plik

PCR

Polimerase

Polimerase Chain

Chain

Reaction

UmoŜliwia powielanie określonego fragmentu DNA

Dzięki tej metodzie otrzymujemy szybko duŜe ilości
powielonego DNA

Zasady PCR:

Denaturacja

–

rozdzielenia nici DNA (94 st. C)

Przy

łą

czenie starter

do komplementarnych

miejsc na matrycy (~50 st. C)

Wyd

anie

nici potomnych

od ko

ca 3

’

startera

Kolejne cykle powtarzane są wg. tego samego
schematu. Zwykle zachodzi ok. 35 cykli, czyli
ilość otrzymanych cząsteczek wynosi 2

5‘- - -T

CGA- - -3'

3'- - -AGC

T- - -5'

5‘ TCGA

3‘ AGCT

Thermus
aquaticus

TaqI

5'- - -A

AGCTT- - -3'

3'- - -TTCGA

A- - -5'

5‘ AAGCTT

3‘ TTCGAA

Haemophilus
influenzae

HindIII

5'- - -

GATC- - -3'

3'- - -CTAG

- - -5'

5‘ GATC

3‘ CTAG

Staphylococcus
aureus

Sau3A

5'- - -G

AATTC- - -3'

3'- - -CTTAA

G- - -5'

5‘ GAATTC

3‘ CTTAAG

Escherichia coli

EcoRI

cie

Rozpoznawana

sekwencja

Pochodzenie

Enzym

Przykłady enzymów

W czasie elektroforezy cząsteczki DNA przemieszczają

się w Ŝelu pod wp

ywem przy

oŜonego napięcia

elektrycznego. Dodatnio na

adowane cząsteczki

wędrują w kierunku elektrody ujemnej. śel jest siecią

porów, przez które przeciskają się badane cząsteczki.

Im cząsteczka krótsza, tym szybciej przemieszcza się,

a w efekcie przebywa najd

uŜszy odcinek. Cząsteczki

tej samej d

ugości zajmują to samo miejsce w Ŝelu,

tworząc prąŜek, który moŜemy uwidocznić pod

ywem promieni UV stosując związek fluoryzujący,

wnikający pomiędzy pary zasad DNA.

Jest to technika analizy cząsteczek Dna. UmoŜliwia ona

identyfikację określonej sekwencji DNA spośród tysięcy innych

cząsteczek DNA.

Etap pierwszy - poci

cie genomowego DNA przy udziale enzymów

restrykcyjnych.

Etap drugi - rozdzielanie uzyskanych fragmentów (w zale

ci od wielko

ci)

elu agarozowym.

Etap trzeci – przeprowadzenie denaturacji w

elu poprzez zanurzenie go w

roztworze alkalicznym, w celu uzyskania jednoniciowych fragmentów (zdolnych
do pó

niejszej hybrydyzacji)

Etap czwarty – przeniesienie fragmentów DNA na wi

ąŜą

cy je filtr

nitrocelulozowy lub nylonowy, a nast

pnie umieszczenie go w biorze

zawieraj

cym wyznakowan

radioaktywnie sond

. Hybrydyzuje ona z

komplementarn

sekwencj

Etap pi

ty – usuni

cie nadmiaru sondy, po czym metod

autoradiograficzn

wykrywa si

zwi

zane z sond

steczki NA.

W podobny sposób mo

na bada

steczki RNA. Metoda ta nazywana

jest Northern blot.

RFLP

(

ang. Restriction Fragments

Length Polymorphism-

polimorfizm

ugo

ci fragment

w restrykcyjnych

w restrykcyjnych.)

W metodzie tej wykorzystujemy enzymy
restrykcyjne.
Je

eli w obr

bie rozpoznawanej przez enzym

sekwencji wyst

pi mutacja punktowa miejsce

to nie b

dzie rozpoznawane przez enzym i nie

nast

pi przeci

cie.

RFLP jest wykorzystywany w technice, w której
organizmy mog

ró

nicowane poprzez analiz

wzorów pochodz

cych z poci

cia ich DNA.

Jest to metoda, która pozwala na wykazanie
powi

rodzinnych poprzez porównywanie

charakterystycznych wzorów polimorficznych, które
s

otrzymywane, gdy okre

lone regiony ła

cucha

DNA s

powielane i poci

te przez okre

lone enzymy

restrykcyjne.
Porównanie fragmentów restrykcyjnych matki,
dziecka i domniemanego ojca pozwala tak

e na

potwierdzenie lub wykluczenie ojcostwa.

Przy pomocy tej metody mo

na odró

allel

prawidłowy od zmutowanego, np. w anemii
sierpowatej.
Anemia sierpowata spowodowana jest
mutacj

punktow

polegaj

na zmianie

adeniny w tymin

. Zmiana ta zachodzi w

obr

bie sekwencji rozpoznawanej przez

enzym restrykcyjny o nazwie MST II. W
prawidłowej, normalnej sekwencji wyst

puj

trzy miejsca ci

cia, mutacja natomiast

powoduje utrat

jednego miejsca ci

cia.

Metoda ta pozwala na wykrycie nawet niewielkich
ró

nic w badanych sekwencjach. Umo

liwia

wykrycie pojedynczej mutacji.

Sekwencja DNA, w której zamierzamy bada

okre

lon

mutacj

, amplifikowana jest przy

pomocy metody PCR. Nast

pnie wykonuje si

hybrydyzacj

badanego odcinka DNA z krótkimi,

najcz

ęś

ciej sztucznie zsyntetyzowanymi sondami

DNA, które s

komplementarne do sekwencji

prawidłowej i zmutowanej. Zmiana nawet
pojedynczego nukleotydu powoduje brak
hybrydyzacji.