCI MĘSKIEJ O PODŁOŻU GENETYCZNYM 
•

(brak plemników w nasieniu - mikrodelecje na chromosomie Y) 
 

 
USTALANIE POKREWIEŃSTWA I OJCOSTWA 
 
KRYMINALISTYKA 

 

 
BADANIE ŻYWNOŚCI W KIERUNKU MODYFIKACJI GENETYCZNEJ GMO  
•

(kukurydza, soja, zboża, pomidory, ziemniaki) - analiza jakościowa i ilościowa 
 

BADANIA MIKROBIOLOGICZNE ŻYWNOŚCI 
•

(Staphylococcus aureus, Salmonella species, Shigella species, Listeria species) 
 

BADANIA NAUKOWE 
•

(biologia molekularna, biotechnologia, badania ewolucyjne, antropologia, badania środowiskowe) 
 

Sekwencjonowanie 

Metoda wykorzystywana do : 
• wykrywania nowych mutacji 
• diagnostyki gatunków niedostatecznie poznanych, nowych 

szczepów 
 
 

-

DNA w postaci czystej (np. plazmidy zawierające klony) 

-

Polimeraza klonuje ssDNA 

-

4 reakcje – każda z innym ddNTP 

-

Rozdzielenie różnej długości fragmentów DNA na żelu 

Sekwencjonowanie - metoda Sangera 

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych 

• Elektroforeza 
• Utrwalenie badanej próby na podłożu (membrana) 
• Zablokowanie niezwiązanych miejsc 
• Inkubacja z sondą 
• Odpłukanie niezwiązanych cząsteczek 
• Wywołanie -  uwidocznienie miejsc powiązania sondy  
  z badaną próbą  

Southern blotting Hybrydyzacja DNA 

 

Nothern blotting Hybrydyzacja RNA  

 

Western blotting Hybrydyzacja białka